Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
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El estudio fue apoyado por el Proyecto Génova Del Cáncer Italiano (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Concesión No 12182 a AS y 18178 a VC), 77 Subvención de la Comunidad Europea (Cam-Pac No 602783 a AS). Los organismos de financiación no tuvieron ningún papel en la recopilación, análisis e interpretación de datos ni en la redacción del manuscrito.

El material utilizado en el estudio fue recogido bajo un protocolo específico, que fue aprobado por el comité de ética local. Se dispuso el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
1. Revisión histológica e inmunofenotológica de muestras de tejido
NOTA: Un patólogo experto es responsable de las actividades descritas a continuación.
<ol><li>Revisión histopatológica de casos seleccionados de acuerdo con criterios diagnósticos bien esta...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Nuestro método permite la identificación de alteraciones moleculares implicadas en la progresión de tumores sólidos a través de la integración de datos verticales (es decir, morfología, secuenciación de ADN e inmunohistoquímica) a partir de lesiones distintas de un paciente determinado. Demostramos la capacidad de nuestro método para detectar eventos clonales y subclonales en un tipo de tumor silencioso mutacional (es decir, SPN, neoplasia sólida-pseudopapilar del páncreas) interrogando las secuencias de codi...

El advenimiento de la secuenciación de próxima generación (NGS) ha revolucionado la forma en que se diagnostican y tratan los cánceres1. NGS acoplado a la secuenciación multirregional han expuesto un alto grado de heterogeneidad intratumoral (ITH) en tumores sólidos2, lo que explica en parte el fracaso de la terapia dirigida debido a la presencia de subclones con diferente sensibilidad a los fármacos2 . Un desafío importante planteado por los estudios de secuenciación del genoma es la necesidad de distinguir entre mutaciones de pasajeros (es decir, neutrales) y conductores en cánceres individuales3. En efecto, varios estudios han demostrado que, en determinados tumores, las mutaciones de los pasajeros representan la mayoría de la ITH, mientras que las alteraciones del conductor tienden a conservarse entre las lesiones del mismo individuo4. También es importante tener en cuenta que la gran carga mutacional (como se ve en los cánceres de pulmón y el melanoma) no implica necesariamente una gran carga mutacional subclonal2. Por lo tanto, se puede encontrar un alto grado de ITH en tumores con baja carga mutacional.
Las metástasis son responsables de más del 90% de la muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo5; por lo tanto, la captura de la heterogeneidad mutacional de los genes del conductor entre las lesiones primarias y metastásicas es fundamental para el diseño de terapias eficaces para enfermedades en estadio avanzado. La secuenciación clínica se realiza generalmente en ácidos nucleicos de tejidos fijos, lo que dificulta la exploración en todo el genoma debido a la mala calidad del ADN. Por otro lado, la intención de la secuenciación clínica es identificar mutaciones y/o mutaciones procesables que podrían predecir la capacidad de respuesta/falta de respuesta a un régimen terapéutico determinado. Tal como está, la secuenciación puede limitarse a una fracción menor del genoma para la extracción oportuna de información clínicamente relevante. La transición de la generación de perfiles de ADN de bajo rendimiento (por ejemplo, secuenciación de Sanger) a NGS ha hecho posible analizar cientos de genes relevantes para el cáncer a una alta profundidad de cobertura, lo que permite la detección de eventos subclonales. Aquí, informamos de un método para el análisis comparativo de lesiones que permite la identificación de poblaciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes del mismo individuo. El método descrito aquí integra tres enfoques bien establecidos (análisis histológico, secuenciación multilesional de alta cobertura y análisis inmunofenotípicos) para predecir las consecuencias funcionales de las variaciones identificadas. El enfoque se describe esquemáticamente en la Figura 1 y se ha aplicado al estudio de 5 casos metastásicos de neoplasias pseudopamizas sólidas (SPN) del páncreas. Si bien describimos el procesamiento y análisis de muestras de tejido sinovertina fijadas en formalina (FFPE), el mismo procedimiento se puede aplicar al material genético del tejido congelado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Evaluar la heterogeneidad intratumoral (ITH) es de suma importancia para anticipar el fracaso de las terapias dirigidas y diseñar estrategias antitumorales eficaces en consecuencia. Aunque con frecuencia se plantean preocupaciones debido a las diferencias en el procesamiento de muestras y la profundidad de la cobertura, la secuenciación de próxima generación de tumores sólidos ha desentrañado un grado muy variable de ITH entre los tipos de tumores. La captura de la relación genética entre las lesiones primarias y metastásicas mediante la identificación de poblaciones clonales y subclonales es fundamental para el diseño de terapias para enfermedades en estadio avanzado. Aquí, informamos de un método para el análisis comparativo de lesiones que permite la identificación de poblaciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes del mismo paciente. El enfoque experimental descrito aquí integra tres enfoques bien establecidos: análisis histológico, secuenciación multilesione de alta cobertura y análisis inmunofenotípicos. Con el fin de minimizar los efectos en la detección de eventos subclonales por procesamiento inapropiado de muestras, sometimos a los tejidos a un examen patológico cuidadoso y el enriquecimiento de células neoplásicas. El ADN controlado por calidad de lesiones neoplásicas y tejidos normales fue sometido a una secuenciación de alta cobertura, dirigida a las regiones codificantes de 409 genes cancerosos relevantes. Aunque sólo se examina un espacio genómico limitado, nuestro enfoque permite evaluar el grado de heterogeneidad entre las alteraciones somáticas (mutaciones de un solo nucleótido y variaciones de números de copia) en lesiones distintas de un paciente determinado. A través del análisis comparativo de los datos de secuenciación, pudimos distinguir las alteraciones clonales frente a las subclonales. La mayoría de la ITH a menudo se atribuye a mutaciones de pasajeros; por lo tanto, también utilizamos la inmunohistoquímica para predecir las consecuencias funcionales de las mutaciones. Si bien este protocolo se ha aplicado a un tipo de tumor específico, anticipamos que la metodología descrita aquí es ampliamente aplicable a otros tipos de tumores sólidos.

El flujo de trabajo del estudio se ilustra en la Figura 1. La secuenciación multilesiones (n.o 13) de 5 casos de SPN dirigidos a las secuencias codificantes de 409 genes relacionados con el cáncer identificó un total de 27 mutaciones somáticas en 8 genes (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1y FGFR3). Las mutaciones se definieron como fundador/clonal cuando se compartieron entre todas las lesiones de un pacien...

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Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.

Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Nuestro protocolo permite la captura de la relación genética entre lesiones primarias y metastásicas a través de la identificación de alteraciones moleculares implicadas en la progresión de la enfermedad. Nuestro método ofrece la oportunidad de explorar la relación genética en muestras clínicas con alta sensibilidad y especificidad. Esto se debe a la integración del análisis molecular e histopatológico.La evaluación de la heterogeneidad intratumoral en el campo de la investigación del cáncer es de suma importancia en el diseño de estrategias antitumorales eficaces y nuestro método es ampliamente aplicable a muchos tipos de tumores sólidos. Después de preparar y cuantificar las bibliotecas de interés, diluir cada biblioteca a una concentración de 100 picomolares en agua libre de nucleasas y combinar 10 microlitros de cada biblioteca diluida para una sola tirada en un solo tubo. A continuación, mezcle las bibliotecas agrupadas por pipetting.Para iniciar una ejecución de secuenciación, abra primero el navegador Torrent en un equipo conectado al sistema de secuenciación. Planifique una nueva ejecución utilizando la plantilla genérica para la aplicación seleccionada y en la pestaña kits seleccione el sistema Ion Proton o el sistema Ion Gene Studio S5. Seleccione el chip adecuado en el menú desplegable tipo de chip y seleccione Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit en la lista desplegable del kit de biblioteca.Seleccione el botón Ion Chef para el kit de plantilla y seleccione el kit de Chef adecuado en la lista desplegable del kit de plantillas. Seleccione el kit de secuenciación adecuado en el menú desplegable del kit de secuenciación y seleccione Ion Express en la lista desplegable del conjunto de códigos de barras. En la pestaña del plugin, seleccione el plugin de análisis de cobertura.En la pestaña Plan, seleccione el genoma GRCH37HG19 en la lista desplegable de la biblioteca de referencias. En la lista desplegable Regiones de destino, seleccione el panel adecuado que desea secuenciar. A continuación, establezca el número de códigos de barras que se van a secuenciar y establezca el nombre del código de barras y el nombre de la muestra para cada biblioteca.Para una dilución de bibliotecas agrupadas, diluya la biblioteca de existencias con agua libre de nucleasas a una concentración picomolar de 25 para un chip de protones iónico y pipetee 50 microlitros de cada biblioteca diluida hasta el fondo del tubo de muestra de la biblioteca adecuado. Cargue tubos de muestra que contengan las bibliotecas diluidas agrupadas en el sistema de preparación de la biblioteca e inicie la amplificación clonal. Para la secuenciación de próxima generación, siga las instrucciones en pantalla para inicializar el instrumento.Cuando termine la amplificación clonal, abra la puerta del instrumento Ion Chef, abra la tapa de la centrífuga de carga de viruta y retire los dos chips del sistema de preparación de la biblioteca. Coloque las virutas en contenedores de almacenamiento de virutas separados y cargue una de las virutas en el compartimiento de virutas del instrumento. A continuación, cierre la tapa del compartimiento de viruta e inicie la secuenciación.Para el análisis de mutaciones, abra el plugin de análisis de cobertura y utilice la salida de análisis de cobertura para verificar la profundidad de cobertura y uniformidad. Utilice el plugin Torrent Variant Caller para realizar la variante de llamada seleccionando la línea germinal o el flujo de trabajo somático según corresponda. A continuación, descargue los archivos de formato de llamada de variantes de variantes filtradas y utilice el software predictor de efectos variantes en la base de datos REFSeq de NCBI para anotar las variantes.Para estimar las variaciones del número de copia, utilice el plugin ion reporter uploader para cargar los datos de secuenciación en el software de reportero iónico y utilice el flujo de trabajo completo del par normal del tumor del panel de cáncer para analizar los datos. Filtre manualmente las mutaciones y las variaciones del número de copia en función de las puntuaciones asignadas por el software y verifique las variaciones visualmente con el Visor De Genómica Integrativa. A continuación, inspeccione visualmente la alineación en busca de lecturas inusuales que puedan generar llamadas artefactos e inspeccione la cobertura normalizada para todos los amplicons a través de un gen dado contra la cobertura normalizada de la línea de base para verificar las variaciones del número de copia.Para cada caso, indexa las llamadas de mutación desde la secuenciación de tejido normal o sangre o tumor primario o metástasis. Marcar como línea germinal y descartar llamadas que también son evidentes de los datos de secuenciación del ADN de la línea germinal. Marcar como clonal o fundador las mutaciones que se comparten entre todas las lesiones de un paciente dado.A continuación, marcar como subclonal o progresor las mutaciones que se detectan en algunas pero no todas las lesiones de un paciente dado. En este experimento representativo, la secuenciación de múltiples lesiones de cinco casos sólidos de neoplasia pseudopapilar dirigidos a las secuencias de codificación de 409 genes relacionados con el cáncer identificó un total de 27 mutaciones somáticas en ocho genes. Las mutaciones se definieron como fundadores o clonales cuando se compartieron entre todas las lesiones de un paciente determinado y progresor o subclonal cuando se detectan en algunas lesiones de un paciente determinado, pero no en todas.Consistentemente, la tinción inmunohistoquímica para beta-catenina y KMD6A fue homogénea entre las diversas lesiones de los casos con mutaciones de los genes correspondientes. La tinción moderada de KMD6A en especímenes mutados sugiere que es probable que la alteración genética altere la función en lugar de la expresión de la proteína. La pérdida de la función de KMD6A en los tumores pancreáticos se asocia con una regulación del marcador de hipoxia GLUT-1.Y en consecuencia, GLUT-1 se expresó en exceso en casos con mutaciones KMD6A. La inmunohistoquímica para BAP1 y TP53 confirmó que las mutaciones en esos genes eran subclonales. En este cariotipo virtual de un caso representativo que muestra la ubicación, proximidad y estado del número de copia de genes alterados, el análisis de variación de número de copia utilizando datos de secuenciación reveló alteraciones en todos los especímenes analizados.Y a diferencia de las mutaciones puntuales, la mayoría de las alteraciones de variación del número de copia fueron subclonales. La validación e indexación de mutaciones y la variación del número de copia y el uso de la comparación normal del ADN tumoral son importantes para evitar la generación de llamadas artefactos que podrían invalidar los resultados. Este procedimiento también podría aplicarse a estudios de secuenciación del genoma completo destinados a interrogar todo el genoma para la identificación de mutaciones entre lesiones de diferentes tipos de tumores sólidos.En el campo de la investigación oncológica, estas técnicas son herramientas críticas para entender la biología de enfermedades con importantes implicaciones clínicas destinadas a diseñar terapias dirigidas personalizadas y eficaces.

Research

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