Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
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Die Studie wurde vom italienischen Cancer Genome Project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Zuschuss Nr. 12182 an AS und 18178 an VC), RP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 to AS). Die Förderorganisationen spielten weder bei der Erhebung, Analyse und Interpretation von Daten noch beim Schreiben des Manuskripts eine Rolle.

Das in der Studie verwendete Material wurde im Rahmen eines spezifischen Protokolls gesammelt, das von der lokalen Ethikkommission genehmigt wurde. Schriftliche Informierte Einwilligung aller Patienten lag vor.
1. Histologische und immunphenotypische Revision von Gewebeproben
HINWEIS: Ein erfahrener Pathologe ist für die im Folgenden beschriebenen Aktivitäten verantwortlich.
<ol><li>Histopathologische Revision ausgewählter Fälle nach etablierten diagnostischen...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Unsere Methode ermöglicht die Identifizierung molekularer Veränderungen, die an der Progression solider Tumoren beteiligt sind, durch die Integration vertikaler Daten (d. h. Morphologie, DNA-Sequenzierung und Immunhistochemie) aus unterschiedlichen Läsionen eines bestimmten Patienten. Wir demonstrierten die Fähigkeit unserer Methode, klonale und subklonale Ereignisse in einem mutationsstillen Tumortyp (d.h. SPN, fest-pseudopapillares Neoplasma der Bauchspeicheldrüse) zu erkennen, indem wir die Kodierungssequenzen vo...

Das Aufkommen der Next Generation Sequenzierung (NGS) hat die Art und Weise, wie Krebs diagnostiziert undbehandelt1 revolutioniert. NGS gekoppelt mit multiregionaler Sequenzierung haben einen hohen Grad an intratumoraler Heterogenität (ITH) bei soliden Tumorenexponiert 2, was zum Teil das Versagen einer gezielten Therapie aufgrund des Vorhandenseins von Subklonen mit unterschiedlicher Arzneimittelempfindlichkeit erklärt2 . Eine wichtige Herausforderung, die sich aus genomweiten Sequenzierungsstudien stellt, ist die Notwendigkeit, zwischen Fahrgastmutationen (d. h. neutral) und Treibermutationen bei einzelnen Krebsarten zu unterscheiden3. Mehrere Studien haben in der Tat gezeigt, dass bei bestimmten Tumoren, Passagiermutationen machen die Mehrheit der ITH, während Fahrerveränderungen neigen dazu, unter Läsionen der gleichen person /4konserviert werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass große Mutationsbelastung (wie bei Lungenkrebs und Melanom gesehen) nicht notwendigerweise eine große subklonale Mutationsbelastung impliziert2. Daher kann ein hohes ITH-Niveau in Tumoren mit geringer Mutationsbelastung gefunden werden.
Metastasen sind für mehr als 90% der krebsbedingten Todesfälle weltweit verantwortlich5; Daher ist die Erfassung der mutationalen Heterogenität von Treibergenen zwischen primären und metastasierenden Läsionen entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien für Krankheiten im fortgeschrittenen Stadium. Die klinische Sequenzierung wird in der Regel an Nukleinsäuren aus festem Gewebe durchgeführt, was die genomweite Erforschung aufgrund schlechter DNA-Qualität erschwert. Auf der anderen Seite besteht die Absicht der klinischen Sequenzierung darin, umsetzbare Mutationen und/oder Mutationen zu identifizieren, die die Reaktionsfähigkeit/Nichtreaktion auf ein bestimmtes therapeutisches Regime vorhersagen könnten. Nach dem jetzigen Stand kann die Sequenzierung auf einen kleineren Bruchteil des Genoms beschränkt werden, um klinisch relevante Informationen rechtzeitig zu extrahieren. Der Übergang von DNA-Profilen mit niedrigem Durchsatz (z. B. Sanger Sequencing) zu NGS hat es ermöglicht, Hunderte von krebsrelevanten Genen in einer hohen Tiefe der Abdeckung zu analysieren, was den Nachweis subklonaler Ereignisse ermöglicht. Hier berichten wir über eine Methode zur vergleichenden Läsionenanalyse, die die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen zwischen verschiedenen Proben desselben Individuums ermöglicht. Die hier beschriebene Methode integriert drei etablierte Ansätze (histologische Analyse, hochbedeckungsübergreifende Multi-Lesion-Sequenzierung und immuntypische Analysen), um die funktionellen Folgen der identifizierten Variationen vorherzusagen. Der Ansatz ist schematisch in Abbildung 1 beschrieben und wurde auf die Untersuchung von 5 metastasierenden Fällen von festen pseudopapillaren Neoplasmen (SPNs) der Bauchspeicheldrüse angewendet. Während wir die Verarbeitung und Analyse von formal fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben beschreiben, kann das gleiche Verfahren auf genetisches Material aus frisch gefrorenem Gewebe angewendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Die Beurteilung der intratumoralen Heterogenität (ITH) ist von größter Bedeutung, um das Scheitern gezielter Therapien zu antizipieren und entsprechend wirksame Anti-Tumor-Strategien zu entwickeln. Obwohl aufgrund von Unterschieden in der Probenverarbeitung und der Tiefe der Abdeckung häufig Bedenken geäußert werden, hat die Sequenzierung solider Tumoren der nächsten Generation einen sehr variablen ITH-Grad über Tumortypen hinweg entwirrt. Die Erfassung der genetischen Verwandtheit zwischen primären und metastasierenden Läsionen durch die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien für Krankheiten im Vorstadium. Hier berichten wir über eine Methode zur vergleichenden Läsionenanalyse, die die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen zwischen verschiedenen Proben desselben Patienten ermöglicht. Der hier beschriebene experimentelle Ansatz integriert drei etablierte Ansätze: histologische Analysen, hochbedeckungsübergreifende Multi-Lesion-Sequenzierung und immuntypische Analysen. Um die Auswirkungen auf den Nachweis subklonaler Ereignisse durch unsachgemäße Probenverarbeitung zu minimieren, haben wir Gewebe einer sorgfältigen pathologischen Untersuchung und neoplastischen Zellanreicherung unterzogen. Qualitätskontrollierte DNA aus neoplastischen Läsionen und normalen Geweben wurde dann einer hohen Abdeckungssequenzierung unterzogen, die auf die Kodierungsregionen von 409 relevanten Krebsgenen abzielte. Während wir nur einen begrenzten genomischen Raum betrachten, ermöglicht unser Ansatz die Bewertung des Ausmaßes der Heterogenität zwischen somatischen Veränderungen (Einzelnukleotidmutationen und Kopien-Anzahl-Variationen) in unterschiedlichen Läsionen eines bestimmten Patienten. Durch die vergleichende Analyse von Sequenzierungsdaten konnten wir klonale und subklonale Veränderungen unterscheiden. Die Mehrheit der ITH wird oft auf Passagiermutationen zugeschrieben; Daher haben wir auch die Immunhistochemie verwendet, um funktionelle Folgen von Mutationen vorherzusagen. Obwohl dieses Protokoll auf einen bestimmten Tumortyp angewendet wurde, gehen wir davon aus, dass die hier beschriebene Methodik im Großen und Ganzen auf andere solide Tumortypen anwendbar ist.

Der Studienworkflow ist in Abbildung 1dargestellt. Multiläsionen (n = 13) Sequenzierung von 5 SPN-Fällen, die auf die Kodierungssequenzen von 409 krebsbedingten Genen abzielen, identifizierten insgesamt 27 somatische Mutationen in 8 Genen (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1und FGFR3). Mutationen wurden als Gründer/Klonal definiert, wenn sie unter allen Läsionen eines bestimmten Patienten geteilt wurden, und...

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Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Unser Protokoll ermöglicht die Erfassung der genetischen Verwandtheit zwischen primären und metastasierenden Läsionen durch die Identifizierung molekularer Veränderungen, die an der Krankheitsprogression beteiligt sind. Unsere Methode bietet die Möglichkeit, genetische Verwandtschaft in klinischen Proben mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu erforschen. Dies ist auf die Integration molekularer und histopathologischer Analysen zurückzuführen.Die Beurteilung der Intratumorheterogenität im Bereich der Krebsforschung ist bei der Entwicklung wirksamer Anti-Tumor-Strategien von größter Bedeutung und unsere Methode ist allgemein auf viele solide Tumortypen anwendbar. Nach der Vorbereitung und Quantifizierung der interessierten Bibliotheken, verdünnen Sie jede Bibliothek auf eine Konzentration von 100 Picomolar in nukleasefreiem Wasser und kombinieren Sie 10 Mikroliter jeder verdünnten Bibliothek für einen einzigen Durchlauf in einem einzigen Rohr. Mischen Sie dann die gepoolten Bibliotheken durch Pipettieren.Um eine Sequenzierungsausführung zu initiieren, öffnen Sie zuerst den Torrent-Browser auf einem Computer, der mit dem Sequenzierungssystem verbunden ist. Planen Sie eine neue Ausführung mit der generischen Vorlage für die ausgewählte Anwendung und wählen Sie unter der Registerkarte Kits Ion Proton System oder Ion Gene Studio S5 System aus. Wählen Sie den entsprechenden Chip aus dem Dropdown-Menü chip type aus und wählen Sie Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit aus der Dropdown-Liste des Bibliothekskits aus.Wählen Sie die Schaltfläche "Ion Chef" für das Vorlagenkit aus, und wählen Sie das entsprechende Chef Kit aus der Dropdown-Liste des Vorlagenkits aus. Wählen Sie das entsprechende Sequenzierungskit aus dem Dropdown-Menü des Sequenzierungskits aus, und wählen Sie Ion Express aus der Dropdown-Liste Barcode-Set aus. Wählen Sie unter der Registerkarte Plugin das Coverage-Analyse-Plugin aus.Wählen Sie unter der Registerkarte Plan das Genom GRCH37HG19 aus der Dropdown-Liste der Referenzbibliothek aus. Wählen Sie aus der Dropdown-Liste Zielregionen das entsprechende Bedienfeld aus, das sequenziert werden soll. Legen Sie dann die Anzahl der zu sequenzierenden Barcodes fest, und legen Sie den Barcodenamen und den Beispielnamen für jede Bibliothek fest.Für eine gepoolte Bibliothekverdünnung die Bestandsbibliothek mit nukleasefreiem Wasser auf eine Konzentration von 25 Picomolar für einen Ionenprotonenchip und eine Pipette 50 Mikroliter jeder verdünnten Bibliothek bis zum Boden des entsprechenden Bibliotheksprobenrohrs verdünnen. Laden Sie Probenröhrchen mit den gepoolten verdünnten Bibliotheken auf das Bibliotheksvorbereitungssystem und starten Sie die klonale Verstärkung. Befolgen Sie bei der Sequenzierung der nächsten Generation die Anweisungen auf dem Bildschirm, um das Instrument zu initialisieren.Wenn die klonale Verstärkung abgeschlossen ist, öffnen Sie die Ion Chef Instrumententür, öffnen Sie dann den Deckel der Spanladezentrifuge und entfernen Sie die beiden Chips aus dem Bibliotheksvorbereitungssystem. Legen Sie die Chips in separate Chip-Lagerbehälter und laden Sie einen der Chips in das Chipfach im Instrument. Schließen Sie dann den Spanfachdeckel und starten Sie die Sequenzierung.Öffnen Sie für die Mutationsanalyse das Coverage-Analyse-Plugin, und verwenden Sie die Ausgabe der Abdeckungsanalyse, um die Tiefe der Abdeckung und Homogenität zu überprüfen. Verwenden Sie das Torrent Variant Caller Plugin, um die Variante auszuführen, die die Keimbahn oder den somatischen Workflow entsprechend auswählt. Laden Sie dann gefilterte Varianten Variantenaufrufformatdateien herunter und verwenden Sie die Varianteneffektvorhersagesoftware in der NCBI RefSeq-Datenbank, um die Varianten zu kommentieren.Um die Variationen der Kopiernummer zu schätzen, verwenden Sie das Ion Reporter Uploader-Plugin, um die Sequenzierungsdaten in die Ion Reporter-Software zu laden und den umfassenden Workflow für Tumor-Tumor-Normale Paar für Krebsplatten zu verwenden, um die Daten zu analysieren. Filtern Sie die Mutationen und Kopiernummernvariationen manuell anhand der von der Software zugewiesenen Partituren und überprüfen Sie die Variationen visuell mit dem Integrativen Genomics Viewer. Überprüfen Sie dann visuell die Ausrichtung auf ungewöhnliche Lesevorgänge, die Artefaktaufrufe generieren können, und überprüfen Sie die normalisierte Abdeckung für alle Amplicons in einem bestimmten Gen mit der normalisierten Abdeckung der Baseline, um die Variationen der Kopiernummer zu überprüfen.In jedem Fall werden die Mutationsaufrufe aus der Sequenzierung von normalem Gewebe oder Blut oder Primärtumor oder Metastasierung indiziert. Flagge als Keimbahn und Wegwerfrufe, die auch aus den Sequenzierungsdaten der Keimbahn-DNA ersichtlich sind. Flagge als klonal oder Gründer der Mutationen, die unter allen Läsionen eines bestimmten Patienten geteilt werden.Dann Kennzeichnen Sie als subklonal oder progressor die Mutationen, die in einigen, aber nicht allen Läsionen eines bestimmten Patienten erkannt werden. In diesem repräsentativen Experiment identifizierte die Multi-Lesion-Sequenzierung von fünf soliden pseudopapillaren Neoplasma-Fällen, die auf die Kodierungssequenzen von 409 krebsbedingten Genen abzielten, insgesamt 27 somatische Mutationen in acht Genen. Mutationen wurden als Gründer oder Klonal definiert, wenn sie unter allen Läsionen eines bestimmten Patienten und Progressor oder subklonal geteilt wurden, wenn sie bei einigen, aber nicht allen Läsionen eines bestimmten Patienten nachgewiesen wurden.Konsequenterweise war die immunhistochemische Färbung für Beta-Catenin und KMD6A unter den verschiedenen Läsionen von Fällen mit Mutationen der entsprechenden Gene homogen. Die moderate Färbung von KMD6A in mutierten Proben deutet darauf hin, dass genetische Veränderungen eher die Funktion als die Expression des Proteins verändern. KMD6A Funktionsverlust bei Bauchspeicheldrüsentumoren ist mit einer Up-Regulierung des Hypoxie-Markers GLUT-1 verbunden.Und dementsprechend wurde GLUT-1 in Fällen mit KMD6A-Mutationen überdrüsslich ausgedrückt. Die Immunhistochemie für BAP1 und TP53 bestätigte, dass Mutationen in diesen Genen subklonal waren. In diesem virtuellen Karyotyp eines repräsentativen Falles, der den Standort, die Nähe und den Kopiernummernstatus veränderter Gene zeigt, ergab die Kopiernummernvariationsanalyse anhand von Sequenzierungsdaten Veränderungen in allen analysierten Proben.Und im Gegensatz zu Punktmutationen waren die meisten Änderungen der Kopierzahlvariationen subklonal. Die Validierung und Indexierung von Mutationen und Variationen der Kopiernummer sowie die Verwendung des tumornormalen DNA-Vergleichs sind wichtig, um die Generierung von Artefaktaufrufen zu vermeiden, die die Ergebnisse ungültig machen könnten. Dieses Verfahren könnte auch auf ganze Genomsequenzierungsstudien angewendet werden, die darauf abzielen, das gesamte Genom zur Identifizierung der Mutation zwischen der Läsion verschiedener solider Tumortypen zu verhören.Im Bereich der Krebsforschung sind diese Techniken wichtige Werkzeuge für das Verständnis der Biologie von Krankheiten mit wichtigen klinischen Implikationen, die auf die Entwicklung personalisierter und effektiver zielgerichteter Therapien abzielen.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Kontextuelle und Cued Angst Anlage Test mit einer Video-Analyse-System bei Mäusen

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Forschung

Verhalten

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Die Messung der Fronto-limbischen Aktivität unter Verwendung einer emotionalen Oddball Aufgabe bei Kindern mit familiärer High Risk for Schizophrenia

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimentelle Bewertung der Maus Sociability einer automatisierten Bildverarbeitung Ansatz

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Pavlovian Trainings konditionierten Ansatz bei Ratten

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protokoll für die Datenerhebung und Analyse Applied zu Automatische Gesichtsausdruck Analysis Technologie und zeitliche Analyse für die sensorische Prüfung

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Verhaltensstörungen: Ein innovativer Ansatz die Modulatorischer Auswirkungen einer Nutraceutical-Diät zu überwachen

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Behandlung von Sprunggelenk-Arthrose mit Sprunggelenk-Ersatz durch eine seitliche Transfibular Ansatz

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Einsatz eines drahtlosen Video-EEG-Systems zur Überwachung von epileptiforlen Entladungen nach lateraler Fluid-Percussion-induzierter traumatischer Hirnverletzung

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

Ein machine Learning-Ansatz zur Entwicklung eines effizienten selektiven Screenings leichter kognitiver Beeinträchtigungen

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Bewertung der geschickten Vorhension bei Mäusen mit einem Auto-Trainer

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...