Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

De studie werd gesteund door het Italiaanse kanker genoom project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana ricerca cancro (AIRC; Grant No. 12182 tot en met 18178 tot en met VC), KP7-subsidie van de Europese Gemeenschap (CAM-Pac nr. 602783 tot AS). De financierings bureaus hadden geen rol bij het verzamelen, analyseren en interpreteren van gegevens of bij het schrijven van het manuscript.

Het materiaal dat in de studie werd gebruikt, werd verzameld onder een specifiek protocol, dat door de lokale ethische commissie werd goedgekeurd. Schriftelijke geïnformeerde toestemming van alle patiënten was beschikbaar.
1. histologische en immunofenotypische herziening van weefsel specimens
Opmerking: een deskundige patholoog is verantwoordelijk voor de hierna beschreven activiteiten.
<ol><li>Histopathologische herziening van geselecteerde gevallen volgens ge...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Onze methode maakt de identificatie mogelijk van moleculaire veranderingen die betrokken zijn bij de progressie van vaste tumoren door integratie van verticale gegevens (d.w.z. morfologie, DNA-sequencing en immunohistochemie) van verschillende laesies van een bepaalde patiënt. We toonden het vermogen van onze methode voor het opsporen van klonale en subklonale gebeurtenissen in een mutatie Silent tumor type (dat wil zeggen, SPN, Solid-pseudopapillaire neoplasma van de alvleesklier) door het ondervragen van de codeer seq...

De opkomst van Next generation sequencing (NGS) heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop kanker wordt gediagnosticeerd en behandeld1. NGS gekoppeld aan multiregionale sequencing hebben blootgesteld een hoge mate van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) in vaste tumoren2, die verklaart deels het falen van gerichte therapie als gevolg van de aanwezigheid van subklonen met verschillende geneesmiddel gevoeligheid2 . Een belangrijke uitdaging van genoom-brede sequentie studies is de noodzaak om onderscheid te maken tussen passagier (d.w.z. neutraal) en bestuurders mutaties in individuele kankers3. Verschillende studies hebben inderdaad aangetoond dat, in bepaalde tumoren, passagiers mutaties rekening voor de meerderheid van ITH, terwijl de wijzigingen van de bestuurder neiging om te worden bewaard tussen laesies van dezelfde persoon4. Het is ook belangrijk op te merken dat grote mutationele last (zoals te zien in longkanker en melanoom) niet noodzakelijkerwijs een grote subklonale mutationele last2impliceert. Daarom kan een hoge mate van ITH worden gevonden in tumoren met een lage mutationele Last.
Metastasen zijn verantwoordelijk voor meer dan 90% van de kanker-gerelateerde dood wereldwijd5; Daarom is het vastleggen van de mutationele heterogeniteit van de bestuurders genen bij primaire en gemetastaseerde laesies van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve therapieën voor gevorderde-fase ziekten. Klinische sequentie wordt over het algemeen uitgevoerd op nucleïnezuren uit vaste weefsels, waardoor genoom verkenning moeilijk is vanwege de slechte DNA-kwaliteit. Aan de andere kant is de intentie van klinische sequencing om bruikbare mutaties en/of mutaties te identificeren die de responsiviteit/onresponsiviteit op een bepaald therapeutisch regime kunnen voorspellen. In de huidige stand kan sequentiëren worden beperkt tot een kleinere fractie van het genoom voortijdige extractie van klinisch relevante informatie. De overgang van DNA-profilering met een lage doorvoer (bijvoorbeeld Sanger-sequencing) naar NGS heeft het mogelijk gemaakt om honderden kankerrelevante genen te analyseren op een hoge dekkingsgraad, waardoor de detectie van subklonale gebeurtenissen mogelijk is. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde persoon mogelijk maakt. De hier beschreven methode integreert drie gevestigde benaderingen (histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing en immunophenotypic analyses) om functionele gevolgen van de geïdentificeerde variaties te voorspellen. De aanpak wordt schematisch beschreven in Figuur 1 en is toegepast op de studie van 5 gemetastaseerde gevallen van vaste pseudopapillaire Neoplasmata (spn's) van de alvleesklier. Terwijl we de verwerking en analyse beschrijven van formalin-vaste paraffine-ingesloten (FFPE) weefsel specimens, kan dezelfde procedure worden toegepast op genetisch materiaal uit vers bevroren weefsel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Beoordeling van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) is van het allergrootste belang om te anticiperen op falen van gerichte therapieën en het ontwerp dienovereenkomstig effectieve anti-tumor strategieën. Hoewel bezorgdheid vaak wordt opgeworpen als gevolg van verschillen in monsterverwerking en diepte van dekking, de volgende generatie sequencing van solide tumoren hebben ontrafeld een zeer variabele mate van ITH over tumortypen. Het vastleggen van de genetische verwantschap tussen primaire en gemetastaseerde laesies door de identificatie van klonale en subklonale populaties is van cruciaal belang voor het ontwerp van therapieën voor aandoeningen aan de voor fase. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde patiënt mogelijk maakt. De hier beschreven experimentele aanpak integreert drie gevestigde benaderingen: histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing, en immunophenotypic analyses. Om de effecten op de detectie van subklonale gebeurtenissen te minimaliseren door ongepaste monsterverwerking, hebben we weefsels onderworpen aan zorgvuldig pathologisch onderzoek en neoplastische celverrijking. Op kwaliteit gecontroleerd DNA van neoplastische laesies en normale weefsels werd vervolgens onderworpen aan een hoge dekkings volgorde, gericht op de codeer gebieden van 409 relevante kanker genen. Terwijl we alleen naar een beperkte genomische ruimte kijken, maakt onze aanpak het mogelijk om de mate van heterogeniteit te evalueren bij somatische veranderingen (single-nucleotide mutaties en Copy-Number variaties) in verschillende laesies van een bepaalde patiënt. Door middel van vergelijkende analyse van sequentie gegevens konden we klonale versus subklonale wijzigingen onderscheiden. De meerderheid van ITH wordt vaak toegeschreven aan passagiers mutaties; Daarom gebruikten we ook immunohistochemie om functionele gevolgen van mutaties te voorspellen. Hoewel dit protocol is toegepast op een specifiek tumor type, verwachten we dat de hier beschreven methodologie algemeen toepasbaar is op andere vaste tumortypen.

De studie werkstroom wordt geïllustreerd in Figuur 1. Multi-laesies (n = 13) de sequencing van 5 SPN-gevallen gericht op de coderings sequenties van 409 kanker gerelateerde genen identificeerden in totaal 27 somatische mutaties in 8 genen (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1en FGFR3). Mutaties werden gedefinieerd als oprichter/clonal wanneer ze werden gedeeld door alle laesies van een bepaalde patiënt, en prog...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.

Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Ons protocol maakt het vastleggen van de genetische verwantheid tussen primaire en gemetastaseerdlaesies mogelijk door de identificatie van moleculaire veranderingen die betrokken zijn bij ziekteprogressie. Onze methode biedt de mogelijkheid om genetische verwantschap in klinisch monster met een hoge gevoeligheid en specificiteit te verkennen. Dit is te wijten aan de integratie van moleculaire en histopathologische analyse.De beoordeling van intratumor heterogeniteit in het kankeronderzoek is van het grootste belang bij het ontwerpen van effectieve anti-tumor strategieën en onze methode is breed toepasbaar op vele vaste tumortypes. Verdun elke bibliotheek na het voorbereiden en kwantificeren van de bezienswaardigheden tot een concentratie van 100 picomolar in nucleasevrij water en combineer 10 microliters van elke verdunde bibliotheek voor één enkele run in één buis. Meng vervolgens de gepoolde bibliotheken door pipetting.Als u een sequencing-run wilt starten, opent u eerst de Torrent-browser op een computer die is aangesloten op het sequencing-systeem. Plan een nieuwe run met behulp van de generieke sjabloon voor de geselecteerde toepassing en selecteer onder het tabblad kits het Ion Proton-systeem of het Ion Gene Studio S5-systeem. Selecteer de juiste chip in het vervolgkeuzemenu van het chiptype en selecteer Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit in de vervolgkeuzelijst bibliotheekkit.Selecteer de knop Ion Chef voor de sjabloonkit en selecteer de juiste Chef Kit in de vervolgkeuzelijst van de sjabloonkit. Selecteer de juiste sequencing kit in het vervolgkeuzemenu sequencing kit en selecteer Ion Express in de vervolgkeuzelijst barcodeset. Selecteer onder het tabblad plugin de plug-in voor dekkingsanalyse.Selecteer onder het tabblad Plannen het GRCH37HG19-genoom in de vervolgkeuzelijst van de referentiebibliotheek. Selecteer in de vervolgkeuzelijst doelregio's het juiste deelvenster dat moet worden gesequenced. Stel vervolgens het aantal streepjescodes in dat moet worden gesequenced en stel de naam en voorbeeldnaam voor elke bibliotheek in.Voor een gepoolde bibliotheken verdunning, verdun de voorraad bibliotheek met nuclease-vrij water tot een 25 picomolar concentratie voor een ion proton chip en pipet 50 microliters van elke verdunde bibliotheek naar de bodem van de juiste bibliotheek monster buis. Laad monsterbuizen met de samengevoegde verdunde bibliotheken op het bibliotheekvoorbereidingssysteem en start de kloonversterking. Volg voor de volgende generatie sequencing de instructies op het scherm om het instrument te initialiseren.Wanneer de kloonversterking is voltooid, opent u de ionchef-instrumentdeur en opent u het deksel van de centrifuge van de chiplading en verwijdert u de twee chips uit het voorbereidingssysteem van de bibliotheek. Plaats de chips in aparte chipopslagcontainers en laad een van de spanen in het chipcompartiment in het instrument. Sluit vervolgens het deksel van het chipcompartiment en start de volgorde.Open voor mutatieanalyse de dekkingsanalyse plugin en gebruik de dekkingsanalyse-output om de diepte van de dekking en uniformiteit te verifiëren. Gebruik de Torrent Variant Caller-plug-in om de variant uit te voeren waarin de kiemlijn of somatische workflow wordt geselecteerd. Download vervolgens gefilterde varianten variant call format bestanden en gebruik maken van de variant effect voorspeller software in de NCBI RefSeq database om de varianten annoteren.Om de variaties van het kopieernummer te schatten, gebruikt u de ion reporter-uploader-plug-in om de sequencing-gegevens in de ionenverslaggeversoftware te laden en de uitgebreide normale pairworkflow van het kankerpaneel te gebruiken om de gegevens te analyseren. Filter handmatig de mutaties en copy-number variaties op basis van de scores die door de software zijn toegewezen en controleer de variaties visueel met de Integrative Genomics Viewer. Inspecteer vervolgens visueel de uitlijning op ongebruikelijke reads die artefactuele oproepen kunnen genereren en inspecteer de genormaliseerde dekking voor alle amplicons in een bepaald gen tegen de genormaliseerde dekking van de basislijn om de variaties van het kopienummer te verifiëren.Index voor elk geval de mutatieoproepen van de volgorde van normaal weefsel of bloed of primaire tumor of metastase. Vlag als kiembaan en teruggooi oproepen die ook blijken uit de volgorde gegevens van kiembaan DNA. Vlag als kloon of stichter de mutaties die worden gedeeld tussen alle laesies van een bepaalde patiënt.Vlag dan als subklonale of progressor de mutaties die worden gedetecteerd in sommige, maar niet alle laesies van een bepaalde patiënt. In dit representatieve experiment identificeerden multi-laesiessequentie van vijf vaste pseudopapillary neoplasma-gevallen gericht op de coderingssequenties van 409 kankergerelateerde genen in totaal 27 somatische mutaties in acht genen. Mutaties werden gedefinieerd als stichter of kloon wanneer gedeeld tussen alle laesies van een bepaalde patiënt en progressor of subklonale wanneer gedetecteerd in sommige, maar niet alle laesies van een bepaalde patiënt.Immunohistochemische kleuring voor bèta-catenine en KMD6A was constant homogeen onder de diverse laesies van gevallen met mutaties van de overeenkomstige genen. De matige kleuring voor KMD6A in gemuteerde exemplaren suggereren dat genetische verandering waarschijnlijk de functie zal veranderen in plaats van de expressie van het eiwit. KMD6A verlies van functie bij alvleeskliertumoren wordt geassocieerd met up regulatie van de hypoxie marker GLUT-1.En dienovereenkomstig was GLUT-1 meer dan uitgedrukt in gevallen met KMD6A-mutaties. Immunohistochemie voor BAP1 en TP53 bevestigde dat mutaties in die genen subklonal waren. In dit virtuele karyotype van een representatief geval met de locatie, nabijheid en kopie-nummer status van veranderde genen, de kopie-nummer variatie analyse met behulp van sequencing gegevens bleek veranderingen in alle geanalyseerde monsters.En in tegenstelling tot puntmutaties, waren de meeste variatiewijzigingen van het aantal exemplaren subklonale. Validatie en indexering van mutaties en variatie van het kopieernummer en het gebruik van de tumor normale DNA-vergelijking zijn belangrijk voor het vermijden van het genereren van artefactuele oproepen die de resultaten kunnen ongeldig maken. Deze procedure kan ook worden toegepast op hele genoomsequencingstudies gericht op het ondervragen van het gehele genoom voor de identificatie van mutatie tussen laesie van verschillende vaste tumortypen.In het gebied van kankeronderzoek zijn deze technieken essentiële instrumenten om de biologie van ziekten met belangrijke klinische implicaties te begrijpen die gericht zijn op het ontwerpen van gepersonaliseerde en effectieve gerichte therapieën.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Contextuele en cued Fear Conditioning Test Met behulp van een video analysesysteem in Muizen

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Meting van Fronto-limbische activiteit met een emotionele Excentrieke Task bij kinderen met Familial hoog risico op schizofrenie

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimentele Evaluatie van de muis Gezelligheid behulp van een geautomatiseerd Beeldverwerking Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Pavlov geconditioneerde Aanpak Training in Ratten

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protocol voor gegevensverzameling en analyse Toegepast op Automated Gezichtsuitdrukking Analysis Technology and Temporal Analysis voor de sensorische evaluatie

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Gedragsstoornissen: een innovatieve benadering van de modulerende effecten van een Nutraceutical Diet Monitor

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Behandeling van artrose van de enkel met totale enkelvervanging door middel van een laterale aanpak van de Transfibular

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Gebruik van een draadloze video-EEG-systeem te controleren epileptiform lozingen na laterale vloeistof-percussie geïnduceerde traumatisch hersenletsel

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

Een machine learning-benadering voor het ontwerpen van een efficiënte selectieve screening van milde cognitieve stoornissen

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Het evalueren van geschoolde Prehension bij muizen met behulp van een auto-trainer

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...