Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Исследование было поддержано итальянским проектом по геному рака (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Грант No 12182 в AS и 18178 в VC), FP7 Европейского сообщества Грант (Cam-Pac No 602783 в AS). Финансируя учреждения не принимали никакого роли в сборе, анализе и толковании данных или в написании рукописи.

Материалы, использованные в исследовании, были собраны в соответствии с конкретным протоколом, который был одобрен местным комитетом по этике. Было получено письменное информированное согласие всех пациентов.
1. Гистологический и иммунофенотипический пересмотр образцо?...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Наш метод позволяет выявить молекулярные изменения, участвующие в прогрессировании твердых опухолей, путем интеграции вертикальных данных (т.е. морфологии, секвенирования ДНК и иммуногистохимии) от различных поражений данного пациента. Мы продемонстрировали способность нашего метод...

Появление следующего поколения секвенирования (NGS) революционизировал способ рака диагностируется и лечится1. NGS в сочетании с межрегиональным секвенированием выявили высокую степень внутриопухолевой неоднородности (ITH) в твердых опухолях2, что частично объясняет провал целевой терапии из-за присутствия субклонов с различной чувствительностью к лекарственным препаратам2 . Важной проблемой, поставленной в ходе исследований секвенирования генома, является необходимость проведения различия между мутациями пассажира (т.е. нейтрального) и драйвера при индивидуальных раковых заболеваниях3. Несколько исследований действительно показали, что при некоторых опухолях, пассажирские мутации составляют большинство ITH, в то время как изменения водителя, как правило, сохраняются среди поражений одного и того же человека4. Важно также отметить, что большая мутационная нагрузка (как это видно при раке легких и меланоме) не обязательно подразумевает большое субклональное бремя мутаций2. Таким образом, высокая степень ITH может быть найдена в опухолях с низкой мутационной нагрузкой.
Метастаза являются причиной более 90% смертей, связанных с раком во всем мире5; Поэтому, захват мутационной неоднородности генов драйверов среди первичных и метастатических поражений имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения заболеваний на поздних стадиях. Клиническое секвенирование обычно проводится на нуклеиновых кислотах из фиксированных тканей, что затрудняет исследование генома из-за низкого качества ДНК. С другой стороны, цель клинического секвенирования заключается в выявлении действенных мутаций и/или мутаций, которые могут предсказать отзывчивость/безответственность к данному терапевтическому режиму. В его нынешнем виде секвенирование может быть ограничено меньшей долей генома для своевременной извлечения клинически релевантной информации. Переход от профилирования ДНК с низкой пропускной способностью (например, Секвенирование Сэнгера) к NGS позволил проанализировать сотни генов, имеющих отношение к раку, на высокой глубине охвата, что позволяет выявлять субклональные события. Здесь мы сообщаем о методе анализа сравнительных поражений, который позволяет идентифицировать клональные и подклональные популяции между различными образцами одного и того же человека. Описанный здесь метод объединяет три хорошо зарекомендовавших себя подхода (гистологический анализ, секвенирование с высоким уровнем охвата и иммунофенотипический анализ) для прогнозирования функциональных последствий выявленных вариаций. Этот подход схематично описан на рисунке 1 и применяется к изучению 5 метастатических случаев твердых псевдопапиллярных неоплазм (SPNs) поджелудочной железы. В то время как мы описываем обработку и анализ формалина-фиксированного парафина-встроенных (FFPE) образцов ткани, та же процедура может быть применена к генетическому материалу из свежезамороженной ткани.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Оценка внутриопухолевой неоднородности (ITH) имеет первостепенное значение для прогнозирования отказа целевых методов лечения и разработки соответственно эффективных противоопухолевых стратегий. Хотя опасения часто возникают из-за различий в обработке образцов и глубине покрытия, последовательность твердых опухолей следующего поколения распутала весьма изменчивую степень ITH по типам опухолей. Захват генетической родственности между первичными и метастатическими поражениями путем выявления клональных и субклональных популяций имеет решающее значение для разработки методов лечения заболеваний на запредлечных стадиях. Здесь мы сообщаем о методе анализа сравнительных поражений, который позволяет идентифицировать клональные и подклональные популяции между различными образцами одного и того же пациента. Описанный здесь экспериментальный подход объединяет три хорошо зарекомендовавших себя подхода: гистологический анализ, секвенирование с высоким уровнем поражения и иммунофенотипический анализ. Для того, чтобы свести к минимуму воздействие на обнаружение субклональных событий путем неправильной обработки образцов, мы подвергли ткани тщательному патологическому исследованию и обогащению неопластических клеток. Контрольная качественная ДНК от неопластических поражений и нормальных тканей была затем подвергнута высокому секвенированию покрытия, ориентируясь на области кодирования 409 соответствующих генов рака. Рассматривая только ограниченное геномное пространство, наш подход позволяет оценить степень неоднородности между соматическими изменениями (однонуклеотидные мутации и вариации числа копий) в различных поражениях от данного пациента. Благодаря сравнительному анализу данных секвенирования мы смогли различать клональные и субклональные изменения. Большинство ITH часто приписывают пассажирские мутации; Поэтому мы также использовали иммуногистохимию для прогнозирования функциональных последствий мутаций. Хотя этот протокол был применен к определенному типу опухоли, мы ожидаем, что описанная здесь методология в целом применима к другим твердым типам опухолей.

Рабочий процесс исследования иллюстрируется на рисунке 1. Многопоражения (n No 13) секвенирование 5 случаев SPN, нацеленных на последовательности кодирования 409 генов, связанных с раком, выявили в общей сложности 27 соматических мутаций в 8 генах(CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

В этой статье описывается метод выявления клональных и субклональных изменений между различными образцами от данного пациента. Хотя описанные здесь эксперименты сосредоточены на определенном типе опухоли, этот подход в целом применим к другим твердым опухолям.

Сравнительный анализ поражений с помощью целевого подхода к секвенированию

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Наш протокол позволяет зафиксировать генетическую связь между первичными и метастатическими поражениями путем выявления молекулярных изменений, связанных с прогрессированием заболевания. Наш метод дает возможность исследовать генетическую родственность в клиническом образце с высокой чувствительностью и специфичностью. Это связано с интеграцией молекулярного и гистопатологического анализа.Оценка внутриопухолевая неоднородность в области исследований рака имеет первостепенное значение при разработке эффективных противоопухолевых стратегий, и наш метод широко применим ко многим типам твердых опухолей. После подготовки и количественной оценки библиотек, представляющих интерес, разбавить каждую библиотеку до 100 пикомолярной концентрации в нуклеазной воде и объединить 10 микролитров каждой разбавленной библиотеки для одного запуска в одной трубке. Затем смешайте объединенные библиотеки с помощью пипетки.Чтобы инициировать секвенирование запуска, сначала откройте браузер Torrent на компьютере, подключенном к системе секвенирования. Запланируйте новый запуск с использованием общего шаблона для выбранного приложения и под вкладкой комплектов выберите систему Ion Proton или систему Ion Gene Studio S5. Выберите соответствующий чип из меню высадки типа чипа и выберите библиотечный набор Ion AmpliSeq 2.0 из списка высадок библиотечного комплекта.Выберите кнопку Ion Chef для набора шаблонов и выберите соответствующий комплект шеф-повара из списка отсечки комплекта шаблонов. Выберите соответствующий комплект секвенирования из меню секвенирования комплекта высадки и выберите Ion Express из списка высадок штрих-кодов. Под вкладкой плагина выберите плагин анализа покрытия.В соответствии с вкладкой плана выберите геном GRCH37HG19 из списка отсева справочной библиотеки. Из списка отсеек целевых регионов выберите соответствующую панель, которая будет секвенирована. Затем установите количество штрих-кодов, которые будут секвенированы, и установите имя штрих-кода и имя образца для каждой библиотеки.Для разбавления объединенных библиотек разбавить фондовую библиотеку водой без нуклеазы до 25 пикомолярной концентрации для ионного протонного чипа и пипетки 50 микролитров каждой разбавленной библиотеки на дно соответствующей библиотеки образца трубки. Загрузите пробные трубки, содержащие объединенные разбавленные библиотеки, в систему подготовки библиотек и начните клоническое усиление. Для последовательности следующего поколения следуйте инструкциям на экране для инициализации инструмента.Когда клоническое усиление будет закончено, откройте дверь инструмента Ion Chef, затем откройте крышку центрифуги загрузки чипа и удалите две фишки из системы подготовки библиотеки. Поместите чипы в отдельные контейнеры для хранения чипов и загрузите одну из микросхем в отсек чипа в приборе. Затем закройте крышку чипового отсека и начните секвенирование.Для анализа мутаций откройте плагин анализа покрытия и используйте результаты анализа покрытия для проверки глубины охвата и единообразия. Используйте плагин Torrent Variant Caller для выполнения варианта вызова выбора зародышевой линии или соматический рабочий процесс по мере необходимости. Затем загрузите фильтрованные варианты вариантов файлов формата вызова и используйте программное обеспечение предиктора эффекта варианта в базе данных NCBI RefSeq, чтобы аннотировать варианты.Чтобы оценить вариации копий-числа, используйте плагин загрузчик ионных репортеров для загрузки данных секвенирования в программное обеспечение ионных репортеров и использовать всеобъемлющий рабочий процесс опухоли панели рака нормальной пары для анализа данных. Вручную фильтруйте мутации и вариации копий на основе баллов, назначенных программным обеспечением, и проверяйте вариации визуально с помощью интегративного зрителя геномики. Затем визуально проинспектируйте выравнивание для необычных считываний, которые могут генерировать артефактные вызовы и проверить нормализованное покрытие для всех ампликонов через данный ген против нормализованного покрытия базового уровня для проверки вариаций числа копий.Для каждого случая, индекс мутации звонки от секвенирования нормальной ткани или крови или первичной опухоли или метастазов. Пометить как зародыш линии и отказаться звонки, которые также очевидны из секвенирования данных зародышевой линии ДНК. Пометить в качестве клона или основателя мутации, которые разделяются между всеми поражениями данного пациента.Затем пометить в качестве субклонального или прогрессора мутации, которые обнаруживаются в некоторых, но не все поражения данного пациента. В этом репрезентативном эксперименте секвенирование нескольких поражений пяти твердых псевдопапилярных неоплазмных случаев, направленных на кодирование последовательностей 409 генов, связанных с раком, выявило в общей сложности 27 соматических мутаций в восьми генах. Мутации были определены как основатель или клональный, когда разделяют между всеми поражениями данного пациента и прогрессора или субклонального при обнаружении в некоторых, но не все поражения данного пациента.Последовательно иммуногистохимическое окрашивание для бета-катенина и KMD6A было однородным среди разнообразных поражений случаев с мутациями соответствующих генов. Умеренное окрашивание KMD6A в мутировавших образцах предполагает, что генетическое изменение может изменить функцию, а не экспрессию белка. Потеря функции KMD6A в опухолях поджелудочной железы связана с регуляцией гипоксии маркера GLUT-1.И соответственно, GLUT-1 был более выражен в случаях, несущих мутации KMD6A. Иммуногистохимия для BAP1 и TP53 подтвердила, что мутации в этих генах были субклональными. В этом виртуальном кариотипе репрезентативного случая, показывающего расположение, близость и статус числа копий измененных генов, анализ вариаций копий с использованием данных секвенирования выявил изменения во всех анализируемых образцах.И в отличие от точечных мутаций, большинство изменений вариации копий были субклональными. Проверка и индексация мутаций и вариации копий и числа и использование опухоли нормальное сравнение ДНК имеют важное значение для избежания генерации артефактных вызовов, которые могли бы признать результаты недействительными. Эта процедура также может быть применена к исследованиям секвенирования всего генома, направленным на изучение всего генома для выявления мутаций между поражениями различных типов твердых опухолей.В области исследований рака эти методы являются важнейшими инструментами для понимания биологии заболеваний с важными клиническими последствиями, направленными на разработку персонализированных и эффективных целевых методов лечения.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Контекстная и подают реплики Страх принадлежности Тест Использование видео параметры системы у мышей

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Измерение лобно-лимбической деятельности, используя эмоциональном чудак Задача у детей с семейной высокий риск шизофрении

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Экспериментальная оценка мыши Общительность с помощью автоматизированной обработки изображений подход

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Павлова кондиционером подход к обучению у крыс

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Протокол для сбора и анализа данных прикладной к автоматизированным мимические технологии анализа и временного анализа для сенсорной оценке

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Поведенческие Помехи: инновационный подход к монитору модулирующего эффекты Nutraceutical диета

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Лечение артроза голеностопного сустава с заменой всего лодыжки через боковой Transfibular подход

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Использование беспроводной системы видеоэЭГ для мониторинга эпилептиформных разрядов после боковой жидкости-перкуссии индуцированной травматического повреждения головного мозга

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

Подход машинного обучения к разработке эффективного селективного скрининга мягких когнитивных нарушений

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Оценка квалифицированных Предениза в мышах с помощью авто-тренер

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...