Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Lo studio è stato sostenuto dal Progetto Italiano Cancro Genoma (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Ricerca Italiana Cancro (AIRC; Sovvenzione da 12182 a AS e 18178 a VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac N. 602783 ad AS). Le agenzie di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nella raccolta, nell'analisi e nell'interpretazione dei dati o nella stesura del manoscritto.

Il materiale utilizzato nello studio è stato raccolto nell'ambito di un protocollo specifico, che è stato approvato dal comitato etico locale. Era disponibile il consenso informato scritto da parte di tutti i pazienti.
1. Revisione istologica e immunofenotipica dei campioni di tessuto
NOTA: Un patologo esperto è responsabile delle attività descritte di seguito.
<ol><li>Revisione istopatologica dei casi selezionati secondo criteri diagnostici ben consolidati.<o...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Il nostro metodo consente l'identificazione delle alterazioni molecolari coinvolte nella progressione dei tumori solidi attraverso l'integrazione di dati verticali (ad esempio, morfologia, sequenziamento del DNA e immunosofologia) da lesioni distinte di un determinato paziente. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro metodo di rilevare eventi clonali e subclonali in un tipo di tumore silenzioso mutazionale (cioè SPN, neopolismo pseudoppillare del pancreas) interrogando le sequenze di codifica di 409 geni rilevanti pe...

L'avvento del sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha rivoluzionato il modo in cui i tumori vengono diagnosticati e trattati1. NGS accoppiato al sequenziamento multiregionale hanno esposto un alto grado di eterogeneità intra-tumorale (ITH) in tumori solidi2, che spiega in parte il fallimento della terapia mirata a causa della presenza di subcloni con diversa sensibilità farmacologica2 . Una sfida importante posta dagli studi di sequenziamento a livello di genoma è la necessità di distinguere tra mutazioni passeggeri (cioè neutre) e del conducente nei singoli tumori3. Diversi studi hanno infatti dimostrato che, in alcuni tumori, le mutazioni dei passeggeri rappresentano la maggior parte dello ITH, mentre le alterazioni del conducente tendono ad essere conservate tra le lesioni dello stesso individuo4. È anche importante notare che un grande onere mutazionale (come si è visto nei tumori polmonari e nel melanoma) non implica necessariamente un grande onere mutazionale subclonale2. Pertanto, un alto grado di ITH può essere trovato in tumori con basso carico mutazionale.
Le metastasi sono responsabili di oltre il 90% della morte per cancro in tutto il mondo5; pertanto, catturare l'eterogeneità mutazionale dei geni del conducente tra lesioni primarie e metastatiche è fondamentale per la progettazione di terapie efficaci per le malattie in fase avanzata. Il sequenziamento clinico viene generalmente eseguito su acidi nucleici provenienti da tessuti fissi, il che rende difficile l'esplorazione in tutta il genoma a causa della scarsa qualità del DNA. D'altra parte, l'intento del sequenziamento clinico è quello di identificare mutazioni e/o mutazioni utilizzabili che potrebbero prevedere la reattività/non risposta a un determinato regime terapeutico. Così com'è, il sequenziamento può essere limitato a una frazione minore del genoma per l'estrazione tempestiva di informazioni clinicamente rilevanti. La transizione dalla profilazione del DNA a bassa velocità (ad esempio, Sanger Sequencing) a NGS ha reso possibile analizzare centinaia di geni rilevanti per il cancro ad un'elevata profondità di copertura, il che consente il rilevamento di eventi subclonali. Qui, riportiamo un metodo per l'analisi delle lesioni comparative che consente l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dallo stesso individuo. Il metodo qui descritto integra tre approcci consolidati (analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche) per prevedere le conseguenze funzionali delle variazioni identificate. L'approccio è schematicomente descritto nella Figura 1 ed è stato applicato allo studio di 5 casi metastatici di neoplasmi pseudoppillari (STEN) solidi del pancreas. Mentre descriviamo l'elaborazione e l'analisi di campioni di tessuto incorporato in paraffina fissata a formalina (FFPE), la stessa procedura può essere applicata al materiale genetico proveniente da tessuto fresco congelato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Valutare l'eterogeneità intra-tumorale (ITH) è di fondamentale importanza per anticipare il fallimento delle terapie mirate e progettare strategie antitumorali di conseguenza efficaci. Anche se le preoccupazioni sono spesso sollevate a causa delle differenze nell'elaborazione del campione e nella profondità della copertura, il sequenziamento di prossima generazione dei tumori solidi ha svelato un grado altamente variabile di ITH in tutti i tipi di tumore. Catturare la correlazione genetica tra le lesioni primarie e metastatiche attraverso l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali è fondamentale per la progettazione di terapie per le malattie in fase avanzata. Qui, riportiamo un metodo per l'analisi delle lesioni comparative che consente l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dello stesso paziente. L'approccio sperimentale qui descritto integra tre approcci consolidati: analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche. Al fine di ridurre al minimo gli effetti sulla rilevazione di eventi subclonali mediante un'elaborazione inappropriata dei campioni, abbiamo sottoposto i tessuti a un attento esame patologico e all'arricchimento delle cellule neoplastiche. Il DNA controllato dalla qualità delle lesioni neoplastiche e dei tessuti normali è stato poi sottoposto a sequenziamento ad alta copertura, mirando alle regioni di codifica di 409 geni tumorali rilevanti. Sebbene solo guardando uno spazio genomico limitato, il nostro approccio consente di valutare l'entità dell'eterogeneità tra alterazioni somatiche (mutazioni a singolo nucleotide e variazioni del numero di copie) in lesioni distinte da un determinato paziente. Attraverso un'analisi comparativa dei dati di sequenziamento, siamo stati in grado di distinguere le alterazioni clonale e subclonali. La maggior parte dell'ITH è spesso attribuita alle mutazioni dei passeggeri; pertanto, abbiamo anche usato l'immunoistochimica per prevedere le conseguenze funzionali delle mutazioni. Mentre questo protocollo è stato applicato a un tipo di tumore specifico, prevediamo che la metodologia qui descritta è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido.

Il flusso di lavoro di studio è illustrato nella Figura 1. Il sequenziamento di 5 casi SPN mirati alle sequenze di codifica di 409 geni correlati al cancro ha identificato un totale di 27 mutazioni somatiche in 8 geni (CTNNB1, KDM6A, BA1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1e FGFR3). Le mutazioni sono state definite come fondatore/clonale quando condivise tra tutte le lesioni di un determinato paziente e progressor/subclonali quando...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Questo articolo descrive un metodo per identificare le alterazioni clonali e subclonali tra campioni diversi di un determinato paziente. Anche se gli esperimenti qui descritti si concentrano su un tipo di tumore specifico, l'approccio è ampiamente applicabile ad altri tumori solidi.

Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Il nostro protocollo consente la cattura della relazione genetica tra lesioni primarie e metastatiche attraverso l'identificazione di alterazioni molecolari coinvolte nella progressione della malattia. Il nostro metodo offre l'opportunità di esplorare la relazione genetica in esemplari clinici ad alta sensibilità e specificità. Ciò è dovuto all'integrazione dell'analisi molecolare e istopatologica.La valutazione dell'eterogeneità intratumorale nel campo della ricerca sul cancro è di fondamentale importanza nella progettazione di strategie antitumorali efficaci e il nostro metodo è ampiamente applicabile a molti tipi di tumore solido. Dopo aver preparato e quantificato le librerie di interesse, diluire ogni libreria a una concentrazione di 100 picomolare in acqua priva di nucleasi e combinare 10 microlitri di ogni libreria diluita per una singola corsa in un unico tubo. Quindi mescolare le librerie raggruppate mediante pipettazione.Per avviare un'esecuzione di sequenziamento, aprire prima il browser Torrent su un computer collegato al sistema di sequenziamento. Pianificare una nuova esecuzione utilizzando il modello generico per l'applicazione selezionata e nella scheda kit selezionare sistema Ion Proton o sistema Ion Gene Studio S5. Selezionate il chip appropriato dal menu a discesa tipo chip e selezionate Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit dall'elenco a discesa del kit libreria.Selezionare il pulsante Ion Chef per il kit di modelli e selezionare il kit chef appropriato dall'elenco a discesa del kit modello. Selezionate il kit di sequenziamento appropriato dal menu a discesa del kit di sequenziamento e selezionate Ion Express dall'elenco a discesa set di codici a barre. Nella scheda plug-in selezionare il plug-in di analisi della copertura.Nella scheda piano selezionare il genoma GRCH37HG19 dall'elenco a discesa della libreria di riferimento. Nell'elenco a discesa aree di destinazione selezionare il pannello appropriato da sequenziare. Impostare quindi il numero di codici a barre da sequenziare e impostare il nome del codice a barre e il nome di esempio per ogni libreria.Per una diluizione delle librerie raggruppate, diluire la libreria di serie con acqua priva di nucleasi a una concentrazione di 25 picomolare per un chip protonico ionico e pipettare 50 microlitri di ogni libreria diluita sul fondo del tubo campione della libreria appropriata. Caricare i tubi campione contenenti le librerie diluite raggruppate nel sistema di preparazione della libreria e avviare l'amplificazione clonale. Per il sequenziamento di nuova generazione, seguire le istruzioni visualizzate per inizializzare lo strumento.Al termine dell'amplificazione clonale, aprire la porta dello strumento Ion Chef, quindi aprire il coperchio della centrifuga di caricamento del truciolo e rimuovere i due chip dal sistema di preparazione della libreria. Posizionare i trucioli in contenitori separati per lo stoccaggio dei trucioli e caricare uno dei trucioli nel vano truciolo nello strumento. Quindi chiudere il coperchio del vano truciolo e iniziare il sequenziamento.Per l'analisi delle mutazioni, aprire il plug-in di analisi della copertura e utilizzare l'output di analisi della copertura per verificare la profondità di copertura e uniformità. Utilizzare il plug-in Torrent Variant Caller per eseguire la chiamata variante selezionando la linea germinale o il flusso di lavoro somatico a caso. Quindi scaricare i file di formato delle chiamate variante varianti filtrate e utilizzare il software di predittore dell'effetto variante nel database NCBI RefSeq per annotare le varianti.Per stimare le variazioni del numero di copia, utilizzare il plug-in uploader ion reporter per caricare i dati di sequenziamento nel software ion reporter e utilizzare il flusso di lavoro completo della coppia normale tumorale del pannello tumorale per analizzare i dati. Filtrare manualmente le mutazioni e le variazioni del numero di copia in base ai punteggi assegnati dal software e verificare visivamente le variazioni con il Visualizzatore genomico integrativo. Quindi ispezionare visivamente l'allineamento alla ricerca di letture insolite che possono generare chiamate artefatto e ispezionare la copertura normalizzata per tutte le ampliconi attraverso un determinato gene rispetto alla copertura normalizzata della linea di base per verificare le variazioni del numero di copia.Per ogni caso, indice la mutazione chiama dal sequenziamento del tessuto normale o del sangue o tumore primario o metastasi. Contrassegnare come linea germinale e scartare le chiamate che sono evidenti anche dai dati di sequenziamento del DNA della linea germinale. Contrassegnare come clonale o fondatore le mutazioni che sono condivise tra tutte le lesioni di un dato paziente.Quindi contrassegnare come sottoclonale o progress o le mutazioni rilevate in alcune ma non tutte le lesioni di un dato paziente. In questo esperimento rappresentativo, il sequenziamento multi-lesione di cinque casi di neoplasia pseudopapillare solida mirati alle sequenze codificanti di 409 geni correlati al cancro ha identificato un totale di 27 mutazioni somatiche in otto geni. Le mutazioni sono state definite come fondatrici o clonali se condivise tra tutte le lesioni di un dato paziente e progressor o sottoclonale quando rilevate in alcune ma non tutte le lesioni di un dato paziente.Coerentemente, la colorazione immunoistochimica per la betacatenina e il KMD6A era omogenea tra le diverse lesioni dei casi con mutazioni dei geni corrispondenti. La colorazione moderata per KMD6A in esemplari mutati suggerisce che l'alterazione genetica potrebbe alterare la funzione piuttosto che l'espressione della proteina. KMD6A perdita di funzione nei tumori pancreatici è associata alla regolazione verso l'alto del marcatore di ipossia GLUT-1.E di conseguenza, glut-1 era sovrascrivo nei casi con mutazioni del KMD6A. L'immunoistochimica per BAP1 e TP53 ha confermato che le mutazioni in quei geni erano subclonali. In questo cariotipo virtuale di un caso rappresentativo che mostra la posizione, la prossimità e lo stato del numero di copia dei geni alterati, l'analisi della variazione del numero di copia utilizzando i dati di sequenziamento ha rivelato alterazioni in tutti i campioni analizzati.E a differenza delle mutazioni puntili, la maggior parte delle alterazioni della variazione del numero di copia erano soclonali. La convalida e l'indicizzazione delle mutazioni e la variazione del numero di copia e l'utilizzo del normale confronto del DNA tumorale sono importanti per evitare la generazione di chiamate artefatto che potrebbero invalidare i risultati. Questa procedura potrebbe essere applicata anche agli studi di sequenziamento dell'intero genoma volti a interrogare l'intero genoma per l'identificazione della mutazione tra lesione di diversi tipi di tumore solido.Nel campo della ricerca sul cancro, queste tecniche sono strumenti critici per comprendere la biologia delle malattie con importanti implicazioni cliniche volte a progettare terapie mirate personalizzate ed efficaci.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Contestuali e Cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video Analizzare in topi

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Ricerca

Comportamento

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Misura di fronto-limbico Attività L&#39;utilizzo di un emotivo Oddball attività nei bambini con familiare ad alto rischio per la schizofrenia

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Valutazione sperimentale del mouse Socialità con un approccio Image Processing automatizzata

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Pavloviano Training Approach condizionati in Rats

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protocollo per la raccolta di dati e analisi applicata a Automated viso Tecnologia Espressione Analisi e analisi temporale per la valutazione organolettica

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Disturbi del comportamento: un approccio innovativo per monitorare gli effetti modulatori di una dieta Nutraceutical

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Trattamento dell'osteoartrite della caviglia con il rimontaggio totale della caviglia attraverso un metodo Transfibular laterale

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Uso di un sistema video-eEG wireless per monitorare le scariche epilettifore a seguito di lesioni cerebrali traumatiche indotte da liquido-percussioni laterali

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

Un approccio di Machine Learning alla progettazione di uno screening selettivo efficiente di un lieve danno cognitivo

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Valutazione della prensione qualificata nei topi utilizzando un auto-allenatore

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...