Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

המחקר היה נתמך על ידי פרויקט הגנום האיטלקי הסרטן (גרנט לא. FIRB RBAP10AHJB), האגודה למען האדם (AIRC; גרנט No. 12182 ל AS ו 18178 ל VC), FP7 הקהילה האירופית מענק (Cam-Pac No 602783 ל-AS). לסוכנויות המימון לא היה כל תפקיד באוסף, ניתוח ופרשנות של נתונים או בכתיבת כתב היד.

החומר ששימש במחקר נאסף תחת פרוטוקול מסוים, אשר אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית. הסכמה מושכלת בכתב מכל המטופלים היתה זמינה.
1. מהדורת היסטולוגית וimmunophenotypical של דגימות רקמה
הערה: פתולוג מומחה אחראי על פעילויות המתוארות להלן.
<ol><li>מהדורת היסטראוולוגית של מקרים ?...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

השיטה שלנו מאפשרת זיהוי של שינויים מולקולריים מעורב התקדמות של גידולים מוצקים באמצעות שילוב של נתונים אנכיים (כלומר, מורפולוגיה, רצפי DNA, ו אימונוהיסטוכימיה) מפני נגעים שונים של מטופל נתון. הדגמנו את היכולת של השיטה שלנו כדי לזהות אירועי שבטים ושבטים משניים בסוג הגידול השקט מודגש (כלומר, SPN...

הופעתו של רצף הדור הבא (NGS) יש מהפכה הדרך סרטן מאובחנים וטופלו1. NGS מצמידים ברצף רב אזורי נחשפו מידה גבוהה של טרוגניות פנים-tumoral (ה-i) בגידולים מוצקים2, אשר מסביר בחלקו את כישלון של טיפול ממוקד בשל נוכחותם של תת שיבוטים עם רגישות לסמים שונים2 . אתגר חשוב הציג על ידי מחקרים הגנום כלל רצף הוא הצורך להבדיל בין הנוסע (כלומר, ניטרלי) ואת הנהג מוטציות בודדים סרטן3. מספר מחקרים אכן הראו כי, בגידולים מסוימים, מוטציות הנוסע חשבון עבור רוב ה-i, בעוד שינויים הנהג נוטים להיות שימור בין נגעים של אותו הפרט4. חשוב גם לציין כי הנטל הגדול (כפי שניתן לראות בסרטן הריאות ומלנומה) אינה מרמזת בהכרח על נטל גדול שבטיים משנה2. לכן, מידה גבוהה של ה-i ניתן למצוא בגידולים עם נטל ממוכן נמוך.
גרורות אחראים יותר מ 90% של מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם5; לכן, לכידת מטרוגניות של גנים של מנהלי התקנים בין נגעים הראשי גרורתי הוא קריטי לעיצוב של טיפולים יעילים עבור מחלות בשלב מתקדם. רצף קליני מבוצע בדרך כלל על חומצות גרעין מרקמות קבועות, אשר מספק הגנום כולו קשה בגלל איכות ה-DNA עני. מצד שני, הכוונה של הרצף הקליני הוא לזהות מוטציות שימושי ו/או מוטציות שעשויות לחזות היענות/היענות למשטר טיפולית נתונה. כפי שהוא עומד, רצף יכול להיות מוגבל לחלק קטן יותר של הגנום בזמן החילוץ של מידע רלוונטי קלינית. המעבר מפרופיל DNA בתפוקה נמוכה (g., רצף Sanger) כדי NGS יש לאפשר לנתח מאות הגנים הרלוונטיים לסרטן בעומק גבוה של כיסוי, אשר מאפשר זיהוי של אירועי שבטים משניים. כאן, אנו מדווחים על שיטה לניתוח נגעים השוואתי המאפשר זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים בין דגימות שונות מאותו אדם. השיטה המתוארת כאן משלבת שלוש גישות מבוססות היטב (ניתוח היסטולוגית, הסיקור גבוה רב נגעים ברצף, וניתוחים immunophenotypic) כדי לחזות את ההשלכות הפונקציונליות של הווריאציות שזוהו. הגישה מתוארת באיור 1 , והיא חלה על המחקר של 5 מקרים גרורתית של נאפילאמים מוצקים (שמות spn) של הלבלב. בעוד אנו מתארים עיבוד וניתוח של פורמאלין קבוע-פרפין מוטבע (FFPE) דגימות רקמה, את ההליך אותו ניתן להחיל על חומר גנטי מרקמות קפוא טרי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

הערכת טרוגניות פנים-tumoral (ה-i) היא בעלת חשיבות עליונה כדי לצפות כישלון של טיפולים ייעודיים ועיצוב בהתאם אסטרטגיות אנטי סרטניים יעיל. למרות חששות מורמות לעתים קרובות עקב הבדלים בעיבוד לדוגמה עומק של כיסוי, רצף הדור הבא של גידולים מוצקים יש מידה משתנה מאוד של ה-i לאורך סוגי הגידול. לכידת המצב הגנטי בין נגעים ראשוניים לגרורות באמצעות זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים הוא קריטי לעיצוב של טיפולים עבור מחלות שלב מראש. כאן, אנו מדווחים על שיטה לניתוח נגעים השוואתי המאפשר זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים בין דגימות שונות מאותו חולה. הגישה הניסיונית המתוארת כאן משלבת שלוש גישות מבוססות: ניתוח היסטולוגית, הסיקור הגבוה רב הנגעים וניתוחים אימונולוגיים. כדי למזער את ההשפעות על זיהוי של אירועים תת-שבטיים על ידי עיבוד לדוגמה בלתי הולמת, אנו חשופים רקמות כדי להיזהר בדיקה פתולוגית והעשרה תאים הנאופלסטית. בקרת איכות DNA מנגעים נאופלסטיים ורקמות נורמלי היה אז נתון רצף כיסוי גבוה, מיקוד אזורי הקידוד של 409 גנים סרטניים רלוונטיים. בעוד רק מסתכל בחלל גנומית מוגבלת, הגישה שלנו מאפשר להעריך את היקף הטרוגניות בין שינויים סומטיים (יחיד-נוקלאוטיד מוטציות והעתק מספר וריאציות) בנגעים שונים מחולה נתון. באמצעות ניתוח השוואתי של נתוני רצף, הצלחנו להבדיל בין שבטים לעומת שינויים תת-שבטיים. רוב ה-i-a מיוחס לעיתים קרובות למוטציות נוסעים; לכן, השתמשנו גם באימונוהיסטוכימיה כדי לחזות את ההשלכות התפקודיות של מוטציות. בעוד פרוטוקול זה הוחל על סוג הגידול מסוים, אנו מצפים כי המתודולוגיה המתוארת כאן היא ישימה באופן כללי על סוגים אחרים של גידולים מוצקים.

תהליך המחקר מומחש באיור 1. Multi-נגעים (n = 13) רצף של 5 מקרי SPN מיקוד רצפי קידוד של 409 סרטן הקשורות הגנים זיהה סך של 27 מוטציות סומטיים ב 8 גנים (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, ו- FGFR3). מוטציות הוגדרו כמייסד/שבטים כאשר משותף בין כל הנגעים של חולה נתונה, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר ללכוד את הקשר הגנטי בין נגעים ראשוניים וגטוסטטיים באמצעות זיהוי שינויים מולקולריים המעורבים בהתקדמות המחלה. השיטה שלנו מספקת את ההזדמנות לחקור את הקשורות הגנטית בדגימה קלינית עם רגישות גבוהה וספציפיות. זאת בשל שילוב של ניתוח מולקולרי והיסטופתולוגי.להערכת הטרוגניות תוך-טמור בתחום חקר הסרטן יש חשיבות עליונה בתכנון אסטרטגיות אנטי-גידול יעילות, ושיטתנו ישימה באופן נרחב לסוגי גידולים מוצקים רבים. לאחר הכנת וכמות ספריות העניין, מדללים כל ספרייה לריכוז של 100 פיקומולרים במים נטולי גרעין ומשלבים 10 מיקרוליטרים של כל ספרייה מדוללת להפעלה אחת בצינור אחד. לאחר מכן מערבבים את הספריות המפולגות על ידי צינורות.כדי ליזום הפעלת רצף, פתח תחילה את דפדפן Torrent במחשב המחובר למערכת הריצוף. תכנן הפעלה חדשה באמצעות התבנית הגנרית עבור היישום הנבחר ותחת הכרטיסיה ערכות בחר מערכת פרוטון יון או מערכת יון ג'ין Studio S5. בחרו בשבב המתאים מהתפריט הנפתח של סוג השבב ובחרו בערכת הספרייה Ion AmpliSeq 2.0 מהרשימה הנפתחת של ערכת הספרייה.בחר בלחצן יון שף עבור ערכת התבנית ובחר את ערכת השף המתאימה מהרשימה הנפתחת של ערכת התבניות. בחרו בערכת רצף המתאימה מהתפריט הנפתח של ערכת רצף ובחרו 'יון אקספרס' מהרשימה הנפתחת 'ערכת ברקוד'. תחת לשונית התוסף, בחר את תוסף ניתוח הכיסוי.תחת הכרטיסיה תוכנית, בחר את הגנום GRCH37HG19 מהרשימה הנפתחת של ספריית הייחוס. מהרשימה הנפתחת של אזורי היעד, בחרו בחלונית המתאימה לרצף. לאחר מכן הגדר את מספר הברקודים שיש לרצף והגדר את שם הברקוד ואת השם לדוגמה עבור כל ספריה.עבור דילול ספריות בריכה, לדלל את ספריית המלאי עם מים ללא גרעין לריכוז 25 picomolar עבור שבב פרוטון יון פיפטה 50 microliters של כל ספרייה מדוללת לתחתית צינור מדגם הספרייה המתאים. טען צינורות מדגם המכילים את הספריות המדוללים המדוללים אל מערכת ההכנה לספרייה והתחל את הגברה שיבוט. עבור רצף הדור הבא, בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי לאתחל את הכלי.כאשר הגברה שיבוט הוא סיים, לפתוח את דלת המכשיר יון שף, ולאחר מכן לפתוח את המכסה של צנטריפוגה טעינת שבב ולהסיר את שני השבבים ממערכת הכנת הספרייה. מניחים את השבבים במיכלי אחסון שבבים נפרדים ומטענים את אחד השבבים בתא השבבים במכשיר. לאחר מכן סגור את מכסה תא השבבים והתחל את רצף.לניתוח מוטציה, פתח את תוסף ניתוח הכיסוי ולהשתמש בתפוקת ניתוח הכיסוי כדי לאמת את עומק הכיסוי ואחידות. השתמש בתוסף Torrent Variant Caller כדי לבצע את הקריאה משתנה בחירת קו נבט או זרימת עבודה סומטית בהתאם לצורך. לאחר מכן הורידו וריאנטים מסוננים לקבצי תבנית שיחה ולהשתמש בתוכנת מנבא אפקטי הווריאציה במסד הנתונים NCBI RefSeq כדי להוסיף ביאורים לגרסאות.כדי להעריך את וריאציות מספר עותק, להשתמש תוסף uploader כתב יון לטעון את נתוני רצף לתוך תוכנת כתב יון ולהשתמש בזרימת העבודה מקיפה סרטן פאנל סרטן נורמלי זוג כדי לנתח את הנתונים. סנן ידנית את המוטציות ואת וריאציות מספר ההעתקה בהתבסס על הציונים שהוקצו על-ידי התוכנה ואמת את הווריאציות באופן חזותי עם מציג הגנומיקה האינטגרטיבית. לאחר מכן, בדוק באופן חזותי את היישור עבור קריאות יוצאות דופן שעשויות ליצור שיחות חפץ ולבדוק את הכיסוי המנורמל עבור כל האמפיקלונים בגן נתון מול הכיסוי המנורמל של התוכנית הבסיסית כדי לאמת את וריאציות מספר ההעתקה.עבור כל מקרה, אינדקס קריאות המוטציה מן רצף של רקמה נורמלית או דם או גידול ראשוני או גרורות. סמן כקו נבט והשליך שיחות הניכרות גם מנתוני ריצוף הדנ"א של קו הנבט. דגל כמו שיבוט או מייסד המוטציות המשותפות בין כל נגעים של חולה נתון.לאחר מכן דגל כתת-קטגורי או התקדמות המוטציות שזוהו בחלק מהנגעים אך לא בכל הנגעים של מטופל נתון. בניסוי מייצג זה, רצף רב-נגעים של חמישה מקרי ניאופלזם pseudopapillary מוצקים המכוונים לרצפי הקידוד של 409 גנים הקשורים לסרטן זיהו בסך הכל 27 מוטציות סומטיות בשמונה גנים. מוטציות הוגדרו כמייסד או שיבוט כאשר חולקים בין כל הנגעים של מטופל נתון ומתקדם או subclonal כאשר זוהה בחלק אבל לא כל הנגעים של חולה נתון.באופן עקבי, כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור בטא-קטנין ו KMD6A היה הומוגני בין נגעים מגוונים של מקרים עם מוטציות של הגנים המתאימים. הכתמים המתונים עבור KMD6A בדגימות שעברו מוטציה מצביעים על כך שהתניה גנטית עשויה לשנות את הפונקציה ולא את ביטוי החלבון. KMD6A אובדן תפקוד בגידולים בלבלב קשורה עם ויסות עד של סמן היפוקסיה GLUT-1.ובהתאם לכך, GLUT-1 התבטא במקרים של מוטציות KMD6A. אימונוהיסטוכימיה עבור BAP1 ו- TP53 אישרה כי מוטציות בגנים אלה היו תת-קטגוריות. בקאריוטיפ וירטואלי זה של מקרה מייצג המציג את המיקום, הקרבה והסטטוס של מספר העתקה של גנים שהשתנו, ניתוח וריאציית מספר ההעתקה באמצעות נתוני רצף חשף שינויים בכל הדגימות שנותחו.ובניגוד למוטציות נקודתיות, רוב שינויים בווריאציות של מספר העתקה היו תת-קטגוריים. אימות ואינדקס של מוטציות וריאציה מספר עותק ושימוש השוואת DNA נורמלי הגידול חשובים למניעת הדור של שיחות חפץ שיכול לפסול את התוצאות. הליך זה יכול להיות מיושם גם על מחקרי ריצוף גנום שלמים שמטרתם לחקור את הגנום כולו לזיהוי מוטציה בין נגע של סוגי גידולים מוצקים שונים.בתחום חקר הסרטן, טכניקות אלה הן כלים קריטיים להבנת הביולוגיה של מחלות עם השלכות קליניות חשובות שמטרתן לעצב טיפולים ממוקדים מותאמים אישית ויעילים.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

אוויר מבחן הקשר ורמז פחד באמצעות מערכת ניתוח וידאו בעכברים

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

מדידה של פעילות פרונטו-הלימבית שימוש מוזר משימה רגשית בילדים בסיכון גבוה לסכיזופרניה משפחתי

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

ההערכה הניסויית של עכבר חברותי בגישת עיבוד תמונה אוטומטית

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

הדרכת גישה אלפה הפבלובית בחולדות

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

פרוטוקול איסוף נתונים וניתוח יישומים לטכנולוגית ניתוח הבעות פנים אוטומטי ובזמן ניתוח להערכה חושית

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

הפרעות התנהגותיות: גישה חדשנית אחר ההשפעות modulatory של תזונה Nutraceutical

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

טיפול של דלקת מפרקים ניוונית הקרסול עם קרסול הכולל באמצעות גישה Transfibular לרוחב

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

שימוש במערכת וידאו-EEG אלחוטית לניטור אפילפטית פולט בעקבות נוזל לרוחב-פגיעה מוחית טראומטית

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

גישת למידה ממוחשבת לעיצוב הקרנה סלקטיבית יעילה של ליקוי קוגניטיבי מתון

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

הערכת שליטה מיומנת בעכברים באמצעות מאמן אוטומטי

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...