Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
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अध्ययन इतालवी कैंसर जीनोम परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रेंट नहीं. FIRB RBAP10AHJB), एसोसिएजिन इटालियना राइसरका कांक्रो (एआईआरसी; अनुदान संख्या 12182 AS और 18178 को कुलपति के लिए), FP7 यूरोपीय समुदाय अनुदान (कैम-पैक नहीं 602783 AS के लिए). धन एजेंसियों के संग्रह, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या में या पांडुलिपि के लेखन में कोई भूमिका नहीं थी.

अध्ययन में प्रयुक्त सामग्री एक विशिष्ट प्रोटोकॉल के तहत एकत्र की गई थी, जिसे स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति उपलब्ध थी।
1. ऊतक नमूनों के ऊतकीय ...

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	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

हमारी विधि किसी दिए गए रोगी के अलग घावों से ऊर्ध्वाधर डेटा (यानी, आकृति विज्ञान, डीएनए अनुक्रमण, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) के एकीकरण के माध्यम से ठोस ट्यूमर की प्रगति में शामिल आणविक परिवर्तन की पहच?...

अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) के आगमन ने कैंसर का निदान और इलाज करने के तरीके में क्रांति ला दीहै 1. बहुक्षेत्रीय अनुक्रमण के साथ मिलकर एनजीएस ने ठोस ट्यूमर 2 में इंट्रा-ट्युमल विषमता (आईआईटीएच) की एक उच्च डिग्री को उजागर किया है, जो अलग दवा संवेदनशीलताकेसाथ subclones की उपस्थिति के कारण लक्षित चिकित्सा की विफलता के हिस्से में बताते हैं2 . जीनोम व्यापक अनुक्रमण अध्ययन द्वारा उत्पन्न एक महत्वपूर्ण चुनौती यात्री (यानी, तटस्थ) और व्यक्तिगत कैंसर में ड्राइवर उत्परिवर्तनों के बीच अंतर करने की आवश्यकता है3. कई अध्ययनों से वास्तव में पता चला है कि, कुछ ट्यूमर में, यात्री उत्परिवर्तन ों आईआईटीएच के बहुमत के लिए खाते हैं, जबकि ड्राइवर परिवर्तन एक ही व्यक्ति4के घावों के बीच संरक्षित किया जा करने के लिए करते हैं। यह भी ध्यान दें कि बड़े उत्परिवर्तन बोझ (के रूप में फेफड़ों के कैंसर और मेलेनोमा में देखा) जरूरी एक बड़े subclonal उत्परिवर्तन बोझ2मतलब नहीं है महत्वपूर्ण है. इसलिए, ITH के एक उच्च डिग्री कम उत्परिवर्तन बोझ के साथ ट्यूमर में पाया जा सकता है.
मेटास्टेसिस दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौत के 90% से अधिक के लिए जिम्मेदार हैं5; इसलिए, प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों के बीच ड्राइवर जीन ों की उत्परिवर्तन विषमता पर कब्जा उन्नत चरण के रोगों के लिए प्रभावी उपचार के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है। नैदानिक अनुक्रमण आम तौर पर निश्चित ऊतकों से न्यूक्लिक एसिड पर किया जाता है, जो खराब डीएनए गुणवत्ता की वजह से जीनोम व्यापक अन्वेषण मुश्किल renders. दूसरी ओर, नैदानिक अनुक्रमण का उद्देश्य कार्रवाई योग्य उत्परिवर्तनों और/या उत्परिवर्तनों की पहचान करना है जो किसी दिए गए चिकित्सीय आहार के लिए प्रतिक्रियाकी प्रतिक्रिया/अक्रियाशीलता की भविष्यवाणी कर सकते हैं। के रूप में यह खड़ा है, अनुक्रमण नैदानिक रूप से प्रासंगिक जानकारी के समय पर निष्कर्षण के लिए जीनोम के एक छोटे अंश के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है. NGS के लिए कम throughput डीएनए प्रोफाइलिंग (उदाहरण के लिए, Sanger अनुक्रमण) से संक्रमण यह कवरेज की एक उच्च गहराई पर कैंसर से संबंधित जीन के सैकड़ों का विश्लेषण करने के लिए संभव प्रदान की गई है, जो subclonal घटनाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम तुलनात्मक घावों के विश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जो एक ही व्यक्ति से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और सबक्लोनल आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है। यहाँ वर्णित विधि की पहचान की विविधताओं के कार्यात्मक परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए तीन अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण (हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, उच्च कवर बहु-लेशन अनुक्रमण, और इम्यूनोफेनोटाइपिक विश्लेषण) को एकीकृत करता है। दृष्टिकोण योजनाबद्ध रूप से चित्र 1 में वर्णित है और अग्न्याशय के ठोस छद्म स्तंभीय नियोप्लाज्म (एसपीएन) के 5 मेटास्टैटिक मामलों के अध्ययन के लिए लागू किया गया है। जब तक हम फार्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतक नमूनों के प्रसंस्करण और विश्लेषण का वर्णन करते हैं, तो उसी प्रक्रिया को ताजा-फ्रोज़न ऊतक से आनुवंशिक सामग्री पर लागू किया जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

अंतर-ट्यूमर विषमता (ITH) का आकलन लक्षित उपचार की विफलता की आशा करने के लिए सर्वोपरि महत्व का है और तदनुसार प्रभावी विरोधी ट्यूमर रणनीतियों डिजाइन। हालांकि चिंताओं अक्सर नमूना प्रसंस्करण और कवरेज की गहराई में मतभेद के कारण उठाया जाता है, ठोस ट्यूमर की अगली पीढ़ी अनुक्रमण ट्यूमर प्रकार भर में ITH के एक उच्च चर डिग्री unraveled है. क्लोनल और subclonal आबादी की पहचान के माध्यम से प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों के बीच आनुवंशिक संबंधितता पर कब्जा अग्रिम चरण के रोगों के लिए उपचार के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम तुलनात्मक घावों के विश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जो एक ही रोगी से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और सबक्लोनल आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है। यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण तीन अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण को एकीकृत करता है: हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, उच्च कवर बहु-लेशन अनुक्रमण, और इम्यूनोफेनोटाइपिक विश्लेषण। आदेश में अनुचित नमूना प्रसंस्करण द्वारा subclonal घटनाओं का पता लगाने पर प्रभाव को कम करने के लिए, हम सावधान रोग परीक्षा और neoplastic सेल संवर्धन के लिए ऊतकों के अधीन. neoplastic घावों और सामान्य ऊतकों से गुणवत्ता नियंत्रित डीएनए तो उच्च कवरेज अनुक्रमण के अधीन था, 409 प्रासंगिक कैंसर जीन की कोडिंग क्षेत्रों को लक्षित. जबकि केवल एक सीमित जीनोमिक अंतरिक्ष को देख, हमारे दृष्टिकोण दैहिक परिवर्तन के बीच विषमता की हद तक मूल्यांकन सक्षम बनाता है (एकल-न्यूक्लिओटाइड उत्परिवर्तनों और कॉपी संख्या विविधताओं) एक दिए गए रोगी से अलग घावों में. अनुक्रमण डेटा के तुलनात्मक विश्लेषण के माध्यम से, हम क्लोनल बनाम subclonal परिवर्तन भेद करने में सक्षम थे. आईआईटीएच के बहुमत अक्सर यात्री उत्परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार है; इसलिए, हम उत्परिवर्तनों के कार्यात्मक परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का भी उपयोग करते हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट ट्यूमर प्रकार के लिए लागू किया गया है, हम आशा करते हैं कि यहाँ वर्णित पद्धति मोटे तौर पर अन्य ठोस ट्यूमर प्रकार के लिए लागू है.

अध्ययन कार्यप्रवाह चित्र 1में सचित्र है। मल्टी-लेसिस (एन जेड 13) 409 कैंसर से संबंधित जीनों के कोडन अनुक्रमों को लक्षित करने वाले 5 एसपीएन मामलों के अनुक्रमण में 8 जीनों में कुल 27 कायिक उत्परिवर्?...

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Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

यह लेख किसी दिए गए रोगी से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और subclonal परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. हालांकि यहाँ वर्णित प्रयोगों एक विशिष्ट ट्यूमर प्रकार पर ध्यान केंद्रित, दृष्टिकोण मोटे तौर पर अन्य ठोस ट्यूमर के लिए लागू होता है.

एक लक्षित अनुक्रमण दृष्टिकोण के माध्यम से तुलनात्मक Lesions विश्लेषण

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

हमारा प्रोटोकॉल रोग प्रगति में शामिल आणविक परिवर्तन की पहचान के माध्यम से प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों के बीच आनुवंशिक संबंधितता को पकड़ने की अनुमति देता है। हमारी विधि उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ नैदानिक नमूने में आनुवंशिक संबंधितता का पता लगाने का अवसर प्रदान करती है। यह आणविक और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के एकीकरण के कारण है।कैंसर अनुसंधान क्षेत्र में इंट्राट्यूमर विषमता का आकलन प्रभावी एंटी-ट्यूमर रणनीतियों को डिजाइन करने में सर्वोपरि महत्व रखता है और हमारी विधि मोटे तौर पर कई ठोस ट्यूमर प्रकारों पर लागू होती है। रुचि के पुस्तकालयों को तैयार करने और मात्रा निर्धारित करने के बाद, प्रत्येक पुस्तकालय को नाभिक मुक्त पानी में 100 पिकोमोर एकाग्रता में पतला करें और एक ही ट्यूब में एक ही रन के लिए प्रत्येक पतला पुस्तकालय के 10 माइक्रोलीटर को जोड़ दें। फिर पूल्ड लाइब्रेरी को पाइपिंग करके मिलाएं।अनुक्रमण रन शुरू करने के लिए, सबसे पहले अनुक्रमण प्रणाली से जुड़े कंप्यूटर पर धार ब्राउज़र खोलें। चयनित आवेदन के लिए जेनेरिक टेम्पलेट का उपयोग करके और किट टैब के तहत आयन प्रोटोन सिस्टम या आयन जीन स्टूडियो एस5 सिस्टम का चयन करने के लिए एक नया रन प्लान करें। चिप प्रकार ड्रॉपडाउन मेनू से उपयुक्त चिप का चयन करें और लाइब्रेरी किट ड्रॉपडाउन सूची से आयन एम्प्लिसेक्यू 2.0 लाइब्रेरी किट का चयन करें।टेम्पलेट किट के लिए आयन शेफ बटन का चयन करें और टेम्पलेट किट ड्रॉपडाउन सूची से उपयुक्त शेफ किट का चयन करें। अनुक्रमण किट ड्रॉपडाउन मेनू से उपयुक्त अनुक्रमण किट का चयन करें और बारकोड सेट ड्रॉपडाउन सूची से आयन एक्सप्रेस का चयन करें। प्लगइन टैब के तहत, कवरेज विश्लेषण प्लगइन का चयन करें।योजना टैब के तहत, संदर्भ पुस्तकालय ड्रॉपडाउन सूची से GRCH37HG19 जीनोम का चयन करें। लक्षित क्षेत्रों की ड्रॉपडाउन सूची से, अनुक्रमित होने के लिए उपयुक्त पैनल का चयन करें। फिर अनुक्रमित होने के लिए बारकोड की संख्या निर्धारित करें और प्रत्येक पुस्तकालय के लिए बारकोड नाम और नमूना नाम सेट करें।एक पूल्ड पुस्तकालयों को कमजोर करने के लिए, एक आयन प्रोटोन चिप के लिए 25 पिकोमलर एकाग्रता के लिए नाभिक मुक्त पानी के साथ स्टॉक लाइब्रेरी को पतला करें और प्रत्येक पतला पुस्तकालय के पिपेट 50 माइक्रोलीटर उपयुक्त पुस्तकालय नमूना ट्यूब के नीचे करें। पुस्तकालय तैयारी प्रणाली पर पूल्ड पतला पुस्तकालयों युक्त नमूना ट्यूबों लोड करें और क्लोनल प्रवर्धन शुरू करें। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए, साधन को शुरू करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।क्लोनल प्रवर्धन समाप्त होने पर आयन शेफ इंस्ट्रूमेंट का दरवाजा खोलें, फिर चिप लोडिंग सेंट्रलाइज का ढक्कन खोलें और लाइब्रेरी तैयार करने की व्यवस्था से दो चिप्स निकालें। चिप्स को अलग चिप स्टोरेज कंटेनरों में रखें और चिप्स में से एक को इंस्ट्रूमेंट में चिप डिब्बे में लोड करें । इसके बाद चिप के डिब्बे का ढक्कन बंद कर के सीक्वेंसिंग शुरू कर दें।उत्परिवर्तन विश्लेषण के लिए, कवरेज विश्लेषण प्लगइन खोलें और कवरेज विश्लेषण आउटपुट का उपयोग कवरेज और एकरूपता की गहराई को सत्यापित करने के लिए करें। उपयुक्त के रूप में रोगाणु लाइन या दैहिक कार्यप्रवाह का चयन करने वाले वैरिएंट कॉलिंग को करने के लिए धार संस्करण कॉलर प्लगइन का उपयोग करें। इसके बाद फ़िल्टर किए गए वेरिएंट वेरिएंट कॉल फॉर्मेट फाइल्स डाउनलोड करें और वेरिएंट को एनोटेट करने के लिए एनसीबीआई रिफसेक्यू डेटाबेस में वैरिएंट इफेक्ट एफर्नेटर सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करें ।कॉपी-नंबर विविधताओं का अनुमान लगाने के लिए, आयन रिपोर्टर अपलोडर प्लगइन का उपयोग आयन रिपोर्टर सॉफ्टवेयर में अनुक्रमण डेटा लोड करने के लिए और डेटा का विश्लेषण करने के लिए व्यापक कैंसर पैनल ट्यूमर सामान्य जोड़ी वर्कफ्लो का उपयोग करें। सॉफ्टवेयर द्वारा सौंपे गए स्कोर के आधार पर म्यूटेशन और कॉपी-नंबर विविधताओं को मैन्युअल रूप से फ़िल्टर करें और एकीकृत जीनोमिक्स दर्शक के साथ नेत्रहीन विविधताओं को सत्यापित करें। फिर नेत्रहीन असामान्य पढ़ता है कि विरूपण कॉल उत्पन्न कर सकते हैं और कॉपी संख्या विविधताओं को सत्यापित करने के लिए बेसलाइन के सामान्यीकृत कवरेज के खिलाफ एक दिए गए जीन भर में एम्प्लिकॉन के सभी के लिए सामान्यीकृत कवरेज का निरीक्षण करने के लिए संरेखण का निरीक्षण।प्रत्येक मामले के लिए, सामान्य ऊतक या रक्त या प्राथमिक ट्यूमर या मेटास्टेसिस के अनुक्रमण से उत्परिवर्तन कॉल को इंडेक्स करें। जर्म लाइन के रूप में ध्वज और कॉल त्यागें जो रोगाणु रेखा डीएनए के अनुक्रमण डेटा से भी स्पष्ट हैं। क्लोनल या संस्थापक के रूप में ध्वज म्यूटेशन जो किसी दिए गए रोगी के सभी घावों के बीच साझा किए जाते हैं।फिर उपकस्तर या प्रगतिकर्ता के रूप में ध्वजारोहण करें जो किसी दिए गए रोगी के घावों के सभी में कुछ में पाए जाते हैं। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, ४०९ कैंसर से संबंधित जीन के कोडिंग दृश्यों को लक्षित करने वाले पांच ठोस छद्मपिल्लीय नियोप्लाज्म मामलों के बहु-घाव अनुक्रमण ने आठ जीनों में कुल 27 दैहिक उत्परिवर्तनों की पहचान की । उत्परिवर्तन को संस्थापक या क्लोनल के रूप में परिभाषित किया गया था जब किसी दिए गए रोगी और प्रगतिकर्ता या उपक्लोनल के घावों के सभी के बीच साझा किया जाता है जब कुछ में पता नहीं लगाया जाता है लेकिन किसी दिए गए रोगी के घावों के सभी नहीं होते हैं।लगातार, बीटा-कैटेनिन और केएमडी 6ए के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला संबंधित जीन के उत्परिवर्तन के साथ मामलों के विविध घावों के बीच समरूप था। उत्परिवर्तित नमूनों में KMD6A के लिए मध्यम धुंधला सुझाव है कि आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के बजाय समारोह में परिवर्तन की संभावना है । अग्नाशय के ट्यूमर में कार्य का KMD6A नुकसान हाइपोक्सिया मार्कर ग्लूट-1 के ऊपर विनियमन के साथ जुड़ा हुआ है।और तदनुसार, केएमडी 6ए म्यूटेशन वाले मामलों में भरमार-1 व्यक्त किया गया था। BAP1 और TP53 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने पुष्टि की कि उन जीनों में उत्परिवर्तन उपक्लोनल थे । एक प्रतिनिधि मामले के इस आभासी karyotype में स्थान, निकटता, और कॉपी-बदल जीन की संख्या की स्थिति दिखा, प्रतिलिपि संख्या भिन्नता विश्लेषण अनुक्रमण डेटा का उपयोग कर विश्लेषण नमूनों के सभी में परिवर्तन का पता चला ।और बिंदु म्यूटेशन के विपरीत, अधिकांश कॉपी-नंबर भिन्नता परिवर्तन उपक्लोनल थे। उत्परिवर्तन और कॉपी-नंबर भिन्नता का सत्यापन और अनुक्रमण और ट्यूमर सामान्य डीएनए तुलना का उपयोग करना विरूपणीय कॉल की पीढ़ी से बचने के लिए महत्वपूर्ण है जो परिणामों को अमान्य कर सकता है। इस प्रक्रिया को विभिन्न ठोस ट्यूमर प्रकारों के घाव के बीच उत्परिवर्तन की पहचान के लिए पूरे जीनोम से पूछताछ करने के उद्देश्य से पूरे जीनोम अनुक्रमण अध्ययनों पर भी लागू किया जा सकता है।कैंसर अनुसंधान क्षेत्र में, इन तकनीकों व्यक्तिगत और प्रभावी लक्षित चिकित्सा डिजाइन करने के उद्देश्य से महत्वपूर्ण नैदानिक निहितार्थ के साथ रोगों के जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं ।

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

चूहों में एक वीडियो विश्लेषण प्रणाली का प्रयोग प्रासंगिक और cued डर कंडीशनिंग टेस्ट

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

एक प्रकार का पागलपन के लिए पारिवारिक उच्च जोखिम के साथ बच्चों में एक भावनात्मक Oddball कार्य का उपयोग ललाट-लिम्बिक गतिविधि की माप

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

माउस सुशीलता के प्रायोगिक आकलन एक स्वचालित इमेज प्रोसेसिंग दृष्टिकोण का उपयोग

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

चूहे में Pavlovian वातानुकूलित दृष्टिकोण प्रशिक्षण

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

संवेदी मूल्यांकन के लिए डेटा संग्रह और स्वचालित चेहरे की अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रौद्योगिकी लागू करने के विश्लेषण और टेम्पोरल विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

व्यवहार गड़बड़ी: एक न्यूट्रा आहार की modulatory प्रभाव पर नजर रखने के लिए एक नवीन दृष्टिकोण

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

एक पार्श्व Transfibular दृष्टिकोण के माध्यम से कुल टखने प्रतिस्थापन के साथ टखने पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के उपचार

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

पार्श्व द्रव-अनुप्रक्षेप प्रेरित अभिघातजन्य मस्तिष्क की चोट के बाद मिर्गी के निर्वहन की निगरानी के लिए एक वायरलेस वीडियो-ईईजी सिस्टम का उपयोग

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

हल्के संज्ञानात्मक हानि की एक कुशल चयनात्मक स्क्रीनिंग डिजाइन करने के लिए एक मशीन लर्निंग दृष्टिकोण

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

एक ऑटो-ट्रेनर का उपयोग कर चूहे में कुशल prehension का मूल्यांकन

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...