Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
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L'étude a été soutenue par le projet italien de génome du cancer (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Subvention no 12182 à AS et 18178 à VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 à AS). Les organismes de financement n'ont joué aucun rôle dans la collecte, l'analyse et l'interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.

Le matériel utilisé dans l'étude a été recueilli en vertu d'un protocole spécifique, qui a été approuvé par le comité d'éthique local. Le consentement éclairé écrit de tous les patients était disponible.
1. Révision histologique et immunophénotypique des spécimens de tissus
REMARQUE : Un pathologiste expert est responsable des activités décrites ci-après.
<ol><li>Révision histopathologique des cas choisis selon des critères diagnostiques bie...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Notre méthode permet l'identification des altérations moléculaires impliquées dans la progression des tumeurs solides par l'intégration des données verticales (c.-à-d., morphologie, séquençage d'ADN, et immunohistochimie) des lésions distinctes d'un patient donné. Nous avons démontré la capacité de notre méthode pour détecter des événements clonal et subclonal dans un type de tumeur silencieuse mutationnelle (c.-à-d., SPN, néoplasme solide-pseudopapillary du pancréas) en interrogeant les séquences d...

L'avènement du séquençage de nouvelle génération (NGS) a révolutionné la façon dont les cancers sont diagnostiqués et traités1. NGS couplé au séquençage multirégional ont exposé un degré élevé d'hétérogénéité intra-tumorale (ITH) dans les tumeurs solides2, ce qui explique en partie l'échec de la thérapie ciblée due à la présence de sous-clones avec une sensibilité médicamenteuse différente2 . Un défi important posé par les études de séquençage à l'échelle du génome est la nécessité de faire la distinction entre les mutations des passagers (c.-à-d. neutres) et des mutations du conducteur dans les cancers individuels3. Plusieurs études ont en effet montré que, dans certaines tumeurs, les mutations des passagers représentent la majorité de l'ITH, tandis que les altérations du conducteur ont tendance à être conservées parmi les lésions du même individu4. Il est également important de noter que la charge mutationnelle importante (comme on le voit dans les cancers du poumon et le mélanome) n'implique pas nécessairement un grand fardeau mutationnel subclonal2. Par conséquent, un degré élevé d'ITH peut être trouvé dans les tumeurs avec le bas fardeau mutationnel.
Les métastases sont responsables de plus de 90 % des décès liés au cancer dans le monde5; par conséquent, la capture de l'hétérogénéité mutationnelle des gènes de conducteur parmi les lésions primaires et métastatiques est essentielle à la conception des thérapies efficaces pour les maladies de stade avancé. Le séquençage clinique est généralement effectué sur les acides nucléiques des tissus fixes, ce qui rend l'exploration à l'échelle du génome difficile en raison de la mauvaise qualité de l'ADN. D'autre part, l'intention du séquençage clinique est d'identifier les mutations actionnables et/ou les mutations qui pourraient prévoir la réactivité/insensibilité à un régime thérapeutique donné. Dans l'état actuel des choses, le séquençage peut être limité à une plus petite fraction du génome pour l'extraction en temps opportun d'informations cliniquement pertinentes. La transition du profilage de l'ADN à faible débit (p. ex., séquençage de sanger) à NGS a permis d'analyser des centaines de gènes cancer-pertinents à une profondeur élevée de couverture, ce qui permet la détection d'événements sous-clonaux. Ici, nous rapportons une méthode pour l'analyse comparative des lésions qui permet l'identification des populations clonales et subconales parmi différents spécimens d'un même individu. La méthode décrite ici intègre trois approches bien établies (analyse histologique, séquençage multilésion à haute couverture et analyses immunophénotypiques) pour prédire les conséquences fonctionnelles des variations identifiées. L'approche est décrite schématiquement dans la figure 1 et a été appliquée à l'étude de 5 cas métastatiques de néoplasmes pseudopapillaires solides (SPN) du pancréas. Tandis que nous décrivons le traitement et l'analyse des spécimens de tissu paraffins-incorporés formalin-fixes (FFPE), la même procédure peut être appliquée au matériel génétique du tissu fraîche-congelé.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

L'évaluation de l'hétérogénéité intratumorale (ITH) est d'une importance primordiale pour anticiper l'échec des thérapies ciblées et concevoir en conséquence des stratégies antitumorales efficaces. Bien que des soucis soient fréquemment soulevés en raison des différences dans le traitement d'échantillon et la profondeur de la couverture, le séquençage de prochaine génération des tumeurs pleines ont démêlé un degré fortement variable d'ITH à travers des types de tumeur. La capture de la parenté génétique entre les lésions primaires et métastatiques par l'identification des populations clonales et subconaux est essentielle à la conception de thérapies pour les maladies à un stade avancé. Ici, nous rapportons une méthode pour l'analyse comparative de lésions qui permet l'identification des populations clonales et subconales parmi différents spécimens du même patient. L'approche expérimentale décrite ici intègre trois approches bien établies : l'analyse histologique, le séquençage multilésion à haute couverture et les analyses immunophénotypiques. Afin de réduire au minimum les effets sur la détection des événements sous-clonal par le traitement inapproprié d'échantillon, nous avons soumis des tissus à l'examen pathologique soigneux et à l'enrichissement néoplastique de cellules. L'ADN contrôlé de qualité des lésions néoplastiques et des tissus normaux a alors été soumis au séquençage de couverture élevé, ciblant les régions codantes de 409 gènes de cancer pertinents. Tout en ne regardant qu'un espace génomique limité, notre approche permet d'évaluer l'étendue de l'hétérogénéité parmi les altérations somatiques (mutations mononucléotides et variations de nombre de copies) dans des lésions distinctes d'un patient donné. Grâce à l'analyse comparative des données de séquençage, nous avons pu distinguer les altérations clonales par rapport aux altérations subclonales. La majorité de l'ITH est souvent attribuée à des mutations de passagers; par conséquent, nous avons également employé l'immunohistochimie pour prévoir des conséquences fonctionnelles des mutations. Tandis que ce protocole a été appliqué à un type spécifique de tumeur, nous prévoyons que la méthodologie décrite ici est largement applicable à d'autres types de tumeur pleine.

Le flux de travail de l'étude est illustré à la figure 1. Multi-lésions (n - 13) séquençage de 5 cas SPN ciblant les séquences de codage de 409 gènes liés au cancer identifié un total de 27 mutations somatiques dans 8 gènes (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, et FGFR3). Les mutations ont été définies comme fondateur/clonal lorsqu'elles sont partagées entre toutes les lésions d'un patient donné...

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Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Cet article décrit une méthode pour identifier des altérations clonales et subclonales parmi différents spécimens d'un patient donné. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur un type spécifique de tumeur, l'approche est largement applicable à d'autres tumeurs pleines.

Analyse comparative des lésions par une approche de séquençage ciblée

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Notre protocole permet la capture de la relation génétique entre les lésions primaires et métastatiques par l’identification des altérations moléculaires impliquées dans la progression de la maladie. Notre méthode offre l’occasion d’explorer la relatedness génétique dans l’échantillon clinique avec la sensibilité et la spécificité élevées. Ceci est dû à l’intégration de l’analyse moléculaire et histopathologique.L’évaluation de l’hétérogénéité intratumorale dans le domaine de la recherche sur le cancer est d’une importance primordiale dans la conception de stratégies antitumorales efficaces et notre méthode est largement applicable à de nombreux types de tumeurs solides. Après avoir préparé et quantifié les bibliothèques d’intérêt, diluer chaque bibliothèque à une concentration de 100 picomolaires dans de l’eau sans nucléase et combiner 10 microlitres de chaque bibliothèque diluée pour une seule fois en un seul tube. Ensuite, mélanger les bibliothèques poolées par pipetting.Pour lancer une course de séquençage, ouvrez d’abord le navigateur Torrent sur un ordinateur connecté au système de séquençage. Planifiez une nouvelle série à l’aide du modèle générique pour l’application sélectionnée et sous l’onglet kits sélectionnez le système Ion Proton ou le système Ion Gene Studio S5. Sélectionnez la puce appropriée dans le menu dropdown de type puce et sélectionnez Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit à partir de la liste de dropdown de la trousse de bibliothèque.Sélectionnez le bouton Ion Chef pour le kit de modèle et sélectionnez le kit chef approprié à partir de la liste de dropdown du kit de modèle. Sélectionnez le kit de séquençage approprié dans le menu dropdown du kit de séquençage et sélectionnez Ion Express à partir de la liste de dropdown définie par code à barres. Sous l’onglet plugin, sélectionnez le plugin d’analyse de couverture.Sous l’onglet plan, sélectionnez le génome GRCH37HG19 de la liste de dropdown de la bibliothèque de référence. À partir de la liste de dropdown des régions cibles, sélectionnez le panneau approprié à séquencer. Réglez ensuite le nombre de codes à barres à séquencer et définissez le nom du code à barres et le nom de l’échantillon pour chaque bibliothèque.Pour une dilution des bibliothèques mise en commun, diluer la bibliothèque de stock avec de l’eau sans nucléase à une concentration de 25 picomolaires pour une puce de proton iion et pipette 50 microlitres de chaque bibliothèque diluée au fond du tube d’échantillon approprié de la bibliothèque. Chargez les tubes d’échantillon contenant les bibliothèques diluées poolées sur le système de préparation de la bibliothèque et démarrez l’amplification clonale. Pour le séquençage de prochaine génération, suivez les instructions à l’écran pour para parasénaliser l’instrument.Lorsque l’amplification clonale est terminée, ouvrez la porte de l’instrument Ion Chef, puis ouvrez le couvercle de la centrifugeuse de chargement des copeaux et retirez les deux puces du système de préparation de la bibliothèque. Placez les copeaux dans des contenants de rangement séparés et chargez l’un des copeaux dans le compartiment à copeaux de l’instrument. Fermez ensuite le couvercle du compartiment à copeaux et commencez le séquençage.Pour l’analyse des mutations, ouvrez le plugin d’analyse de couverture et utilisez la sortie d’analyse de couverture pour vérifier la profondeur de la couverture et l’uniformité. Utilisez le plugin Torrent Variant Caller pour effectuer la variante appelant en sélectionnant la lignée germinale ou le flux de travail somatique, le cas échéant. Téléchargez ensuite des variantes filtrées de fichiers de format d’appel variante et utilisez le logiciel prédicteur d’effet variante dans la base de données REFSeq NCBI pour annoter les variantes.Pour estimer les variations du nombre de copies, utilisez le plugin d’uploader ion reporter pour charger les données de séquençage dans le logiciel de reporter iion et utiliser le flux de travail complet de la paire normale de tumeurs du panneau de cancer pour analyser les données. Filtrez manuellement les mutations et les variations de numéro de copie en fonction des scores attribués par le logiciel et vérifiez visuellement les variations avec la visionneuse génomique intégrative. Inspectez ensuite visuellement l’alignement pour décelez les lectures inhabituelles qui peuvent générer des appels artefacts et inspectez la couverture normalisée de tous les amplicons d’un gène donné par rapport à la couverture normalisée de la ligne de base pour vérifier les variations du nombre de copies.Pour chaque cas, indexer les appels de mutation du séquençage du tissu normal ou du sang ou de la tumeur primaire ou de la métastase. Signaler comme ligne germinale et rejeter les appels qui sont également évidents à partir des données de séquençage de l’ADN de la lignée germinale. Marquer comme clonal ou fondateur les mutations qui sont partagées entre toutes les lésions d’un patient donné.Puis signaler comme sous-clonal ou progresseur les mutations qui sont détectées dans certaines, mais pas toutes les lésions d’un patient donné. Dans cette expérience représentative, le séquençage multi-lésion de cinq cas pseudopapillary solides de néoplasme ciblant les séquences de codage de 409 gènes cancer-connexes a identifié un total de 27 mutations somatiques dans huit gènes. Les mutations ont été définies comme fondatrices ou clonales lorsqu’elles sont partagées entre toutes les lésions d’un patient donné et d’un progresseur ou d’un sous-continent lorsqu’elles sont détectées dans certaines lésions, mais pas toutes, d’un patient donné.Uniformément, la coloration immunohistochemical pour le bêta-caténine et KMD6A était homogène parmi les lésions diverses des cas avec des mutations des gènes correspondants. La coloration modérée de KMD6A chez les spécimens mutés suggère que l’altération génétique est susceptible de modifier la fonction plutôt que l’expression de la protéine. La perte de fonction kmd6A dans les tumeurs pancréatiques est associée à la régulation vers le haut du marqueur d’hypoxie GLUT-1.Et en conséquence, GLUT-1 a été sur-exprimé dans les cas portant des mutations KMD6A. L’immunohistochimie pour BAP1 et TP53 a confirmé que les mutations dans ces gènes étaient subclonales. Dans ce karyotype virtuel d’un cas représentatif montrant l’emplacement, la proximité et l’état du numéro de copie des gènes modifiés, l’analyse de variation du nombre de copies à l’aide de données de séquençage a révélé des altérations dans tous les spécimens analysés.Et contrairement aux mutations ponctuelles, la majorité des modifications de variation de copie-nombre étaient sous-clonales. La validation et l’indexation des mutations et la variation de copie-nombre et utilisant la comparaison normale d’ADN de tumeur sont importantes pour éviter la génération des appels artifactual qui pourraient invalider les résultats. Cette procédure pourrait également être appliquée à des études de séquençage du génome entier visant à interroger l’ensemble du génome pour l’identification de la mutation entre la lésion de différents types de tumeurs solides.Dans le domaine de la recherche sur le cancer, ces techniques sont des outils essentiels pour comprendre la biologie des maladies ayant d’importantes implications cliniques visant à concevoir des thérapies ciblées personnalisées et efficaces.

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We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Troubles du comportement: Une approche innovatrice pour surveiller les effets modulateurs d&#39;une alimentation nutraceutique

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Traitement de l’arthrose de la cheville avec remplacement Total de cheville grâce à une approche latérale de la Transfibular

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Utilisation d'un système vidéo-EEG sans fil pour surveiller les décharges épileptiformes à la suite d'une lésion cérébrale traumatique induite par le fluide latéral

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

Une approche d'apprentissage automatique pour concevoir un dépistage sélectif efficace de l'affaiblissement cognitif léger

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Évaluer la préhension des personnes qualifiées chez les souris à l'aide d'un auto-formateur

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...