Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Studien stöddes av det italienska cancer arvs projektet (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana ricerca Cancro (AIRC; Grant nr 12182 till AS och 18178 till VC), FP7 Europeiska gemenskapens bidrag (Cam-PAC nr 602783 till AS). Finansieringsorganen hade ingen roll i insamlingen, analysen och tolkningen av uppgifterna eller i manuskriptet.

Det material som användes i studien samlades in enligt ett särskilt protokoll som godkändes av den lokala etikkommittén. Skriftligt informerat samtycke från alla patienter fanns tillgängligt.
1. histologisk och immunophenotypisk revidering av vävnadsprov
Anmärkning: en expert patolog ansvarar för verksamhet som beskrivs nedan.
<ol><li>Histopatologisk revidering av utvalda fall enligt väletablerade diagnostiska kriterier.<ol>
<li>Använd mikrotomen för a...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Vår metod möjliggör identifiering av molekylära förändringar involverade i progression av solida tumörer genom integration av vertikala data (dvs., morfologi, DNA-sekvensering, och immunohistokemi) från distinkta lesioner av en given patient. Vi visade förmåga att vår metod för att upptäcka klonala och subklonala händelser i en Mutations Silent tumörtyp (dvs., SPN, solid-pseudopapillary tumör i i bukspottkörteln) genom förhör kodnings sekvenser av 409 cancer relevanta gener8. En...

Tillkomsten av nästa generations sekvensering (NGS) har revolutionerat hur cancer diagnostiseras och behandlas1. NGS kopplat till multiregionala sekvensering har utsatt en hög grad av intratumoral heterogenitet (ITH) i solida tumörer2, vilket förklarar delvis misslyckandet med riktad behandling på grund av närvaron av subklonar med olika läkemedels känslighet2 . En viktig utmaning som orsakas av genomomfattande sekvenserings studier är nödvändigheten av att skilja mellan passagerare (dvs. neutrala) och förar mutationer i enskilda cancerformer3. Flera studier har verkligen visat att, i vissa tumörer, passagerar mutationer står för majoriteten av ITH, medan föraren förändringar tenderar att bevaras bland lesioner av samma individ4. Det är också viktigt att notera att stora mutationell börda (som kan ses i lungcancer och melanom) inte nödvändigtvis innebär en stor subklonala mutationell börda2. Därför, en hög grad av ITH kan hittas i tumörer med låg mutationell börda.
Metastaser är ansvariga för mer än 90% av cancerrelaterad död i hela världen5; Därför är det avgörande för utformningen av effektiva terapier för framskridna sjukdomar att fånga den mutationella heterogeniteten hos drivrutingener bland primära och metastaserande lesioner. Klinisk sekvensering utförs vanligtvis på nukleinsyror från fasta vävnader, vilket gör att genomomfattande prospektering är svår på grund av dålig DNA-kvalitet. Å andra sidan, avsikten med klinisk sekvensering är att identifiera angribara mutationer och/eller mutationer som kan förutsäga lyhördhet/oreaktionsförmåga till en given terapeutisk regim. I den mån det är, kan sekvensering begränsas till en mindre del av genomet för snabb extraktion av kliniskt relevant information. Övergången från DNA-profilering med låg kapacitet (t. ex. Sangersekvensering) till NGS har gjort det möjligt att analysera hundratals cancerrelevanta gener vid ett högt djup av täckning, vilket gör det möjligt att upptäcka subklonala händelser. Här rapporterar vi en metod för jämförande lesioner analys som möjliggör identifiering av klonala och subklonala populationer bland olika prover från samma individ. Den metod som beskrivs här integrerar tre väl etablerade metoder (histologisk analys, hög täckning multi-lesion sekvensering, och immunophenotypic analyser) för att förutsäga funktionella konsekvenser av de identifierade variationerna. Metoden beskrivs schematiskt i figur 1 och har tillämpats på studien av 5 metastatiska fall av solida pseudopapillära neoplasmer (SPN) i bukspottkörteln. Medan vi beskriver bearbetning och analys av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnadsprov, samma förfarande kan tillämpas på genetiskt material från färsk-fryst vävnad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Att bedöma intra-tumoral heterogenitet (ITH) är av största vikt för att förutse misslyckande av riktade terapier och design därmed effektiva anti-tumör strategier. Även om oro ofta höjs på grund av skillnader i provbehandling och djup täckning, nästa generations sekvensering av solida tumörer har avslöjad en mycket varierande grad av ITH över tumörtyper. Att fånga den genetiska släktskap mellan primära och metastaserande lesioner genom identifiering av klonala och subklonala populationer är avgörande för utformningen av terapier för avancerade sjukdomar. Här rapporterar vi en metod för jämförande lesioner analys som möjliggör identifiering av klonala och subklonala populationer bland olika prover från samma patient. Den experimentella metoden som beskrivs här integrerar tre väl etablerade tillvägagångssätt: histologisk analys, hög täckning multi-lesion sekvensering, och immunophenotypic analyser. För att minimera effekterna på detektion av subklonala händelser genom olämplig provbehandling, vi utsätts vävnader för noggrann patologisk undersökning och neoplastiska cell berikning. Kvalitetskontrollerade DNA från neoplastiska lesioner och normala vävnader utsattes sedan för hög täckning sekvensering, inriktning på kodning regioner 409 relevanta cancergener. Samtidigt som man bara tittar på ett begränsat genomiskt utrymme, gör vårt tillvägagångssätt det möjligt att utvärdera omfattningen av heterogenitet mellan somatiska förändringar (single-nucleotide mutationer och kopior-nummer variationer) i distinkta lesioner från en given patient. Genom jämförande analys av sekvenserings data kunde vi urskilja klonala vs. subklonala förändringar. Majoriteten av ITH tillskrivs ofta passagerar mutationer; Därför använde vi också immunohistokemi för att förutsäga funktionella konsekvenser av mutationer. Även om detta protokoll har tillämpats på en viss tumörtyp, vi räknar med att den metod som beskrivs här är i stort sett tillämplig på andra solida tumörtyper.

Arbetsflödet för studien illustreras i figur 1. Multi-lesioner (n = 13) sekvensering av 5 SPN fall riktade kodning sekvenser av 409 cancerrelaterade gener identifierade totalt 27 somatiska mutationer i 8 gener (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1och FGFR3). Mutationer definierades som grundare/klon när de delades mellan alla lesioner av en given patient, och progressor/subklonala när de upptäcks i vissa men...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Denna artikel beskriver en metod för att identifiera klonala och subklonala förändringar mellan olika prover från en given patient. Även om de experiment som beskrivs här fokuserar på en specifik tumörtyp, tillvägagångssättet är i stort sett tillämplig på andra solida tumörer.

Jämförande lesioner analys genom en riktad sekvensering strategi

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Vårt protokoll tillåter fångst av den genetiska släktlighet mellan primära och ögonbevarande skador genom identifiering av molekylära förändringar som deltar i sjukdomsprogression. Vår metod ger möjlighet att utforska genetisk släktskap i kliniskt prov med hög känslighet och specificitet. Detta beror på integreringen av molekylär och histopatologisk analys.Bedömningen av intratumor heterogenitet inom cancerforskningsområdet är av största vikt vid utformningen av effektiva antitumörstrategier och vår metod är i stort sett tillämplig på många solida tumörtyper. Efter att ha förberett och kvantifierat biblioteken av intresse, späd varje bibliotek till en 100 picomolar koncentration i nukleasfritt vatten och kombinera 10 mikroliter av varje utspädda bibliotek för en enda körning i ett enda rör. Blanda sedan de poolade biblioteken genom pipettering.För att initiera en sekvenseringskörning öppnar du först torrent-webbläsaren på en dator som är ansluten till sekvenseringssystemet. Planera en ny körning med hjälp av den generiska mallen för det valda programmet och under fliken kit väljer Ion Proton system eller Ion Gene Studio S5-system. Välj lämplig chip från chip typ dropdown menyn och välj Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit från biblioteket kit dropdown lista.Välj knappen Ion Chef för mallen kit och välj lämplig Chef Kit från mallen kit dropdown-listan. Välj lämplig sekvenseringssats från menyn för sekvenseringskit dropdown och välj Ion Express i streckkodsuppsättningens nedrullningslista. Välj insticksprogrammet för täckningsanalys under plugin-programmet för insticksprogram.Under fliken plan väljer du GRCH37HG19-genomet från referensbibliotekets sänkningslista. Från listrutan målområden, välj lämplig panel som ska ordnas. Ställ sedan in antalet streckkoder som ska sekvenserades och ange streckkodsnamn och provnamn för varje bibliotek.För en poolad bibliotek utspädning, späda ut lagerbiblioteket med nukleasfritt vatten till en 25 picomolarkoncentration för en jonprotonchip och pipetter 50 mikroliter av varje utspädt bibliotek till botten av lämpligt bibliotek provrör. Ladda provrör som innehåller de sammanspätt utspädda biblioteken på biblioteksberedningssystemet och starta kloningen. För nästa generations sekvensering följer du anvisningarna på skärmen för att initiera instrumentet.När klonalförstärkningen är klar, öppna Ion Chef instrumentdörren, öppna sedan locket på chipet lastning centrifug och ta bort de två marker från biblioteket förberedelsesystem. Placera spånorna i separata behållare för flisförvaring och ladda in ett av spånen i spånfacket i instrumentet. Stäng sedan locket till spånfacket och starta sekvenseringen.För mutationsanalys, öppna insticksprogrammet för täckningsanalys och använd utdata för täckningsanalys för att verifiera djupet av täckning och enhetlighet. Använd torrent variant caller plugin för att utföra varianten ringer välja groddar linje eller somatiska arbetsflödet som är lämpligt. Hämta sedan filtrerade varianter samtalsformat filer och använda variant effekt prediktor programvara i NCBI RefSeq databasen för att kommentera varianterna.För att uppskatta kopia-nummer variationer, använd ion reporter uppladdare plugin för att ladda sekvensering data i jon reporter programvara och använda omfattande cancer panel tumör normal par arbetsflöde för att analysera data. Filtrera mutationerna och variationerna i kopia-nummer manuellt baserat på poängen som tilldelats av programvaran och verifiera variationerna visuellt med Integrative Genomics Viewer. Sedan visuellt inspektera anpassningen för ovanliga läsningar som kan generera artifactual samtal och inspektera normaliserade täckning för alla amplikoner över en given gen mot normaliserade täckning av baslinjen för att verifiera kopiera-nummer variationer.För varje fall indexera mutationen samtal från sekvensering av normal vävnad eller blod eller primära tumör eller metastasering. Flagga som groddar linje och kasta samtal som också framgår av sekvensering data av groddar linje DNA. Flagga som klonal eller grundare de mutationer som delas mellan alla skador av en viss patient.Sedan flagga som subklonal eller progressor de mutationer som upptäcks i vissa men inte alla av skador av en viss patient. I detta representativa experiment, flera-lesion sekvensering av fem fasta pseudopapillary neoplasm fall inriktning på kodning sekvensering av 409 cancer-relaterade gener identifierat totalt 27 somatiska mutationer i åtta gener. Mutationer definierades som grundare eller klonurala när delas mellan alla de skador av en viss patient och progressor eller subklonal när detekteras i vissa men inte alla av skador av en viss patient.Konsekvent var immunohistochemical färgning för beta-catenin och KMD6A homogen bland de olika skador av fall med mutationer av motsvarande gener. Den måttliga färgning för KMD6A i muterade exemplar tyder på att genetisk förändring sannolikt kommer att förändra funktionen snarare än uttrycket av proteinet. KMD6A förlust av funktion i bukspottskörteln tumörer är associerad med upp reglering av hypoxi markör GLUT-1.Och följaktligen var GLUT-1 över uttryckt i fall med KMD6A mutationer. Immunohistokemi för BAP1 och TP53 bekräftade att mutationer i dessa gener var subklonal. I denna virtuella karyotyp av ett representativt fall som visar plats, närhet och kopia-nummer status för ändrade gener, kopia-nummer variation analys med hjälp av sekvensering data visade ändringar i alla de analyserade exemplar.Och i motsats till punkt mutationer, majoriteten av kopia-nummer variation ändringar var subklonal. Validering och indexering av mutationer och kopiera-nummer variation och med hjälp av tumören normala DNA-jämförelse är viktiga för att undvika generering av artifactual samtal som skulle kunna ogiltigförklara resultaten. Detta förfarande skulle också kunna tillämpas på hela genomet sekvensering studier som syftar till att förhöra hela genomet för identifiering av mutation mellan lesion av olika solida tumörtyper.Inom cancerforskningsområdet är dessa tekniker kritiska verktyg för att förstå sjukdomars biologi med viktiga kliniska implikationer som syftar till att utforma personliga och effektiva riktade terapier.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Kontextuell och cued rädsla Conditioning Test Med hjälp av en videoanalyssystem hos möss

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Mätning av Fronto-limbiska aktivitet Använda en Emotional Oddball uppgift hos barn med Familial hög risk för schizofreni

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimentell Bedömning av mus Sällskaplighet hjälp av en automatiserad bildbehandling Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Pavlovian Kondition Approach Utbildning i råttor

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protokoll för datainsamling och analys Applied till Automated Ansiktsuttryck analysteknik och Temporal Analys för sensorisk utvärdering

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Beteendestörningar: en innovativ strategi för att övervaka modulerande effekterna av en Nutraceutical Diet

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Behandling av fotled artros med Total vristersättning genom en Lateral Transfibular strategi

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Användning av en trådlös video-EEG-system för att övervaka epileptiform utsläpp efter lateral vätska-slagverk inducerad traumatisk hjärn skada

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

En Maskininlärnings metod för att utforma en effektiv selektiv screening av mild kognitiv svikt

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Utvärdera skicklig Prehension hos möss med hjälp av en auto-trainer

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...