Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Çalışma İtalyan Kanser Genom Projesi (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Hibe No. 12182 AS ve 18178 VC), FP7 Avrupa Topluluğu Hibe (Cam-Pac No 602783 AS). Finansman kuruluşlarının verilerin toplanması, analizi ve yorumlanmasında veya makalenin yazımında hiçbir rolü yoktur.

Çalışmada kullanılan malzeme yerel etik komitesi tarafından onaylanan özel bir protokol altında toplanmıştır. Tüm hastaların yazılı bilgilendirilmiş onayı mevcuttu.
1. Doku örneklerinin histolojik ve immünfenotipik revizyonu
NOT: Bundan sonra açıklanan faaliyetlerden uzman bir patolog sorumludur.
<ol><li>Seçilen olguların köklü tanı kriterlerine göre histopatolojik revizyonu.<ol>
<li>Temsili FFPE doku bloklarından 4−5 μm kalınlığı...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Yöntemimiz, katı tümörlerin ilerlemesinde rol oynayan moleküler değişikliklerin, belirli bir hastanın farklı lezyonlarından dikey verilerin (yani morfoloji, DNA dizilemesi ve immünohistokimya) entegrasyonu yoluyla belirlenmesini sağlar. 409 kanserle ilgili genin kodlama dizilerini sorgulayarak mutasyonel sessiz tümör tipinde (yani, SPN, pankreasın solid-psödopapiller neoplazmı) klonal ve subklonal olayları tespit etme yöntemimizin yeteneğini gösterdik8. Burada kullanılan ampl...

Yeni nesil sıralama gelişiyle (NGS) kanserler teşhis ve tedavi yolu devrim yarattı1. Çok bölgesel sıralamaya bağlı NGS, solid tümörlerde yüksek derecede intra-tümöral heterojenite (ITH) maruz kalmıştır2, bu da kısmen farklı ilaç duyarlılığı 2 ile subklonların varlığı nedeniyle hedeflenen tedavinin başarısızlığını açıklar2 . Genom çapında sıralama çalışmalarının yarattığı önemli bir sorun, bireysel kanserlerde yolcu (yani nötr) ve sürücü mutasyonlarını birbirinden ayırma zorunluluğudur3. Çeşitli çalışmalar gerçekten göstermiştir ki, bazı tümörlerde, yolcu mutasyonları ITH çoğunluğu için hesap, sürücü değişiklikleri aynı bireysel lezyonlar arasında korunmuş olma eğilimindediriken 4. Ayrıca büyük mutasyonal yük (akciğer kanserleri ve melanom görüldüğü gibi) mutlaka büyük bir subklonal mutasyonyükü anlamına gelmez dikkat etmek önemlidir2. Bu nedenle, düşük mutasyonyükü olan tümörlerde yüksek derecede ITH bulunabilir.
Metastazlar dünya çapında kansere bağlı ölümün %90'ından sorumludur5; bu nedenle, primer ve metastatik lezyonlar arasında sürücü genlerinin mutasyonel heterojenliğini yakalamak ileri evre hastalıklar için etkili tedavilerin tasarlanması açısından kritik öneme sahiptir. Klinik sıralama genellikle sabit dokulardan gelen nükleik asitler üzerinde yapılır, bu da dna kalitesinin düşük olması nedeniyle genom çapında keşifleri zorlaştırır. Diğer taraftan, klinik sıralamanın amacı, belirli bir terapötik rejime yanıt verme/yanıt vermeme yi öngörebilecek eyleme geçirilebilir mutasyonları ve/veya mutasyonları belirlemektir. Haliyle, dizileme, klinik olarak ilgili bilgilerin zamanında çıkarılması için genomun daha küçük bir kısmıyla sınırlandırılabilir. Düşük iş türünde DNA profilleme (örneğin, Sanger Sıralama) NGS geçiş mümkün kapsama yüksek bir derinlikte kanserle ilgili genlerin yüzlerce analiz etmek için yaptı, hangi subklonal olayların tespiti için izin verir. Burada, aynı bireyden farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan yöntem, tanımlanan varyasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için üç köklü yaklaşımı (histolojik analiz, yüksek kapsamalı multi-lezyon dizilemesi ve immünopnotipik analizler) entegre eder. Yaklaşım şematik olarak Şekil 1'de tanımlanmıştır ve pankreasın 5 metastatik solid psödopapiller neoplazm olgusu (SPN) olgusu çalışmaya uygulanmıştır. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku örneklerinin işlenmesi ve analizini açıklarken, aynı prosedür taze dondurulmuş dokudan gelen genetik materyale de uygulanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

İntra-tümöral heterojenitenin (ITH) değerlendirilmesi, hedeflenen tedavilerin başarısızlığını tahmin etmek ve buna göre etkili anti-tümör stratejileri tasarlamak için büyük önem taşımaktadır. Numune işleme ve kapsama derinliğindeki farklılıklar nedeniyle sık sık endişeler dile getirilse de, solid tümörlerin yeni nesil dizilemesi tümör tipleri arasında son derece değişken derecede ITH'yi ortaya çıkardı. Klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesi yoluyla primer ve metastatik lezyonlar arasındaki genetik ilişkinin yakalanması, ileri evre hastalıklar için tedavilerin tasarlanması nda kritik öneme sahiptir. Burada, aynı hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan deneysel yaklaşım, histolojik analiz, yüksek kapsama lı multi-lezyon dizilemesi ve immünopopnotipik analizler olmak üzere üç köklü yaklaşımı bütünleştirir. Uygun olmayan numune işleme ile subklonal olayların saptanması üzerindeki etkileri en aza indirmek için, dokuları dikkatli patolojik inceleme ve neoplastik hücre zenginleştirme tabi tetkik. Daha sonra neoplastik lezyonlar dan ve normal dokulardan kaliteli kontrollü DNA, 409 ilgili kanser geninin kodlama bölgelerini hedefleyerek yüksek kapsama alanına tabi tutuldu. Yaklaşımımız sadece sınırlı bir genomik alana bakarken, belirli bir hastanın farklı lezyonlarındaki somatik değişiklikler (tek nükleotit mutasyonları ve kopya numarası varyasyonları) arasındaki heterojenliğin derecesini değerlendirmeyi sağlar. Sıralama verilerinin karşılaştırmalı analizi sayesinde, klonal ve subklonal değişiklikleri ayırt edebildik. ITH çoğunluğu genellikle yolcu mutasyonları atfedilir; bu nedenle, mutasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için immünohistokimyayı da kullandık. Bu protokol belirli bir tümör tipine uygulanmış olsa da, burada açıklanan metodolojinin diğer solid tümör tipleri için genel olarak geçerli olduğunu öngörüyoruz.

Çalışma iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. 409 kanserle ilişkili genin kodlama dizilerini hedefleyen 5 SPN olgunun çoklu lezyonlar (n = 13) dizilimi 8 gende toplam 27 somatik mutasyon tespit edilir(CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, ve FGFR3). Mutasyonlar, belirli bir hastanın tüm lezyonları arasında paylaşıldığında kurucu/klonal, belirli bir hastanın tüm lezyonlarında değil de tüm le...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Protokolümüz, hastalığın ilerlemesinde rol oynayan moleküler değişikliklerin belirlenmesi yoluyla primer ve metastatik lezyonlar arasındaki genetik ilişkililiğin yakalanmasını sağlar. Yöntemimiz, klinik numunede genetik akrabalığı yüksek duyarlılık ve özgüllük ile keşfetme olanağı sağlar. Bunun nedeni moleküler ve histopatolojik analizlerin bütünleşmesidir.Kanser araştırma alanında intratümör heterojenitesinin değerlendirilmesi etkili anti-tümör stratejilerinin tasarlanmasında büyük önem taşımaktadır ve yöntemimiz birçok solid tümör tipi için geniş ölçüde geçerlidir. İlgi kütüphanelerini hazırladıktan ve ölçtükten sonra, her kütüphaneyi çekirdeksiz suda 100 picomolar konsantrasyonuna seyreltin ve seyreltilmiş her kütüphanenin 10 mikrolitresini tek bir tüpte tek bir çalışma için birleştirin. Sonra pipetleme tarafından havuzlu kütüphaneler karıştırın.Sıralama çalışması başlatmak için önce sıralama sistemine bağlı bir bilgisayarda Torrent tarayıcısını açın. Seçili uygulama için genel şablonu kullanarak ve kitler sekmesi altında Ion Proton sistemini veya Ion Gene Studio S5 sistemini seçin. Fiş türü açılır menüsünden uygun fişi seçin ve kitaplık kiti açılır listesinden Ion AmpliSeq 2.0 Kitaplık Kiti'ni seçin.Şablon kiti için Ion Chef düğmesini seçin ve şablon kiti açılır listesinden uygun Şef Kiti'ni seçin. Sıralama kiti açılır menüsünden uygun sıralama kitini seçin ve barkod ayarlı açılır listeden Ion Express'i seçin. Eklenti sekmesinin altında, kapsama analizi eklentisini seçin.Plan sekmesialtında, referans kitaplığı açılır listesinden GRCH37HG19 genomunu seçin. Hedef bölgeler açılır listesinden sıralanacak uygun paneli seçin. Ardından sıralanacak barkod sayısını ayarlayın ve her kitaplık için barkod adını ve örnek adını ayarlayın.Havuzlu kütüphaneler seyreltme için, bir iyon proton çip ve pipet 50 mikrolitre her seyreltilmiş kütüphane için 25 picomolar konsantrasyonu nükleaz içermeyen su ile stok kütüphane seyreltmek uygun kütüphane örnek tüp altına. Havuzlu seyreltilmiş kütüphaneleri içeren örnek tüpleri kütüphane hazırlama sistemine yükleyin ve klonal amplifikasyonu başlatın. Yeni nesil sıralama için, enstrümanı başlatmayı izlemek için ekrandaki yönergeleri izleyin.Klonal amplifikasyon bittiğinde, Ion Chef alet kapısını açın, ardından çip yükleme santrifüjünün kapağını açın ve iki yongayı kütüphane hazırlama sisteminden çıkarın. Talaşları ayrı talaş depolama kaplarına yerleştirin ve talaşlardan birini cihazdaki talaş bölmesine yükleyin. Sonra talaş bölmesinin kapağını kapatın ve sıralamaya başlayın.Mutasyon analizi için, kapsama analizi eklentisini açın ve kapsama derinliğini ve tekdüzeliği doğrulamak için kapsama analizi çıktısını kullanın. Uygun olarak mikrop hattı veya somatik iş akışını seçerek varyant arama gerçekleştirmek için Torrent Variant Caller eklentisini kullanın. Sonra filtrelenmiş varyantları varyant çağrı biçimi dosyaları indirin ve türevleri açıklamayapmak için NCBI RefSeq veritabanında varyant etkisi predictor yazılımı kullanın.Kopya numarası varyasyonlarını tahmin etmek için, iyon muhabiri yükleme eklentisini kullanarak dizilim verilerini iyon muhabiri yazılımına yükleyin ve verileri analiz etmek için kapsamlı kanser paneli tümör normal çifti iş akışını kullanın. Mutasyonları ve kopya numarası varyasyonlarını yazılım tarafından atanan puanlara göre el ile filtreleyin ve varyasyonları Tümleştirici Genomik Görüntüleyici ile görsel olarak doğrulayın. Daha sonra, kopya numarası varyasyonlarını doğrulamak için, belirli bir gendeki tüm amplicon'ların normalleştirilmiş kapsama alanını, temel çizginin normalleştirilmiş kapsamına karşı normalleştirilmiş kapsama alanı için sıra dışı okumalar için hizalamayı görsel olarak inceleyin.Her olgu için, mutasyon normal doku veya kan veya primer tümör veya metastaz dizilimi çağrıları indeks. Mikrop hattı olarak işaretle ve mikrop hattı DNA'sının sıralama verilerinden de belirgin olan çağrıları atın. Belirli bir hastanın tüm lezyonları arasında paylaşılan mutasyonları klonal veya kurucu olarak işaretle.Daha sonra subklonal veya ilerleme veya belirli bir hastanın lezyonlarının tümlerinde değil, bazılarında tespit edilen mutasyonları işaretlayın. Bu temsili deneyde, kanserle ilişkili 409 genin kodlama dizilerini hedefleyen beş solid psödopapiller neoplazm olgusu multi-lezyon dizilimi sekiz gende toplam 27 somatik mutasyon tespit etti. Mutasyonlar, belirli bir hastanın lezyonlarının tümlerinde ancak tümlerinde saptandığında, belirli bir hastanın tüm lezyonları ile progressor veya subklonal lezyonlar arasında paylaşıldığında kurucu veya klonal olarak tanımlanmıştır.Sürekli olarak, beta-katenin ve KMD6A için immünohistokimyasal boyama karşılık gelen genlerin mutasyonu olan olguların çeşitli lezyonları arasında homojendi. Mutasyona uğramış örneklerde KMD6A için ılımlı boyama genetik değişiklik proteinin ekspresyonundan çok fonksiyonu değiştirmek olasıolduğunu düşündürmektedir. Pankreas tümörlerinde fonksiyon KMD6A kaybı hipoksi belirteci GLUT-1 kadar düzenleme ile ilişkilidir.Buna göre, GLUT-1 KMD6A mutasyonu taşıyan olgularda ifade edildi. BAP1 ve TP53 immünohistokimyası bu genlerdeki mutasyonların subklonal olduğunu doğruladı. Değiştirilmiş genlerin konumunu, yakınlığını ve kopya numarası durumunu gösteren temsili bir vakanın bu sanal karyotipinde, sıralama verilerini kullanarak kopya numarası varyasyon analizi, analiz edilen tüm örneklerde değişiklikler ortaya koymuştur.Ve nokta mutasyonlarının aksine, kopya-sayı varyasyon değişikliklerinin çoğu subklonal idi. Mutasyonların ve kopya numarası varyasyonlarının doğrulanması ve indekslemesi ve tümörün normal DNA karşılaştırmasının kullanılması, sonuçları geçersiz kabilecek yapay çağrıların neslinden kaçınmak için önemlidir. Bu prosedür, farklı solid tümör tiplerinin lezyonu arasındaki mutasyonun belirlenmesi için tüm genomu sorgulamayı amaçlayan tüm genom dizileme çalışmalarına da uygulanabilir.Kanser araştırma alanında, bu teknikler kişiselleştirilmiş ve etkili hedefli tedaviler tasarlamayı amaçlayan önemli klinik etkileri ile hastalıkların biyolojisini anlamak için kritik araçlardır.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Farelerde Video Analiz Sistemi kullanma ve bağlamsal cued Korku Klima Testi

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Şizofreni ailesel Riskli Çocuklarda Duygusal Oddball Görev Kullanımı Fronto-limbik Faaliyet Ölçümü

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Bir Otomatik Görüntü İşleme Yaklaşımı ile Fare Sosyallik Deneysel Değerlendirilmesi

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Sıçanlar Pavlovyan Koúullanmıú Yaklaşım Eğitimi

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Duyusal için Veri Toplama ve Otomatik Yüz İfade Analizi Teknoloji Analizi Uygulamalı ve Geçici Analiz Protokolü

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Davranış bozuklukları: Bir Nutraceutical Diyet düzenleyici etkileri izlemek için Yenilikçi Bir Yaklaşım

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Yanal bir Transfibular yaklaşımla Total ayak bileği replasmanı ile ayak bileği osteoartrit tedavisinde

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Yan sıvı perküsyon kaynaklı travmatik beyin yaralanması sonrasında epileptiform deşarj Izlemek için kablosuz video-EEG sisteminin kullanımı

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

Hafif Bilişsel Bozukluğun Etkili Bir Seçici Taramasını Tasarlamak Için Makine Öğrenimi Yaklaşımı

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Otomatik Eğitmen Kullanarak Farelerde Vasıflı Prehension'un Değerlendirilmesi

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...