Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Forfatterne takker Naga Rama kothapalli for hendes arbejde med at udvikle prøveforberedelse til både suspension celler og celle lysat eksperimenter. Desuden vil forfatterne takke NIH (R01GM116116 og R21CA204706) for finansiering.

1. glas celle-selektions sonde fabrikation
<ol><li>Konverter Enkeltløbede glas slanger til en tilspidset sonde med en skarp spids.<ol>
<li>Anbring et glasrør med enkelt boring (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) i klemmerne på en lodret pipette holder, centrere glasset med hensyn til varme spiralen og stram for at fastgøre røret på plads. Varme spolen består af en 18-gauge nikkel-chrom modstand wire (~ 60 mm i længden) rullet rundt om en metalstang (diameter = 3,90 mm) 2,5 gange.</li>
		<li>Indstil glas slangen med temperatur program 19,5 (producentens enhed). Denne parameter kan ændres for et bestemt instrument.</li>
		<li>Sæt magnet stemplet på 4 (producentens enhed). Denne parameter kan ændres for et bestemt instrument.</li>
		<li>Udløser magnetventilen for at trække i glas slangen. Dette trin opretter to sonder sammensmeltet ved spidsen.</li>
		<li>Brug pincet til at klippe ~ 1 mm væk fra spidsen af hver sonde, hvilket skaber en åbning på ~ 10 μm i diameter ved sondespidsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bøj glas sonden for nem kobling til ICMP/single-Probe SCMS opsætningen.<ol>
<li>Sæt en trukket glas sonde ind i microforge, positionering spidsen ~ 3 mm over platin varmeledning.</li>
		<li>Drej varmen på platin ledningen til 30% af den maksimale temperatur.</li>
		<li>Bøj sonden ~ 45 ° fra den oprindelige position (figur 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. integreret celle manipulation platform samling
<ol><li>Anbring det inverterede mikroskop, mikroinjektor og to celle manipulerings systemer på et motoriseret bord for nem kobling med massespektrometer.<ol>
<li>Ændre en af celle manipulation systemer til at rumme en enkelt-sonde ved at udskifte enden med en arm klemme.</li>
		<li>Brug en plastik sprøjte med en nål til at fylde mikroinjektoren med mineralolie. Undgå bobler i slangen, da dette vil påvirke sugning.</li>
		<li>Udskift det inverterede mikroskop med den opvarmede plade. Indstil den opvarmede plade ved 37 °C før analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indstil enheden til valg af glas celle.<ol>
<li>Sæt glas celle markerings sonden inde i mikroinjektoren i metal holderen ved at placere den lange (ikke-bøjede) side i kapillar holderen og stramme skruen for at fastgøre sonden på plads. Anbring sondens spids vinkel parallelt med den opvarmede plade. Forsigtig: glas sonden er meget skarp og skrøbelig, og den bryder let. Beskyt dine øjne, og vær ekstra forsigtig, når du indsætter sonden i mikroinjektoren.</li>
		<li>Fastgør metal holderen til mikroinjektoren til celle manipulerings systemet. Anbring probespidsen nær midten af det inverterede mikroskop-lys.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Opret et udvidet ionoverførings rør til massespektrometer indløbet
<ol><li>Brug en metal skærer til at klippe et stykke rustfrit stål slange (OD: 0,0625 (1/16) i, ID: 0,021 i) ~ 250 mm i længden.</li>
	<li>Foranstaltning 135 mm fra enden og placere en metal vildt, så ~ 135 mm vil blive udsat for atmosfæren og ~ 115 mm vil være inde i massespektrometer. Fastgør vildtlevende med to skruenøgler for at stramme den.</li>
</ol>4. par ICMP med en enkelt sonde setup
<ol><li>Fastgør glas sliden, der indeholder enkelt-sonden, i armklemmen i celle manipulerings systemet. Bemærk: single-sonder er fremstillet i henhold til en tidligere offentliggjort protokol48 med to mindre ændringer i den aktuelle undersøgelse: Nano-ESI-senderen er lavet længere for nem kobling til massespektrometer, og enkelt-probes er limet til glasset side på højre side for at undgå interferens med den rumlige bevægelse af glas celle markerings anordningen (figur 2).</li>
	<li>Tilslut den opløsningsmiddel-giver kapillar til en ledende Union ved at placere kapillar i ærmet (1/16 x .005 in) af plastik ferrule og finger-stramning montering.<ol>
<li>Tilslut den anden side af den ledende fagforening til en kapillar (ID: 40 μm, OD: 150 μm), som er forbundet til en sprøjte, der indeholder prøveudtagnings væsken, ved at placere kapillar i ærmet (1/32 x .007 in) og stramme monteringen. Der anvendes acetonitril med 0,1% myresyre som prøve opløsningsmiddel i disse eksperimenter. Bemærk: prøve opløsningsmidlet er fleksibelt, men det bør primært indeholde acetonitril (eller acetonitril med myresyre for bedre ionisering) til en hurtig mikroskala-celle lysis.</li>
		<li>Fastgør sprøjten i sprøjtepumpen på massespektrometer.</li>
		<li>Anbring Ionisation spændings ledningen på en kobberledning, der er fastgjort til den ledende fagforening.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nano-ESI-emitter ~ 1 mm til åbningen af det forlængede ionoverførings rør.<ol>
<li>Brug celle manipulerings systemet til at styre enkelt sondens rumlige bevægelser, og Anbring Nano-ESI-emitter centralt foran den forlængede ionoverførings slange.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. forberedelse af prøveudtagning med suspenderede celler
<ol><li>Dagen før analyse (~ 18-24 h), frø ud celler til afprøvning i en cellekultur kolbe (T25). K562 humane myeloid leukæmiceller bruges som modeller i dette studie.<ol>
<li>Varme 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% syntetisk føtale kvægserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 °C i 30 min.</li>
		<li>Frø ~ 1 x 106 celler i et samlet volumen på 10 ml ved at kombinere celler med varmt medium. Brug normalt en 10 mL pipette til at placere 8 mL RPMI-medium i en celle dyrknings kolbe. Brug derefter en 2 mL pipette til at sætte 2 mL konfluent K562 celler mediet til ~ 1 x 106 celler.</li>
		<li>Cellerne inkurueres ved 37 °C og 5% CO2 indtil analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered celler til analyse.<ol>
<li>Der afpipetteres celler fra celle dyrknings kolben til et 15 mL centrifugeglas.</li>
		<li>Drej cellerne ned ved 400 x g og 37 °c i 5 min. og kassér supernatanten.</li>
		<li>Gensuspension af celler i 4 mL RPMI-medium indeholdende lægemiddelstoffet ved den ønskede behandlings koncentration. Bemærk: ved analyse af kontrol celler skal cellerne resuspenderes i 4 mL RPMI-medium og springe til trin 6.</li>
		<li>Cellerne inkurueres i varigheden af behandlingstiden ved 37 °C og 5% CO2.</li>
		<li>Drej cellerne ned ved 400 x g og 37 °c i 5 min. Aspirer supernatanten.</li>
		<li>Cellerne resuspenderes i 10 mL PBS og centrifugeres ved 400 x g og 37 °c i 5 min. Efter centrifugering kasseres supernatanten. Gentag dette trin 3 gange for at minimere påvisning af lægemiddel fra ekstracellulære bestanddele.</li>
		<li>Resuspender cellerne i 4 mL PBS til analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Udfør SCMS-målinger ved hjælp af ICMP/single-sonde setup
<ol><li>Tilpas parametrene for massespektrometer for eksperimentet.<ol>
<li>Vælg Definer scanningunder overskriften scanningstilstand i instrument softwaren. Brug en opløsning på 60.000 m/∆ m ved m/z 400, 1 mikroscanning, 100 MS maksimal indsprøjtningstidspunkt og automatisk forstærkning (AGC) på. Et masse område (m/z) af 100-1000 blev udnyttet til forsøgene. Parametrene kan ændres ud fra instrument modellen.</li>
		<li>Under sprøjtepumpeskal du vælge en strømningshastighed på 150 NL/min. strømningshastigheden skal optimeres for hvert eksperiment.</li>
		<li>Vælg NSI source og anvende en spænding på ~ 4,5 kV. Denne parameter skal også optimeres for hvert eksperiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tænd for det inverterede mikroskop (med 40x forstørrelse valgt for både toppladen og bund linsen) og Tilslut den til USB-porten på en bærbar computer for at optage live-video-feeds. Tænd for den opvarmede plade og sæt den til 37 °C.</li>
	<li>Gå til fanen Hent data på computeren, og vælg kontinuerligt under Hent tid.</li>
	<li>Forbered prøven til analyse.<ol>
<li>Der afpipetteres 2-3 mL prøve i låget på en lille Petri skål (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 Anbring prøven i midten af lyset fra det inverterede mikroskop oven på den opvarmede plade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered glas celle-selektions sonden til analyse. Brug celle manipulerings systemet til at flytte sonden, så spidsen er fokuseret under det inverterede mikroskop i samme plan som cellerne.</li>
	<li>Vælg en enkelt celle til analyse.<ol>
<li>Brug celle manipulerings systemet til at flytte celle markerings sondespidsen til en målcelle. Denne proces overvåges ved hjælp af det inverterede mikroskop. Bemærk: Hvis spidsen af celle Valgs sonden ikke kan koncentreres i samme plan som cellerne, er det muligt, at den bøjede del af sonden ikke er korrekt vinklet. Juster placeringen af celle markerings sonden, indtil begge sonde spidser kan fokuseres sammen med celler under mikroskopet.</li>
		<li>Drej forsigtigt håndtaget på mikroinjektoren for at justere positionen af mineralolien inde i slangen. En blid sugning leveres af mikroinjektoren for at sikre den målrettede celle til celle Valgs sondespidsen. Bemærk: Hvis cellen ikke kan optages af celle Valgs sonden gennem sugekraften, skal du kontrollere celle Valgs sonden for at sikre, at den er fuldt indsat i kapillar holderen. Desuden inspicere mineralolie niveauer i mikroinjektoren og slanger, og udvise luft, hvis der er nogen.</li>
		<li>Brug celle manipulerings systemet til at flytte cellen ved celle markerings probespidsen til enkeltprobe spidsen ved hjælp af et digitalt mikroskop, der er fokuseret på enkelt sondespidsen for at overvåge denne proces. Når der rører sig, inducerer en lille acetonitrildråbe ved single-probespidsen en hurtig Liechten af cellen, og derefter ioniseres celle lysatet straks til on-line MS-analyse. Bemærk: da den valgte celle er fastgjort til celle markerings sondespidsen gennem en blid sugning, kan denne celle muligvis løsnes under overførslen til en enkelt sonde spids. Derfor, hvis ionsignaler af typiske cellulære lipider (Se repræsentative resultater nedenfor) ikke observeres inden for 5 s, er det muligt, at cellen blev løsnet, og udvælgelsen af en anden celle er nødvendig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den integrerede celle manipulation og analyseplatform er konstrueret til at udvide alsidigheden af enkelt-sonde MS-metoden, der giver mulighed for on-line, hurtig analyse af ikke-vedhængende celler i et nær-Native miljø. En stor fordel ved teknikken er, at minimal prøveforberedelse er nødvendig, så cellerne analyseres under forhold, der efterligner deres standardtilstand. Især, individuelle celler af interesse kan visuelt identificeres og udvælges, minimere indflydelsen af matrix effekt på MS ionisering effektivitet samtidig bevare celler i deres naturlige miljø, så resultaterne er mere repræsentative celler ' Native status (figur S3). Denne teknik kan potentielt bruges til at studere patient celler suspenderet i biofluider i fremtidige undersøgelser. En anden fordel ved denne teknik er den fleksible udvælgelse af prøve opløsningsmidlet. Det er vigtigt at inkludere acetonitril som det vigtigste prøve opløsningsmiddel, således at der hurtigt kan forekomme mikroskopi. Potentielt kan interne standarder (f. eks. isotopisk mærkede lægemidler) tilsættes til prøvetagnings opløsningsmidlet til kvantificering af interesse molekyler (f. eks. lægemiddel molekyler) fra individuelle celler, herunder dem, der kan spille en central rolle i at revolutionere behandling af lægemidler i fremtiden54.
Selv om dette integrerede system bekvemt kan anvendes til at analysere brede celleområder, er en begrænsning af metoden, at hverken enkelt sonde-eller celle Valgs sonden er kommercielt tilgængelig; dikterer behovet for optimering af mange parametre (f. eks. strømningshastighed, spænding, længde mellem Nano-ESI-emitter og ionoverførings slanger osv.) før hvert eksperiment. På grund af den lille enkelt sonde-og celle Valgs sonde kan miljøforstyrrelser (f. eks. luftstrøm) desuden medføre vanskeligheder med at etablere et kryds mellem de to sonder. En kortsigtet løsning er bøjning af cellen-selektions sonde tæt på enden for at minimere længden af nedtrapning. Fremtidigt arbejde omfatter udvikling af en bolig til at omslutte de kritiske dele af opsætningen for at minimere miljømæssige virkninger. På grund af den begrænsede mængde af cellulære indhold og korte anskaffelses tid (~ 2-3 s) fra en celle, MS/MS analyse kan kun udføres for relativt rigelige arter. Andre faktorer, der påvirker detektionsfølsomhed omfatter den undertrykte ionisering effektivitet på grund af indførelsen af matrix sammen med cellen og potentielle ion tab gennem den udvidede ion Transfer slange.

Den menneskelige biologi, især sygdoms biologi, bliver i stigende grad opfattet som et resultat af aktiviteter på de enkelte cellers niveau, men de traditionelle analytiske metoder, såsom Liquid kromatografi massespektrometri (LCMS), anvendes generelt til at analysere prøver fremstillet af populationer af celler, hvorimod de erhvervede molekylære oplysninger ikke præcist kan repræsentere de kemiske processer på det individuelle celleniveau. Disse standard, traditionelle metoder er ude af stand til at skelne virkningerne af cellulære heterogenitet på en analytisk måling, og processen med at ødelægge og blande cellerne til at forberede lysatet potentielt fører til ændring eller tab af cellulære komponenter1,2. Disse begrænsninger af de traditionelle metoder er især vigtige i analysen af patient celler, hvor de opnåede prøver kan indeholde en kompleks blanding af mange forskellige celletyper. For at afhjælpe disse mangler udvikles og anvendes der i stigende grad enkelt celle molekylære metoder, herunder enkelt celle massespektrometri (SCMS)-metoder, til bioanalyse, især af cellulære metabolitter og lav molekylvægt biomolekyler3,4.
De første SCMS teknikker udviklet brugt vakuum-baserede teknikker til at udføre analyserne under ikke-omgivende betingelser2,5,6,7,8,9, 10,11. Ikke-omgivende SCMS teknikker er i stand til at analysere cellulære lipider og metabolitter, men kræver prøve forbehandling under kunstige betingelser, og derfor er ikke egnet til real-time analyse. Prøve forberedelsesprocessen for ikke-omgivende analyse omfatter tilsætning af matrixkomponenter, og dette præparat kan ændre cellulære komponenter fra deres naturlige miljø12. Derfor anvendes omgivende massespektrometri (MS) teknikker, som ikke kræver et vakuum til prøvetagnings miljøet, til at analysere celler i et nærmiljø. Ikke at have et vakuum miljø giver mulighed for alsidighed i den eksperimentelle design; kameraer kan tilføjes for at overvåge den cellulære proces og blødere ioniserings teknikker kan kombineres med adskillelse teknikker til at modtage bedre information fra hvert enkelt celle eksperiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 af41,42.
Single-Probe SCMS-metoden er en omgivende teknik, der analyserer levende, pattedyrs Cancer cellelinjer i et nær-Native miljø21,43,44,45,46. Desuden har enkelt Probe-anordningen været anvendt til andre massespektrometri-applikationer, herunder analyse af ekstracellulære molekyler i flercellede sfæroider og MS Imaging af væv47,48,49 ,50,51,52. Men da celle immobilisering på substrater er nødvendig for denne metode, kan affjedrings celler ikke analyseres direkte ved hjælp af denne teknik3,53. Derfor kunne SCMS-systemet med enkelt sonde ikke anvendes direkte til at udtage prøver af ikke-klæbende enkeltceller, såsom ikke-vedhæng ende cellelinjer eller ophængs celler isoleret fra patientens blod eller andre kropsvæsker54. I dette arbejde, en integreret celle manipulation platform (ICMP) er kombineret med enkelt-Probe SCMS teknik til at analysere levende, suspension celler on-line med minimal Prøveforberedelse (figur 1)46. ICMP består af en inverteret mikroskop til at overvåge cellevalg, en glas celle-selektions sonde, en mikroinjektor til at indfange individuelle flydende celler, en opvarmet plade til at opretholde cellulære temperatur, to celle manipulation systemer til at styre rumlige bevægelser af både glas celle-selektions sonden og enkelt sonde, og et digitalt mikroskop for at observere celle overførsel fra celle Valgs sonden til enkelt sondespidsen. Fremstillingen af Single-sonden er beskrevet i tidligere publikationer og vil ikke blive behandlet her21,48. ICMP/single-Probe systemet er koblet til et massespektrometer med høj opløsning. Denne integrerede opsætning giver mulighed for prøvetagning af identificerede enkeltceller fra komplekse biologiske prøver med minimal effekt fra matrix molekyler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

Enkelt celle massespektrometri (SCMS) muliggør følsom detektion og nøjagtig analyse af brede intervaller af cellulære arter på individuelt celleniveau. Enkelt-sonden, en mikroskala prøveudtagning og ioniserings anordning, kan kobles med et massespektrometer til on-line, hurtig SCMS analyse af cellulære bestanddele under omgivende forhold. Tidligere, enkelt-sonde SCMS teknik blev primært brugt til at måle celler immobiliseret på et substrat, der begrænser de typer af celler til undersøgelser. I den aktuelle undersøgelse er single-Probe SCMS-teknologien blevet integreret med et celle manipulerende system, der typisk anvendes til in vitro-befrugtning. Denne integrerede celle manipulerings-og analyseplatform bruger en celle Valgs sonde til at indfange identificerede individuelle flydende celler og overføre cellerne til enkelt probespidsen til mikroskala lysis efterfulgt af umiddelbar massespektrometri analyse. Denne opsamling og overførsel proces fjerner cellerne fra den omgivende løsning før analyse, minimerer indførelsen af matrix molekyler i massespektrometri analyse. Denne integrerede opsætning er i stand til SCMS analyse af målrettede patient-isolerede celler til stede i kropsvæsker prøver (f. eks urin, blod, spyt, osv.), giver mulighed for potentielle anvendelser af SCMS analyse til humanmedicin og sygdoms biologi.

Første, ubehandlet K562 celler anvendes til at etablere den eksperimentelle metode. I et typisk SCMS-eksperiment kan der observeres tydelige ændringer af massespektra fra overførsel af en celle, under detektering af cellulære indhold, og efter endt måling (figur S1). Tre almindelige cellulære lipid toppe (phosphatidylcholin, PC), herunder PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), og pc (38:5) (m/z 808,583), overvåges for at sikre, at cellen er korrekt overført og cellulære indholdet registreres (figur S2)21,43,46,55,56. Hvis der ikke ses lipidtoppe inden for 5 s, ændres mineralolie niveauet i mikroinjektoren for at reducere indsugningen i cellen ved celle markerings sondespidsen; der skal udvises forsigtighed, så der ikke presses mineralolie ud fra celle Valgs sonden. Identiteten af mange pc'er i masse området af m/z 750-850 er bekræftet ved hjælp af MS/MS på ubehandlet celle lyat prøver (figur 3, figur S2, tabel 1)46.
K562 celler er også udsat for behandling med forskellige stof forbindelser for at udvide alsidigheden af metoden. K562 celler inkueres med Gemcitabin (1 μM) og Taxol (1 μM) for 1 t og OSW-1 (100 nM, 1 μM) for henholdsvis 4 h og 2 timer. Cellerne vaskes derefter med PBS for at minimere påvisning af stof forbindelser fra ekstracellulær indhold. Bidraget fra matrix (f. eks. ioner fra cellekulturmedium, PBS og solvens) til massespektra af cellulær indhold kan elimineres gennem data subtraktion på grund af deres signifikant forskellige ionsignaler (figur S3). Alle tre lægemiddelstoffer er detekteret ved hjælp af ICMP/single-sonde MS setup (figur S4)46. Disse resultater tyder på denne metode kan bruges til at studere intracellulære lipider, narkotika, og metabolitter på enkelt celleniveau fra celler i opløsning i en nær-indfødte miljø.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> Figur 1. Eksperimentelt setup til MS-eksperimenter med enkelt affjedrings celler. (A) den integrerede celle manipulerings platform (ICMP) kombineret med et massespektrometer. (B) skematisk til analyse af suspenderede celler. (C) eksperimentel visning af K562 celler, der skal vælges ved hjælp af celle Valgs sonden. Genoptrykt med tilladelse fra Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> Figur 2. Billeder af en modificeret enkelt-sonde og en celle-selektions sonde anvendes til enkelt suspension celle MS eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> Figur 3. Zoomet massespektrum fra en enkelt celle, der viser de repræsentative arter (m/z 750-850). Kemiske strukturer bekræftes ved hjælp af MS/MS-analyse (figur S1). Genoptrykt med tilladelse fra Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Drug molekyle*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Masse fejl (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabin + H] +
</td>
			<td>264,076 af</td>
			<td>11,32 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol + na] +
</td>
			<td>876,318 af</td>
			<td>2,74 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 + na] +
</td>
			<td>895,445 af</td>
			<td>0,89 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellulære lipider</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:4) + H] +
</td>
			<td>754,535 af</td>
			<td>3,71 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:3) + H] +
</td>
			<td>756,551 af</td>
			<td>3,44 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:2) + H] +
</td>
			<td>758,569 af</td>
			<td>0,66 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:5) + H] +
</td>
			<td>780,551 af</td>
			<td>3,07 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:4) + H] +
</td>
			<td>782,568 af</td>
			<td>2,17 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:3) + H] +
</td>
			<td>784,585 af</td>
			<td>0,64 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:7) + H] +
</td>
			<td>804,551 af</td>
			<td>4,1 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:6) + H] +
</td>
			<td>806,567 af</td>
			<td>2,48 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:5) + H] +
</td>
			<td>808,583 af</td>
			<td>2,72 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:4) + H] +
</td>
			<td>810,601 af</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (40:7) + H] +
</td>
			<td>832,583 af</td>
			<td>3,12 af</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Identificerede mobil komponenter ved hjælp af ICMP/single-Probe opsætningen. Påvisning af alle narkotika forbindelser blev bekræftet ved at sammenligne MS/MS resultater med standard sammensatte.

Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

En integreret celle manipulerings platform er udviklet til brug sammen med en enkelt-Probe massespektrometri setup til on-line analyse af individuelle affjedrings celler under omgivende forhold.

Integreret celle manipulation platform kombineret med enkelt-sonde for massespektrometri analyse af narkotika og metabolitter i enkelt suspension celler

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Da denne metode analyserer celler fra opløsning, kan det bruges til at studere celler i et nært hjemmehørende miljø. Dette omfatter analyse af patientafledte celleprøver. Denne teknik kræver lidt at ingen prøve forberedelse af celler.Derfor kan vi analysere individuelle celler online under omgivende forhold, som giver os mulighed for at udforske cellulære heterogenitet. Denne teknik kan anvendes til at studere flydende biopsier fra en række forskellige sygdomsstater, da den kan analysere forskellige typer celler direkte isoleret fra patientprøver. For at omdanne enkeltbommeglasslanger til en tilspidset sonde med en skarp spids skal du først placere et enkelt boreglasrør i klemmerne på en lodret pipetteholder, centrere glasset med hensyn til varmespolen og stramme for at fastgøre røret på plads.Varmespolen består af en 18 gauge nikkel chrom modstand wire rullet omkring en metalstang 2,5 gange. Indstil glasslangen med temperaturprogram 19.5. Indstil magnetstemplen til fire.Aftræk magneten til at trække i glasslangen. Dette trin skaber to sonder smeltet på spidsen. Brug trøjer til at skære ca. en millimeter væk fra spidsen af hver sonde, hvilket skaber en åbning på ca. 10 mikron i diameter ved sondespidsen.At bøje glassonden for nem kobling til ICMP, enkelt sonde SCMS oprettet. Først satte en trukket glassonde ind i mikroforget. Placer toppen ca. tre millimeter over platinvarmeledningen.Drej derefter varmen på platinledningen til 30% af den maksimale temperatur. Bøj sonden ca. 45 grader fra den oprindelige position. Anvend den omvendte mikroskopmikrik i to cellemanipulationssystemer på et motoriseret bord for nem kobling med massespektrometeret.For at opsætte glascellevalgsanordningen skal du indsætte glascellevalgsonden inde i mikroinjektorens metalholder ved at placere det lange dias i kapillærholderen og stramme skruen for at fastgøre sonden. Aner sondens spidser vinklet parallelt med den opvarmede plade. Fastgør mikroinjektorens metalholder ind i cellemanipulationssystemet.Placer derefter sondespidsen nær midten af det omvendte mikroskoplys. Fastgør glasrutsjebanen, der indeholder den enkelte sonde, ind i armklemmen i cellemanipulationssystemet. Tilslut opløsningsmidlet, der giver kapillær til en ledende union ved at placere kapillær i ærmet af plast ferrule og finger stramning montering.Tilslut den anden side af den ledende forening til en kapillær, som er forbundet med en sprøjte, der indeholder prøvetagningsopløsningsmidlet, ved at placere kapillæren i muffen og stramme monteringen. Brug acetonitrile med 0,1% myresyre som prøvetagningsopløsningsmiddel i disse forsøg. Fastgør sprøjten i sprøjtepumpen på massespektrometeret.Anvend nanoelektrosprayioniseringen eller nano ESI-emitteren ca. en millimeter til åbningen af det udvidede ionoverførselsrør. Brug cellemanipulationssystemet til at styre den enkelte sondes spacialbevægelser og placere nano-ESI-udlederen centralt foran den forlængede ionoverførselsslange. Der pipettes cellerne fra cellekulturkolben i et centrifugerør på 15 milliliter.Drej cellerne ved 400 gange G i 37 grader Celsius i fem minutter og kassér supernatanten. Resuspend cellerne i fire milliliter RPMI medium, der indeholder stoffet sammensatte ved den ønskede behandling koncentration. Tilpas de eksperimentelle parametre for massespektrometeret.Vælg definer scanning under instrumentsoftwarens scanningstilstandsoverskrift. Brug en opløsning på 60.000 ved M over Z 400, en mikroscanning 100 millisekund maksimal injektionstid og automatisk få kontrol på. Under sprøjtepumpe skal du vælge strømningshastigheden på 150 nanoliter pr. minut.Vælg NSI-kilde, og anvend en spænding på ca. 4,5 kilovolt. Tænd for det omvendte mikroskop ved 40 gange forstørrelse valgt til både toppladen og bundlinsen. den til USB-porten på en bærbar computer for at optage live videofeeds.Tænd for den opvarmede plade og sæt den til 37 grader Celsius. På computeren skal du gå til fanen hent data og vælge kontinuerligt under anskaffet tid. For at forberede prøven til analyse, pipette to til tre af prøven i låget af en lille petriskål.Placer prøven i midten af lyset fra det omvendte mikroskop oven på den opvarmede plade. Forbered glascellevalgsonden til analyse. Brug cellemanipulationssystemet til at flytte sonden, så dens top er fokuseret under den omvendte mikrocsope i samme plan som cellerne.Brug cellemanipulationssystemet til at flytte spidsen af cellemarkeringssonder til en målrettet celle til analyse. Denne proces overvåges ved hjælp af det omvendte mikroskop. Drej forsigtigt mikroinjektorens håndtag for at justere mineraloliens position inde i slangen.En blid sugning leveres af mikroinjektoren for at fastgøre den målrettede celle til cellevalgssondens spids. Brug cellemanipulationssystemet til at flytte cellen ved cellevalgssonden til den enkelte sondespids ved hjælp af et digitalt mikroskop med fokus på den enkelte sondespids til at overvåge denne proces. Ubehandlede K-562 celler anvendes til at etablere den eksperimentelle metode.I et typisk SCMS-eksperiment kan der observeres tydelige ændringer i massespektre fra overførsel af en celle under påvisning af celleindhold og efter endt måling. Tre almindelige cellulære lipidtoppe, herunder PC 34:4, PC 36:4 og PC 38:5, overvåges for at sikre, at cellen overføres, og at mobilindholdet registreres. Identiteten af mange pc'er i masseområdet 750 til 850 bekræftes ved hjælp af MSMS på ubehandlede cellelysatprøver.Ved hjælp af ICMP enkelt sonde MS oprettet, Gemcitabine, Taxol og OSW1 blev opdaget efter inkubation med K-562 celler. Disse resultater tyder på denne metode kan bruges til at studere intracellulære lipider, narkotika, og metabolitter på enkelt celleniveau fra celler i opløsning i en nær indfødte miljø. Husk at placere glascellemarkeringssonden sikkert i den universelle pipetteholder, så sugning kan påføres tilstrækkeligt.Denne metode kan også anvendes på patient afledte prøver til at skelne forskelle mellem cellulære metabolitter fra en række forskellige celletyper, som giver os mulighed for at få en bedre forståelse af disse sygdom stater. Efter at have udviklet denne metode, vi kunne potentielt gennemføre kvantificering af narkotikaforbindelser på enkelt celleniveau. Når du arbejder med celler, er det vigtigt at have passende personlige værnemidler, herunder laboratoriekittel og handsker.Der kan anvendes yderligere øjenslid, når der arbejdes med glas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Målrettede Metabolomics fra biologiske kilder Brug Ultraperformance væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekventering af Plant Wall Heteroxylans Brug Enzymatisk, Chemical (Methylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering af Ambient massespektrometri med brug af Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

En praktisk metode til udvinding og analyse med højtryks væskekromatografi catecholamin neurotransmittere og deres metabolitter

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time ånde analyse ved hjælp af sekundære Nanoelectrospray ionisering koblet til høj opløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillær elektroforese massespektrometri for encellede Metabolomics i Live Frog (Xenopus laevis) embryoner

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Kovalent mærkning med Diethylpyrocarbonat til at studere protein højere ordensstruktur ved massespektrometri

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Kapillær elektroforesebaseret hydrogen/deuteriumudveksling til konformationskarakterisering af proteiner med top-down massespektrometri

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Celle-afstamning guidet massespektrometri proteomics i udviklingen (frø) embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...