Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
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연구 결과는 이탈리아 암 게놈 프로젝트 (그랜트 번호)에 의해 지원되었습니다. FIRB RBAP10AHJB), 아소시아지오네 이탈리아나 리케르카 칸크로 (AIRC; 그랜트 번호 12182 에 AS 와 18178 VC), FP7 유럽 공동체 보조금 (캠 팩 No 602783 에 AS). 자금 조달 기관은 데이터의 수집, 분석 및 해석또는 원고 작성에 아무런 역할을하지 않았다.

연구에 사용된 자료는 특정 프로토콜에 따라 수집되었으며, 이는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 환자로부터 서면 으로 통보 된 동의가 가능했습니다.
1. 조직 표본의 조직학적 및 면역적 전형적 개정
참고 : 전문 병리학자는 이후에 설명 된 활동에 대한 책임이 있습니다.
<ol><li>잘 확립 된 진단 기준에 따라 선택된 경우의 조직 병리학 적 개...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

우리의 방법은 주어진 환자의 별개의 병변에서 수직 데이터 (즉, 형태학, DNA 염기서열 분석 및 면역 조직 화학)의 통합을 통해 고형 종양의 진행에 관여하는 분자 변이를 식별 할 수 있습니다. 우리는 409개의 암 관련 유전자8의 코딩 서열을 심문하여 돌연변이 침묵 종양 유형(즉, SPN, 췌장의 고체-가성세포 신생물)에서 클론 및 하부 클론 이벤트를 검출하는우리의 방법의 능력을 입...

차세대 염기서열 분석(NGS)의 출현은 암이 진단되고 치료되는 방식에 혁명을 일으켰습니다1. 다국지 시퀀싱에 결합된 NGS는 고형 종양2에서고종양 내 이질성(ITH)의 높은 정도를 노출시켰으며, 이는 부분적으로 다른 약물 민감성을 가진 서브클론의 존재로 인한 표적 치료의 실패를 설명한다2 . 게놈 전체 시퀀싱 연구에 의해 제기 된 중요한 도전은 개별 적인 암에 있는 승객 (즉, 중립) 및 드라이버 돌연변이 를 구별하는필요성입니다 3. 몇몇 연구 결과는 실제로, 특정 종양에서, 승객 돌연변이가 ITH의 대다수를 차지한다는 것을 보여주었습니다, 운전사 변경은 동일 개별의 병변 중 보존되는 경향이 있는 동안4. 또한 큰 돌연변이 부담 (폐암 및 흑색종에서 볼 수 있듯이)이 반드시 큰 종하 돌연변이 부담을 의미하지는 않는다는 것을 주의하는 것이 중요합니다2. 따라서, 높은 수준의 ITH는 낮은 돌연변이 부담을 가진 종양에서 발견될 수 있다.
전이는 전 세계적으로 암 관련 죽음의 90% 이상에 책임 있습니다5; 그러므로, 1 차및 전이성 병변 중 드라이버 유전자의 돌연변이 이질성을 포착하는 것은 고급 단계 질병을 위한 효과적인 치료의 디자인에 중요합니다. 임상 시퀀싱은 일반적으로 고정 된 조직에서 핵산에 수행, 때문에 가난한 DNA 품질의 게놈 전체 탐사 어려운 렌더링. 다른 한편으로는, 임상 순서의 의도는 주어진 치료 식이요법에 응답성/무반응을 예측할 수 있는 실행 가능한 돌연변이 및/또는 돌연변이를 확인하는 것입니다. 시퀀싱은 임상적으로 관련된 정보를 적시에 추출하기 위해 게놈의 작은 분획으로 제한될 수 있습니다. 낮은 처리량의 DNA 프로파일링(예: Sanger Sequencing)에서 NGS로의 전환은 수백 개의 암 관련 유전자를 높은 범위의 범위에서 분석할 수 있게 하여 종전 이벤트를 검출할 수 있게 합니다. 여기에서, 우리는 동일 개별에게서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에 설명된 방법은 세 가지 잘 확립된 접근법(조직학적 분석, 고커버리지 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석)을 통합하여 확인된 변이의 기능적 결과를 예측합니다. 접근법은 도 1에 개략적으로 설명되고 췌장의 고체 가성 신생물(SPN)의 5가지 전이성 사례의 연구에 적용되었다. 우리는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 견본의 처리 그리고 분석을 기술하는 동안, 동일 절차는 신선한 동결 조직에서 유전 물질에 적용될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

종양 내 이질성 (ITH)을 평가하는 것은 표적으로 한 치료의 실패를 예상하고 그에 따라 효과적인 항 종양 전략을 디자인하기 위하여 가장 중요합니다. 시료 처리 및 커버리지 의 깊이의 차이로 인해 우려가 자주 제기되지만, 고형 종양의 차세대 시퀀싱은 종양 유형 전반에 걸쳐 매우 가변적인 ITH 정도를 해명했습니다. 클론 및 전이성 집단의 식별을 통해 1 차 및 전이성 병변 사이의 유전 적 관련성을 포착하는 것은 사전 단계 질병에 대한 치료법의 설계에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 동일 환자에서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에서 기술된 실험적인 접근은 세 개의 잘 확립된 접근을 통합합니다: 조직학 분석, 고범위 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석. 부적절한 시료 처리에 의한 소동 적 사건 의 검출에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 우리는 신중한 병리학 검사와 신 생물 세포 농축에 조직을 실시했다. 신생물 병변 및 정상 조직으로부터의 품질 조절 DNA는 409개의 관련 암 유전자의 코딩 영역을 표적으로 하는 높은 커버리지 시퀀싱을 실시하였다. 제한된 게놈 공간만을 보는 동안, 우리의 접근은 주어진 환자에게서 명백한 병변에 있는 체세포 변경 (단 핵약 돌연변이 및 사본 수 변이) 중 이질성의 정도를 평가할 수 있습니다. 시퀀싱 데이터의 비교 분석을 통해 클론 과 하위 클론 변경을 구별할 수 있었습니다. ITH의 대다수는 수시로 승객 돌연변이에 기인합니다; 그러므로, 우리는 또한 돌연변이의 기능적인 결과를 예측하기 위하여 면역성 화학을 이용했습니다. 이 프로토콜은 특정 종양 모형에 적용되는 동안, 우리는 여기에서 기술된 방법론이 그밖 고형 종양 모형에 광범위하게 적용가능하다는 것을 예상합니다.

스터디 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 409개의 암 관련 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 5개의 SPN 케이스의 다중 병변 (n=13) 염기서열 분석은 8개의 유전자에서 총 27개의 체세포 돌연변이를확인하였다(CTNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1및 FGFR3). 돌연변이는 주어진 환자의 모든 병변 사이에서 공유될 때 창립자/클로...

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Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

우리의 프로토콜은 질병 진행에 관련있는 분자 변경의 확인을 통해 1 차및 전이성 병변 사이 유전 관련성의 포착을 허용합니다. 우리의 방법은 높은 감도와 특이성을 가진 임상 견본에 있는 유전 관련성을 탐구하는 기회를 제공합니다. 이것은 분자 및 조직 병리학 분석의 통합 때문입니다.암 연구 분야에서 종양 이질성의 평가는 효과적인 항종양 전략을 설계하는 데 가장 중요하며 우리의 방법은 많은 고형 종양 유형에 광범위하게 적용됩니다. 관심 있는 라이브러리를 준비하고 정량화한 후 각 라이브러리를 뉴클레아제 없는 물에 100피코몰라 농도로 희석하고 각 희석 된 라이브러리의 10 마이크로리터를 결합하여 단일 튜브에서 단일 실행을 합니다. 그런 다음 파이펫팅으로 풀로 풀이 된 라이브러리를 혼합합니다.시퀀싱 실행을 시작하려면 먼저 시퀀싱 시스템에 연결된 컴퓨터에서 토런트 브라우저를 엽니다. 선택한 응용 프로그램에 대한 일반 템플릿을 사용하여 키트 탭에서 이온 양성자 시스템 또는 이온 진 스튜디오 S5 시스템을 선택하여 새 실행을 계획합니다. 칩 유형 드롭다운 메뉴에서 적절한 칩을 선택하고 라이브러리 키트 드롭다운 목록에서 Ion AmpliSeq 2.0 라이브러리 키트를 선택합니다.템플릿 키트에 대한 Ion Chef 버튼을 선택하고 템플릿 키트 드롭다운 목록에서 적절한 Chef 키트를 선택합니다. 시퀀싱 키트 드롭다운 메뉴에서 적절한 시퀀싱 키트를 선택하고 바코드 세트 드롭다운 목록에서 Ion Express를 선택합니다. 플러그인 탭에서 커버리지 분석 플러그인을 선택합니다.계획 탭에서 참조 라이브러리 드롭다운 목록에서 GRCH37HG19 게놈을 선택합니다. 대상 지역 드롭다운 목록에서 시퀀스할 적절한 패널을 선택합니다. 그런 다음 시퀀시할 바코드 수를 설정하고 각 라이브러리에 대한 바코드 이름과 샘플 이름을 설정합니다.풀이 된 라이브러리 희석의 경우, 핵이 없는 물로 스톡 라이브러리를 25 피코몰라 농도로 희석하여 각 희석 된 라이브러리의 이온 양성자 칩 및 파이펫 50 마이크로리터를 적절한 라이브러리 샘플 튜브의 바닥으로 희석하십시오. 풀링된 희석 라이브러리를 포함하는 샘플 튜브를 라이브러리 준비 시스템에 로드하고 복제 증폭을 시작합니다. 차세대 시퀀싱의 경우 화면 의 지침을 따라 계측기를 초기화합니다.복제 증폭이 완료되면 Ion Chef 계기문을 열고 칩 로딩 원심분리기의 뚜껑을 열고 라이브러리 준비 시스템에서 두 개의 칩을 제거합니다. 칩을 별도의 칩 저장 용기에 넣고 칩 중 하나를 계측기의 칩 컴파트먼트에 로드합니다. 그런 다음 칩 구획 뚜껑을 닫고 시퀀싱을 시작합니다.돌연변이 분석을 위해 커버리지 분석 플러그인을 열고 커버리지 분석 출력을 사용하여 커버리지 및 균일성을 확인합니다. 토런트 변형 발신자 플러그인을 사용하여 세균 선 또는 체세포 워크플로우를 적절하게 선택하는 변형 호출을 수행합니다. 그런 다음 필터링된 변형 호출 형식 파일을 다운로드하고 NCBI RefSeq 데이터베이스의 변형 효과 예측 변수 소프트웨어를 사용하여 변형에 대해 알테를 지정합니다.복사 수 변동을 추정하려면 이온 리포터 업로더 플러그인을 사용하여 이온 리포터 소프트웨어에 시퀀싱 데이터를 로드하고 포괄적인 암 패널 종양 정상 쌍 워크플로우를 사용하여 데이터를 분석합니다. 소프트웨어가 할당한 점수에 따라 돌연변이 및 복사 수 변형을 수동으로 필터링하고 통합 유전체학 뷰어를 시각적으로 변형을 확인합니다. 그런 다음 체형 호출을 생성할 수 있는 특이한 읽기에 대한 정렬을 시각적으로 검사하고 기준선의 정규화된 커버리지에 대해 주어진 유전자에 걸쳐 모든 앰플리턴에 대한 정규화된 커버리지를 검사하여 카피 수 변이를 확인합니다.각각의 경우에 대해, 돌연변이는 정상 조직 또는 혈액 또는 1차 종양 또는 전이의 시퀀싱으로부터 호출된다. 세균 선으로 플래그를 표시하고 또한 세균 선 DNA의 시퀀싱 데이터에서 분명 호출을 폐기. 클론 또는 설립자로 지정된 환자의 모든 병변 사이에서 공유되는 돌연변이를 플래그.그런 다음 특정 환자의 병변을 전부는 아니지만 일부에서 검출되는 돌연변이를 서브클론 또는 진행자로 플래그를 지정합니다. 본 대표적인 실험에서, 409개의 암 관련 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 5개의 고체 의사도파필라신생물의 다중 병변 염기서열분석은 8개의 유전자에 있는 총 27개의 체질 돌연변이를 확인하였다. 돌연변이는 주어진 환자의 일부 그러나 전부병변에서 검출될 때 주어진 환자 및 진행자 또는 과감의 모든 병변 사이에서 공유될 때 창립자 또는 클로날로 정의되었습니다.일관되게, 베타 카테닌및 KMD6A를 위한 면역히스토케미칼 염색은 해당 유전자의 돌연변이를 가진 케이스의 다양한 병변 사이에서 균질하였다. 돌연변이 된 표본에서 KMD6A에 대한 적당한 염색은 유전 적 변경이 단백질의 발현보다는 기능을 변경하기 위하여 확률이 높다는 것을 건의합니다. KMD6A 췌장 종양에서 기능의 손실은 저산소증 마커 GLUT-1의 최대 조절과 연관된다.그리고 이에 따라, GLUT-1은 KMD6A 돌연변이를 베어링하는 경우에 과도하게 발현되었다. BAP1 및 TP53에 대한 면역 조직 화학은 그 유전자에 있는 돌연변이가 청가이었다는 것을 확인했습니다. 변경된 유전자의 위치, 근접 성 및 복사 수 상태를 나타내는 대표적인 사례의 가상 karyotype에서, 시퀀싱 데이터를 이용한 카피 수 변이 분석은 분석된 모든 표본에서 변화를 드러냈다.그리고 점 돌연변이와는 달리, 카피 수 변이 변경의 대부분은 서브클론이었다. 돌연변이 및 복사 수 변이의 유효성 검사 및 인덱싱 및 종양 정상 DNA 비교를 사용하여 결과를 무효화할 수 있는 관절상 호출의 생성을 피하는 데 중요합니다. 이 절차는 또한 다른 고형 종양 모형의 병변 사이 돌연변이의 확인을 위한 전체 게놈을 심문하기 위한 전체 게놈 순서연구결과에 적용될 수 있었습니다.암 연구 분야에서, 이 기술은 개인화되고 효과적인 표적으로 한 치료를 디자인하기 위한 중요한 임상 연루를 가진 질병의 생물학을 이해하기 위한 중요한 공구입니다.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

마우스에서 비디오 분석 시스템을 사용하여 콘텐츠 및 시작됨 공포 컨디셔닝 테스트

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

연구

행동분석학

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

정신 분열증에 대한 가족 성 위험이 높은 아동의 정서적 괴짜 작업을 사용하여 이마 관자 - 변연계의 활동의 측정

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

자동화 된 이미지 처리 방식을 사용하여 마우스 사교성의 실험 평가

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

흰쥐의 파블로프 조건 접근 교육

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

관능 평가를위한 데이터 수집 및 자동화 표정 분석 기술에 대한 분석 응용 및 시간적 분석을위한 프로토콜

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

행동 교란하십시오 기능 식품 다이어트의 조절 성 효과를 모니터하는 혁신적인 접근 방식

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

측면 Transfibular 방식을 통해 총 발목 보충 발목 관절염의 치료

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

무선 비디오-EEG 시스템 사용으로 측면 유체-타악기 유도 외상성 뇌 손상 다음 간질 방전 모니터링

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

경도 인지 장애의 효율적인 선택적 스크리닝을 설계하는 기계 학습 접근 방식

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

자동 트레이너를 사용하여 마우스에서 숙련된 사전 평가

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...