Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Studien ble støttet av den italienske kreft Genova Project (Grant no. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Grant no. 12182 til AS og 18178 til VC), FP7 European Community Grant (cam-PAC no 602783 til AS). Finansierings byråene hadde ingen rolle i innsamlingen, analysen og tolkningen av data eller i skrivingen av manuskriptet.

Materialet som ble brukt i studien ble samlet inn under en spesifikk protokoll som ble godkjent av den lokale etikk komitéen. Skriftlig informert samtykke fra alle pasientene var tilgjengelig.
1. histologiske og immunophenotypical revisjon av vevsprøver
Merk: en ekspert patologen er ansvarlig for aktiviteter beskrevet heretter.
<ol><li>Histopathological revisjon av Utvalgte tilfeller i henhold til veletablerte diagnostiske kriterier.<ol>
<li>Bruk mikrotomen til ...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Vår metode gjør det mulig å identifisere molekylære endringer involvert i progresjon av solide svulster gjennom integrering av vertikale data (dvs. morfologi, DNA-sekvensering, og immunhistokjemi) fra forskjellige lesjoner av en gitt pasient. Vi demonstrerte evnen til vår metode for å oppdage klonal og subclonal hendelser i en mutational lydløs tumor type (dvs. SPN, solid-pseudopapillary neoplasma i bukspyttkjertelen) ved forhører koding sekvenser av 409 kreft relevante gener8. En fordel m...

Ankomsten av neste generasjon sekvensering (NGS) har revolusjonert måten kreft er diagnostisert og behandlet1. NGS koplet til fler regionale sekvensering har eksponert en høy grad av intra-tumoral heterogenitet (i) i solide svulster2, noe som forklarer delvis svikt i målrettet terapi på grunn av tilstedeværelsen av subclones med ulike medikament følsomhet2 . En viktig utfordring utgjøres av Genova-Wide sekvensering studier er nødvendigheten av å skille mellom passasjer (dvs. nøytral) og driver mutasjoner i enkelte krefttre. Flere studier har faktisk vist at i visse svulster er passasjer mutasjoner rede for flertallet av i., mens driver endringer har en tendens til å bli bevart blant lesjoner av samme person4. Det er også viktig å merke seg at store mutational byrde (som sett i lungekreft og melanom) ikke nødvendigvis innebærer en stor subclonal mutational byrde2. Derfor kan en høy grad av i... bli funnet i svulster med lav mutational byrde.
Metastaser er ansvarlig for mer enn 90% av kreft-relaterte dødsfall over hele verden5; Derfor er det å fange opp de mutational heterogenitet av driver gener blant primær-og metastatisk lesjoner avgjørende for utformingen av effektive terapier for avanserte fase sykdommer. Klinisk sekvensering er vanligvis utført på nukleinsyre syrer fra fast vev, som gjengir Genova hele leting vanskelig på grunn av dårlig DNA-kvalitet. På den annen side er hensikten med klinisk sekvensering å identifisere praktiske mutasjoner og/eller mutasjoner som kan forutsi respons/fungere bedre til en gitt terapeutisk diett. Som det står, kan sekvensering begrenses til en mindre brøkdel av Genova for rettidig utvinning av klinisk relevant informasjon. Overgangen fra DNA-profilering med lav gjennomstrømning (f.eks. sanger sekvensering) til NGS har gjort det mulig å analysere hundrevis av kreft relevante gener på en høy deknings dybde, noe som gjør det mulig å oppdage subclonal hendelser. Her rapporterer vi en metode for sammenlignende lesjoner analyse som gjør det mulig for identifisering av klonal og subclonal populasjoner mellom ulike eksemplarer fra samme individ. Metoden beskrevet her integrerer tre veletablerte tilnærminger (histologiske analyse, høy-dekning multi-lesjon sekvensering, og immunophenotypic analyser) for å forutsi funksjonelle konsekvenser av variantene identifisert. Tilnærmingen er skjematisk beskrevet i figur 1 og har blitt anvendt på studiet av 5 metastatisk tilfeller av solide pseudopapillary svulster (SPNer) i bukspyttkjertelen. Mens vi beskriver prosessering og analyse av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vevsprøver, kan den samme fremgangsmåten påføres genetisk materiale fra fersk-frosset vev.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Vurdering intra-tumoral heterogenitet (i) er av overordnet betydning for å forutse svikt i målrettede terapier og design følgelig effektive anti-tumor strategier. Selv om bekymringer er ofte reist på grunn av forskjeller i utvalg behandling og dybde av dekning, neste generasjons sekvensering av solide svulster har unraveled en svært variabel grad av i over tumor typer. Å fange de genetiske Relatedness mellom primære og metastatisk lesjoner gjennom identifisering av klonal og subclonal populasjoner er avgjørende for utformingen av terapi for fremskritt-stadium sykdommer. Her rapporterer vi en metode for sammenlignende lesjoner analyse som gjør det mulig for identifisering av klonal og subclonal populasjoner mellom ulike eksemplarer fra samme pasient. Den eksperimentelle tilnærmingen som beskrives her integrerer tre veletablerte tilnærminger: histologiske analyse, høy dekning multi-lesjon sekvensering, og immunophenotypic analyser. For å minimere virkningene på påvisning av subclonal hendelser ved upassende prøve behandling, vi utsatt vev til forsiktig patologisk undersøkelse og neoplastic celle berikelse. Kvalitetskontrollert DNA fra neoplastic lesjoner og normal vev ble deretter utsatt for høy dekning sekvensering, rettet mot koding regionene i 409 relevante kreft gener. Mens vi bare ser på et begrenset genomisk rom, gjør vår tilnærming det mulig å evaluere omfanget av heterogenitet blant somatiske endringer (nukleotid mutasjoner og kopierings nummer variasjoner) i forskjellige lesjoner fra en gitt pasient. Gjennom sammenlignende analyse av sekvensering data, var vi i stand til å skille klonal g. subclonal endringer. Flertallet av i. er ofte tilskrevet passasjer mutasjoner; Derfor brukte vi også immunhistokjemi til å forutsi funksjonelle konsekvenser av mutasjoner. Selv om denne protokollen har blitt brukt på en bestemt tumor type, forventer vi at metodikken beskrevet her er bredt gjelder for andre solide tumor typer.

Arbeidsflyten for studien er illustrert i figur 1. Multi-lesjoner (n = 13) sekvensering av 5 SPN tilfeller rettet mot koding sekvenser av 409 Cancer relaterte gener identifisert totalt 27 somatiske mutasjoner i 8 gener (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1og FGFR3). Mutasjoner ble definert som grunnlegger/klonal når de deles mellom alle lesjoner av en gitt pasient, og progressor/subclonal når oppdaget i noen, m...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Denne artikkelen beskriver en metode for å identifisere klonal og subclonal endringer mellom forskjellige prøver fra en gitt pasient. Selv om eksperimenter beskrevet her fokus på en bestemt tumor type, tilnærmingen er bredt gjelder for andre solide svulster.

Sammenlignende lesjoner analyse gjennom en målrettet sekvensering Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Vår protokoll tillater fangst av genetisk relaterthet mellom primære og metastatiske lesjoner gjennom identifisering av molekylære endringer involvert i sykdomsprogresjon. Vår metode gir mulighet til å utforske genetisk relaterthet i klinisk prøve med høy følsomhet og spesifisitet. Dette skyldes integrering av molekylær og histopatologisk analyse.Vurderingen av intratumor heterogenitet i kreftforskningsfeltet er av avgjørende betydning for å utforme effektive anti-tumorstrategier, og vår metode gjelder bredt for mange solide tumortyper. Etter å ha forberedt og kvantifisere bibliotekene av interesse, fortynne hvert bibliotek til en 100 picomolar konsentrasjon i kjernefritt vann og kombinere 10 mikroliter av hvert fortynnet bibliotek for en enkelt kjøring i et enkelt rør. Bland deretter de samlede bibliotekene ved pipettering.Hvis du vil starte en sekvenseringskjøring, åpner du først Torrent-nettleseren på en datamaskin som er koblet til sekvenseringssystemet. Planlegg en ny kjøring ved hjelp av den generiske malen for det valgte programmet, og velg Ion Proton-system eller Ion Gene Studio S5-system under kategorien kits. Velg riktig chip fra rullegardinmenyen chip type og velg Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit fra rullegardinlisten for biblioteksett.Velg Ion Chef-knappen for malsettet, og velg riktig Chef Kit fra rullegardinlisten for malsettet. Velg riktig sekvenseringssett fra rullegardinmenyen sekvenseringssett, og velg Ion Express fra rullegardinlisten for strekkodesett. Velg plugin-modulen for dekningsanalyse under plugin-fanen.Under kategorien plan velger du GRCH37HG19-genomet fra rullegardinlisten referansebibliotek. Velg det aktuelle panelet som skal sekvenseres, fra rullegardinlisten målområder. Angi deretter antall strekkoder som skal sekvenseres, og angi strekkodenavnet og eksempelnavnet for hvert bibliotek.For en samlet bibliotekfortynning, fortynne lagerbiblioteket med kjernefritt vann til en 25 picomolar konsentrasjon for en ion proton chip og pipette 50 mikroliter av hvert fortynnet bibliotek til bunnen av riktig bibliotek prøverør. Last inn prøverør som inneholder de samlede fortynnede bibliotekene på bibliotekets forberedelsessystem og start klonalforsterkningen. For neste generasjons sekvensering følger du instruksjonene på skjermen for å initialisere instrumentet.Når klonalforsterkning er ferdig, åpne Ion Chef instrumentdøren, åpne deretter lokket på chip lasting sentrifuge og fjerne de to chips fra biblioteket forberedelsessystemet. Legg sjetongene i separate sjetongbeholdere og legg en av sjetongene inn i sponrommet i instrumentet. Lukk deretter lokket på brikkerommet og start sekvenseringen.For mutasjonsanalyse, åpne dekningsanalyseplugin og bruk dekningsanalyseutdataene til å verifisere dybden av dekning og ensartethet. Bruk Torrent Variant Caller plugin for å utføre varianten kaller velge bakterielinjen eller somatisk arbeidsflyt etter behov. Last deretter ned filtrerte varianter variant samtale formatfiler og bruke variant effekt prediktor programvare i NCBI RefSeq database for å kommentere varianter.Hvis du vil estimere variasjonene for kopinummer, bruker du plugin-modulen for ionreporteropplaster til å laste inn sekvenseringsdataene i ionreporterprogramvaren og bruke den omfattende arbeidsflyten for vanlig pararbeidsflyt for kreftpanel til å analysere dataene. Filtrer mutasjonene og kopinummervariasjonene manuelt basert på resultatene som er tilordnet av programvaren, og kontroller variasjonene visuelt med Integrative Genomics Viewer. Deretter visuelt inspisere justeringen for uvanlige leser som kan generere artefaktlige samtaler og inspisere normalisert dekning for alle amplicons over et gitt gen mot normalisert dekning av grunnlinjen for å verifisere kopi-tall variasjoner.For hvert tilfelle, indekser mutasjonen kaller fra sekvensering av normalt vev eller blod eller primær tumor eller metastase. Flagg som bakterielinje og kast samtaler som også er tydelige fra sekvenseringsdataene til bakterielinje DNA. Flagg som klonisk eller grunnlegger mutasjonene som deles mellom alle lesjoner av en gitt pasient.Deretter flagger du som subklonal eller utviklermutasjonene som oppdages i noen, men ikke alle lesjonene til en gitt pasient. I dette representative eksperimentet identifiserte multilesjonssekvensering av fem solide pseudopapillary neoplasmatilfeller rettet mot kodesekvensene til 409 kreftrelaterte gener totalt 27 somatiske mutasjoner i åtte gener. Mutasjoner ble definert som grunnlegger eller kloniske når de deles mellom alle lesjonene til en gitt pasient og progressor eller subklonal når det oppdages i noen, men ikke alle lesjonene til en gitt pasient.Konsekvent var immunohistokjemisk farging for betakatenin og KMD6A homogen blant de ulike lesjonene i tilfeller med mutasjoner av tilsvarende gener. Den moderate fargingen for KMD6A i muterte prøver tyder på at genetisk endring sannsynligvis vil endre funksjonen i stedet for uttrykket av proteinet. KMD6A tap av funksjon i bukspyttkjertelsvulster er forbundet med oppregulering av hypoksimarkøren GLUT-1.Og ldigvis var GLUT-1 over uttrykt i tilfeller som bærer KMD6A mutasjoner. Immunohistochemistry for BAP1 og TP53 bekreftet at mutasjoner i disse genene var subklonale. I denne virtuelle karyotypen av et representativt tilfelle som viser plasseringen, nærheten og kopinummerstatusen til endrede gener, viste analyse av kopinummervariasjon ved hjelp av sekvenseringsdata endringer i alle prøvene som ble analysert.Og i motsetning til punktmutasjoner var de fleste variasjonsendringer med kopinummer subklonale. Validering og indeksering av mutasjoner og variasjon av kopinummer og bruk av svulsten normal DNA-sammenligning er viktig for å unngå generering av artefaktiske samtaler som kan ugyldiggjøre resultatene. Denne prosedyren kan også brukes på hele genomsekvenseringsstudier som tar sikte på å avhøre hele genomet for identifisering av mutasjon mellom lesjon av forskjellige faste tumortyper.På kreftforskningsfeltet er disse teknikkene kritiske verktøy for å forstå biologien til sykdommer med viktige kliniske implikasjoner som tar sikte på å designe personlige og effektive målrettede terapier.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Kontekstuell og spolt Fear Conditioning Test Bruke en video Analysere System i Mus

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Måling av Fronto-limbiske aktivitet Bruke en emosjonell Oddball Task hos barn med familiær høy risiko for schizofreni

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Eksperimentell Vurdering av Mouse Omgjengelighet hjelp av en automatisert bildebehandling Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Pavlovian kondisjonerte Approach Opplæring i Rats

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protokoll for datainnsamling og analyse for automatiserte Facial Expression Analysis Teknologi og Temporal analyse for sensorisk evaluering

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Adferdsforstyrrelser: en innovativ tilnærming til å overvåke regulerende effekt av en nutraceutical Diet

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Ankel pruritic totale ankel erstatning gjennom en Lateral Transfibular tilnærming

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Bruk av en Wireless video-EEG system for å overvåke epileptiform utslipp etter lateral Fluid-perkusjon indusert Traumatisk Brain skade

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

En maskin lærings tilnærming for å designe en effektiv selektiv screening av mild kognitiv svekkelse

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Evaluere dyktige Prehension i mus bruke en auto-Trainer

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...