Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

De auteurs danken Naga Rama Ninne voor haar werk in het ontwikkelen van sample voorbereiding voor zowel schorsing cellen en cel lysate experimenten. Bovendien, de auteurs bedanken de NIH (R01GM116116 en R21CA204706) voor de financiering.

1. glas cel-selectie probe fabricage
<ol><li>Zet single-boring glasbuis in een taps toelopende sonde met een scherpe tip.<ol>
<li>Plaats een enkele boring glazen buis (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) in de klemmen van een verticale pipet houder, het centreren van het glas met betrekking tot de verwarming spoel en draai aan de buis op zijn plaats te beveiligen. De verwarming Coil bestaat uit een 18-gauge nikkel-chroom weerstand draad (~ 60 mm in lengte) opgerold rond een metalen staaf (diameter = 3,90 mm) 2,5 keer.</li>
		<li>Stel de glazen buis met temperatuur programma 19,5 (fabrikant eenheid). Deze parameter kan voor een bepaald instrument worden gewijzigd.</li>
		<li>Stel de solenoïde plunjer op 4 (fabrikant Unit). Deze parameter kan voor een bepaald instrument worden gewijzigd.</li>
		<li>Trigger de solenoïde om de glazen buis te trekken. Deze stap maakt twee sondes gesmolten op de tip.</li>
		<li>Gebruik een pincet te snijden ~ 1 mm uit de buurt van het puntje van elke sonde, het creëren van een opening van ~ 10 µm in diameter op de sonde tip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Buig de glazen sonde voor eenvoudige koppeling aan de ICMP/single-probe SCMS Setup.<ol>
<li>Stel een getrokken glazen sonde in de microforge, de positionering van de Tip ~ 3 mm boven de platina verwarming draad.</li>
		<li>Zet de warmte op de platinadraad tot 30% van de maximale temperatuur.</li>
		<li>Buig de sonde ~ 45 ° vanaf de oorspronkelijke positie (Figuur 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. geïntegreerde cel manipulatie platform assemblage
<ol><li>Plaats de omgekeerde Microscoop, microinjector, en twee Cell manipulatiesystemen op een gemotoriseerde tafel voor eenvoudige koppeling met de massaspectrometer.<ol>
<li>Wijzig een van de cel manipulatiesystemen om een single-probe tegemoet door het vervangen van het einde met een arm klem.</li>
		<li>Gebruik een plastic spuit met een naald om de microinjector met minerale olie te vullen. Vermijd bubbels in de buis, omdat dit zal van invloed zijn zuigen.</li>
		<li>Vervang de plaats van de omgekeerde Microscoop met de verwarmde plaat. Zet de verwarmde plaat op 37 °C voorafgaand aan de analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel het glas cel-selectie apparaat in.<ol>
<li>Plaats de glazen cel-selectie sonde in de metalen houder van de microinjector door het plaatsen van de lange (niet-gebogen) kant in de capillaire houder en aanscherping van de schroef om de sonde op zijn plaats te beveiligen. Plaats de hoek van de sondepunt evenwijdig aan de verwarmde plaat. Let op: de glazen sonde is zeer scherp en breekbaar, en het breekt gemakkelijk. Bescherm uw ogen en wees extra voorzichtig tijdens het plaatsen van de sonde in de microinjector.</li>
		<li>Beveilig de metalen houder van de microinjector in de cel manipulatie systeem. Plaats de sonde tip in de buurt van het midden van de omgekeerde Microscoop licht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Maak een Extended Ion Transfer tube voor de massaspectrometer inlaat
<ol><li>Gebruik een metalen mes om een stuk van roestvrijstalen buizen snijden (OD: 0,0625 (1/16) in, ID: 0,021 in) ~ 250 mm in lengte.</li>
	<li>Maatregel 135 mm van het einde en plaats een metalen wilde zo ~ 135 mm zal worden blootgesteld aan de atmosfeer en ~ 115 mm zal worden in de massaspectrometer. Beveilig de wilde met behulp van twee sleutels aan te scherpen.</li>
</ol>4. Koppel de ICMP met een single-probe Setup
<ol><li>Beveilig de glazen glijbaan met de single-probe in de arm klem van de cel manipulatie systeem. Nota: de enig-sondes worden vervaardigd volgens een eerder-gepubliceerd protocol48 met twee minder belangrijke veranderingen in de huidige studie: de nano-ESI zender wordt gemaakt langer voor gemakkelijke koppeling aan de massaspectrometer, en de enig-sondes worden gelijmd aan het glas aan de rechterkant om te voorkomen dat de ruimtelijke beweging van het glas-cel-selectie apparaat wordt verstoord (Figuur 2).</li>
	<li>Sluit het oplosmiddel-het verstrekken van capillaire aan een geleidende Unie door het plaatsen van de capillaire in de mouw (1/16 x .005 in) van de plastic fitting en vinger-aanscherping van de fitting.<ol>
<li>Sluit de andere kant van de geleidende Unie aan een capillaire (ID: 40 µm, OD: 150 µm), die is aangesloten op een spuit met de bemonstering oplosmiddel, door het plaatsen van de capillaire in de mouw (1/32 x .007 in) en aanscherping van de fitting. Gebruik acetonitril met 0,1% vorm zuur als de bemonstering oplosmiddel in deze experimenten. Nota: het bemonsterings oplosmiddel is flexibel, maar het zou hoofdzakelijk acetonitril (of acetonitril met vormend zuur voor betere ionisatie) voor een snelle Microscale cel lysis moeten bevatten.</li>
		<li>Beveilig de spuit in de spuitpomp op de massaspectrometer.</li>
		<li>Plaats het ionisatie spannings koord op een koperdraad die aan de geleidende Unie wordt gehecht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de nano-ESI emitter ~ 1 mm aan de opening van de Extended Ion Transfer Tube.<ol>
<li>Gebruik de cel manipulatie systeem om de ruimtelijke bewegingen van de single-probe controle en de positie van de nano-ESI emitter centraal in de voorkant van de Extended Ion Transfer slang.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. geschorste cel monstervoorbereiding
<ol><li>De dag voor de analyse (~ 18-24 h), zaad uit cellen voor het testen in een cel cultuur kolf (T25). K562 menselijke myeloïde leukemie cellen worden gebruikt als modellen in deze studie.<ol>
<li>Warmte 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% synthetisch foetale boviene serum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C voor 30 min.</li>
		<li>Zaad ~ 1 x 106 cellen in een totaal volume van 10 ml door het combineren van cellen met warm medium. Gebruik in het algemeen een pipet van 10 mL om 8 mL RPMI medium in een cel kweek kolf te plaatsen. Gebruik vervolgens een pipet van 2 mL om 2 mL Confluent K562 cellen het medium voor ~ 1 x 106 cellen te zetten.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 tot analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellen voorbereiden voor analyse.<ol>
<li>Pipet cellen uit de cel cultuur kolf in een 15-mL centrifugebuis.</li>
		<li>Spin cellen naar beneden bij 400 x g en 37 ° c voor 5 min en gooi de bovendrijvende.</li>
		<li>De cellen opnieuw op te schorten in 4 mL RPMI medium dat de geneesmiddelen bevat bij de gewenste behandelings concentratie. Opmerking: voor de analyse van de controlecellen, de cellen opnieuw op te schorten in 4 mL van RPMI medium en ga naar stap 6.</li>
		<li>Incubeer de cellen voor de duur van de behandelingstijd bij 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Spin cellen neer bij 400 x g en 37 °c voor 5 min. aspireren de bovendrijvende.</li>
		<li>De cellen worden opnieuw opgeschort in 10 mL PBS, en centrifugeren bij 400 x g en 37 °c voor 5 min. Na het spinnen, gooi de bovendrijvende. Herhaal deze stap 3 keer om de opsporing van drugs te minimaliseren van extracellulaire bestanddelen.</li>
		<li>Hersuspendeer de cellen in 4 mL PBS voor analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Voer SCMS metingen uit met behulp van de ICMP/single-probe Setup
<ol><li>Parameters voor de massaspectrometer voor het experiment aanpassen.<ol>
<li>Selecteer in het onderdeel scanmodus van de instrument software de optie Scan definiëren. Gebruik een resolutie van 60.000 m/∆ m bij m/z 400, 1 MICROSCAN, 100 MS maximale injectietijd, en automatische Gain controle (AGC) op. Een massa bereik (m/z) van 100-1000 werd gebruikt voor de experimenten. Parameters kunnen worden aangepast op basis van het instrumentmodel.</li>
		<li>Selecteer onder spuitpompeen debiet van 150 nl/min. debiet moet worden geoptimaliseerd voor elk experiment.</li>
		<li>Selecteer NSI bron en breng een spanning van ~ 4,5 kV. Deze parameter moet ook voor elk experiment worden geoptimaliseerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zet de omgekeerde Microscoop (met 40x vergroting geselecteerd voor zowel de bovenste plaat en onderkant lens) en sluit deze aan op de USB-poort van een laptop om live-video-feeds vast te leggen. Zet de verwarmde plaat aan en zet deze op 37 °C.</li>
	<li>Ga op de computer naar het tabblad gegevens ophalen en selecteer continu onder tijd ophalen .</li>
	<li>Bereid steekproef voor analyse.<ol>
<li>Pipetteer 2-3 mL monster in het deksel van een klein Petri schaaltje (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 positie van de steekproef in het midden van het licht van de omgekeerde Microscoop op de top van de verwarmde plaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de glas cel-selectie sonde voor analyse. Gebruik de cel manipulatie systeem om de sonde te verplaatsen, zodat de tip is gericht onder de omgekeerde Microscoop in hetzelfde vlak als de cellen.</li>
	<li>Selecteer een afzonderlijke cel voor analyse.<ol>
<li>Gebruik de cel manipulatie systeem om de cel-selectie sonde Tip verplaatsen naar een gerichte cel. Dit proces wordt gecontroleerd met behulp van de omgekeerde Microscoop. Opmerking: als de punt van de cel-selectie sonde niet kan worden gericht in hetzelfde vlak als de cellen, is het mogelijk dat de gebogen deel van de sonde niet geschikt is schuin. Pas de positie van de cel-selectie sonde totdat beide sonde tips kunnen worden gericht, samen met de cellen onder de Microscoop.</li>
		<li>Draai voorzichtig de hendel van de microinjector om de positie van de minerale olie in de slang aan te passen. Een zachte zuiging wordt verstrekt door de microinjector om de gerichte cel aan de cel-selectie sonde uiteinde te beveiligen. Opmerking: als de cel niet kan worden gevangen door de cel-selectie sonde door de zuigkracht, controleer dan de cel-selectie sonde om ervoor te zorgen dat het volledig is opgenomen in de capillaire houder. Bovendien, Inspecteer de minerale olieniveaus in de microinjector en buizen, en verdrijven lucht als er sprake is.</li>
		<li>Gebruik de Cell manipulatie systeem om de cel te verplaatsen op de cel-selectie sonde tip om de single-probe tip, met behulp van een digitale microscoop gericht op de single-probe tip om dit proces te controleren. Bij het aanraken, een kleine acetonitril druppel op de single-probe Tip induceert een snelle lyses van de cel, en vervolgens cel lysate wordt onmiddellijk geioniseerd voor on-line MS analyse. Opmerking: omdat de geselecteerde cel is beveiligd naar de cel-selectie sonde Tip door middel van een zachte zuigkracht, kan deze cel mogelijk los tijdens de overdracht aan de single-probe tip. Daarom, als Ion signalen van typische cellulaire lipiden (Zie representatieve resultaten hieronder) niet worden waargenomen binnen 5 s, is het mogelijk dat de cel werd onbevestigd, en de selectie van een andere cel nodig is.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De geïntegreerde cel manipulatie en analyse platform is gebouwd om de veelzijdigheid van de single-probe MS-methode uit te breiden, waardoor on-line, snelle analyse van niet-aanhangende cellen in een bijna-native omgeving. Een groot voordeel van de techniek is dat minimale monstervoorbereiding nodig is, zodat de cellen worden geanalyseerd in omstandigheden die hun standaard staat na te bootsen. In het bijzonder, individuele cellen van belang kunnen visueel worden geïdentificeerd en geselecteerd, het minimaliseren van de invloed van matrix effect op MS ionisatie-efficiëntie met behoud van cellen in hun natuurlijke omgeving, zodat de resultaten zijn meer representatieve cellen ' native status (figuur S3). Deze techniek kan worden gebruikt voor de studie van patiënt cellen geschorst in biovloeistoffen in toekomstige studies. Een ander voordeel van deze techniek is de flexibele selectie van het sampling oplosmiddel. Het is belangrijk om acetonitril te nemen als de belangrijkste bemonstering oplosmiddel, zodat Microscale lysis kan snel voorkomen. Mogelijk kunnen interne normen (bijv. isotopically-gelabelde geneesmiddelen) worden toegevoegd aan het bemonsterings middel voor de kwantificering van moleculen die van belang zijn (bijv. drug moleculen) uit individuele cellen, waaronder die een sleutelrol kunnen spelen bij een revolutie personaliseren van geneesmiddelen behandelingen in de toekomst54.
Hoewel dit geïntegreerde systeem gemakkelijk kan worden gebruikt om brede waaiers van cellen te analyseren, is een beperking van de methode dat noch de enig-sonde noch cel-selectie sonde commercieel-beschikbaar is; het dicteren van de behoefte aan optimalisering van vele parameters (b.v., stroomtarief, voltage, lengte tussen nano-ESI emitter en ionen overdrachts buizenstelsel, enz.) voorafgaand aan elk experiment. Bovendien, wegens de kleinheid van de enig-sonde en cel-selectie sonde, kunnen de milieuverstoring (b.v., luchtstroom) in moeilijkheden resulteren die een verbinding tussen de twee sondes vestigen. Een oplossing op korte termijn is het buigen van de cel-selectie sonde dicht bij het einde van de lengte van de tapering te minimaliseren. Het toekomstige werk omvat de ontwikkeling van een huisvesting om de kritieke delen van de opstelling te omsluiten om milieugevolgen te minimaliseren. Wegens de beperkte hoeveelheid cellulaire inhoud en de korte verwervings tijd (~ 2-3 s) van een cel, kan de analyse van MS/MS slechts voor vrij overvloedige soorten worden geleid. Andere factoren die de opsporings gevoeligheid beïnvloeden omvatten de onderdrukte ionisatie efficiency toe te schrijven aan de introductie van matrijs samen met de cel en het potentiële ionen verlies door het uitgebreide ionen overdrachts buizenstelsel.

De menselijke biologie, in het bijzonder ziekte biologie, wordt meer en meer begrepen om het resultaat van activiteiten op het niveau van individuele cellen te zijn, maar de traditionele analytische methodes, zoals vloeibare chromatografie massaspectrometrie (LCMS), worden over het algemeen gebruikt om te analyseren monsters bereid uit populaties van cellen, terwijl de verkregen moleculaire informatie niet nauwkeurig kan vertegenwoordigen de chemische processen op de individuele-cel niveau. Deze standaard, traditionele methoden zijn niet in staat om de effecten van cellulaire heterogeniteit te onderscheiden op een analytische meting, en het proces van het vernietigen en mengen van de cellen om de lysate voor te bereiden mogelijk leidt tot de wijziging of het verlies van cellulaire componenten1,2. Deze beperkingen van traditionele methodes zijn vooral belangrijk in de analyse van patiënt cellen, waarin de verkregen steekproeven een complex mengsel van vele verschillende cel types kunnen bevatten. Om deze tekortkomingen te overwinnen, worden de enkelvoudige moleculaire analysemethoden, met inbegrip van SCMS-methoden (single cell Mass spectrometrie), in toenemende mate ontwikkeld en toegepast op bioanalyse, met name van cellulaire metabolieten en laag moleculair gewicht biomoleculen3,4.
De eerste SCMS technieken ontwikkelden gebruikte vacuüm-gebaseerde technieken om de analyses uit te voeren onder niet-omgevingsomstandigheden2,5,6,7,8,9, 10,11. Niet-Ambient SCMS technieken zijn in staat de analyse van cellulaire lipiden en metabolieten, maar vereisen monster voor behandeling onder kunstmatige omstandigheden, en daarom zijn niet geschikt voor real-time analyse. Het monster bereidingsproces voor niet-Ambient analyse omvat de toevoeging van matrix componenten, en deze voorbereiding kan veranderen cellulaire componenten uit hun natuurlijke omgeving12. Daarom, ambient massaspectrometrie (MS) technieken, die niet nodig een vacuüm voor de bemonstering omgeving, worden gebruikt om cellen te analyseren in een bijna-native omgeving. Het niet hebben van een vacuüm milieu staat voor veelzijdigheid in het experimentele ontwerp toe; de camera's kunnen worden toegevoegd om het cellulaire proces te controleren en de zachtere ionisatie technieken kunnen met scheidingstechnieken worden gecombineerd om betere informatie van elk enig-cel experiment4,12,13 te ontvangen ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
De single-probe SCMS methode is een ambient techniek die live analyseert, zoogdier kankercellen lijnen in een bijna-native omgeving21,43,44,45,46. Bovendien is de single-probe-apparaat is gebruikt voor andere massaspectrometrie toepassingen, met inbegrip van analyse van extracellulaire moleculen in multicellulaire sferoïden en MS Imaging van weefsels47,48,49 ,50,51,52. Nochtans, aangezien de cel immobilisatie op substraten voor deze methode wordt vereist, kunnen de opschortings cellen niet direct worden geanalyseerdgebruikend deze techniek53. Daarom kan de single-probe SCMS systeem niet direct worden gebruikt om niet-klevende enkele cellen, zoals niet-klevende cel lijnen of schorsing cellen geïsoleerd van het bloed van een patiënt of andere lichaamsvloeistoffen54te proeven. In dit werk, een geïntegreerde Cell manipulatie platform (ICMP) is gekoppeld aan de single-probe SCMS techniek om live te analyseren, schorsing cellen on-line met minimale monstervoorbereiding (Figuur 1)46. De ICMP bestaat uit een omgekeerde Microscoop om cel selectie, een glas cel-selectie sonde, een microinjector om individuele zwevende cellen vast te leggen, een verwarmde plaat te handhaven cellulaire temperatuur, twee cellen manipulatiesystemen te controleren ruimtelijke bewegingen van zowel de glas cel-selectie sonde en single-Probe, en een digitale microscoop om cel overdracht van de cel-selectie sonde Tip observeren om de single-probe tip. De fabricage van de single-probe is gedetailleerd in eerdere publicaties en zal niet worden aangepakt hier21,48. Het ICMP/single-probe systeem wordt gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometer. Deze geïntegreerde opstelling zorgt voor de bemonstering van geïdentificeerde enkelvoudige cellen van complexe biologische monsters met minimale effecten van matrix moleculen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

Single cell massaspectrometrie (SCMS) maakt gevoelige detectie en nauwkeurige analyse van de brede waaiers van cellulaire soorten op de individuele-cel niveau. De single-Probe, een Microscale bemonstering en ionisatie-apparaat, kan worden gekoppeld aan een massaspectrometer voor on-line, snelle SCMS analyse van cellulaire bestanddelen onder omgevingsomstandigheden. Voorheen werd de single-probe SCMS techniek voornamelijk gebruikt voor het meten van cellen immobiled op een substraat, het beperken van de soorten cellen voor studies. In de huidige studie, de single-probe SCMS technologie is geïntegreerd met een cel manipulatie systeem, meestal gebruikt voor in vitro fertilisatie. Deze geïntegreerde cel manipulatie en analyse platform maakt gebruik van een cel-selectie sonde vast te leggen geïdentificeerde individuele zwevende cellen en de overdracht van de cellen naar de single-probe tip voor Microscale lysis, gevolgd door onmiddellijke massaspectrometrie analyse. Deze Capture and transferproces verwijdert de cellen uit de omliggende oplossing voorafgaand aan de analyse, het minimaliseren van de invoering van matrix moleculen in de massaspectrometrie analyse. Deze geïntegreerde opstelling is in staat om SCMS analyse van gerichte patiënt-geïsoleerde cellen aanwezig in lichaamsvloeistoffen monsters (bijvoorbeeld urine, bloed, speeksel, enz.), waardoor potentiële toepassingen van SCMS analyse aan de menselijke geneeskunde en de ziekte biologie.

Eerste, onbehandelde K562 cellen worden gebruikt om de experimentele methode vast te stellen. In een typisch SCMS experiment, kunnen de duidelijke veranderingen van massaspectra worden waargenomen van het overbrengen van een cel, tijdens de opsporing van cellulaire inhoud, en na het afronden van de meting (figuur S1). Drie gemeenschappelijke cellulaire lipiden pieken (fosfatidylcholine, PC), met inbegrip van PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), en PC (38:5) (m/z 808,583), worden gecontroleerd om de cel te verzekeren met succes wordt overgebracht en cellulair de inhoud wordt gedetecteerd (figuur S2)21,43,46,55,56. Als de lipiden pieken niet binnen 5 s worden gezien, wordt het minerale olieniveau in de microinjector veranderd om de zuiging te verminderen die de cel bij de cel-selectie sonde uiteinde houdt; voorzichtigheid moet worden genomen, zodat er geen minerale olie wordt geduwd uit de cel-selectie sonde. De identiteit van veel PC'S in de massa range van m/z 750-850 worden bevestigd met behulp van MS/MS op onbehandelde cel lysate monsters (Figuur 3, figuur S2, tabel 1)46.
K562 cellen zijn ook onderworpen aan behandeling met verschillende geneesmiddelen om de veelzijdigheid van de methode uit te breiden. K562 cellen worden uitgebroed met Gemcitabine (1 µ M) en taxol (1 µ M) voor 1 h en OSW-1 (100 nM, 1 µ M) voor 4 h en 2 h, respectievelijk. De cellen worden dan gewassen met PBS om de opsporing van drug samenstellingen van extracellulaire inhoud te minimaliseren. De bijdrage van matrijs (b.v., ionen van het middel van de cel cultuur, PBS, en oplosmiddel) aan massaspectra van cellulaire inhoud kan door gegevens aftrekking, wegens hun beduidend verschillende ionen signalen worden geëlimineerd (figuur S3). Alle drie de drugs verbindingen worden gedetecteerd met behulp van de ICMP/single-probe MS Setup (figuur S4)46. Deze resultaten suggereren deze methode kan worden gebruikt om intracellulaire lipiden, drugs en metabolieten studie op de single-cell niveau van cellen in oplossing in een bijna-native omgeving.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> Figuur 1. Experimentele Setup voor enkele schorsing cel MS experimenten. (A) het geïntegreerde platform voor de manipulatie van cellen (ICMP) in combinatie met een massaspectrometer. Bschematische analyse van zwevende cellen. (C) experimentele weergave van K562 cellen die moeten worden geselecteerd met behulp van de cel-selectie sonde. Herdrukt met toestemming van Standke et al.46. Auteursrecht 2019 de Amerikaanse chemische maatschappij. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> Figuur 2. Foto's van een aangepaste single-probe en een cel-selectie sonde gebruikt voor enkele schorsing cel MS experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> Figuur 3. Ingezoomd massaspectrum van een enkele cel met de representatieve soort (m/z 750-850). Chemische structuren worden bevestigd met behulp van MS/MS analyse (figuur S1). Herdrukt met toestemming van Standke et al.46. Auteursrecht 2019 de Amerikaanse chemische maatschappij. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Drug molecule*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Massa fout (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabine + H] +
</td>
			<td>264,076</td>
			<td>11,32</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol + na] +
</td>
			<td>876,318</td>
			<td>2,74</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 + na] +
</td>
			<td>895,445</td>
			<td>0,89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellulaire lipiden</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:4) + H] +
</td>
			<td>754,535</td>
			<td>3,71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:3) + H] +
</td>
			<td>756,551</td>
			<td>3,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:2) + H] +
</td>
			<td>758,569</td>
			<td>0,66</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:5) + H] +
</td>
			<td>780,551</td>
			<td>3,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:4) + H] +
</td>
			<td>782,568</td>
			<td>2,17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:3) + H] +
</td>
			<td>784,585</td>
			<td>0,64</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:7) + H] +
</td>
			<td>804,551</td>
			<td>4,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:6) + H] +
</td>
			<td>806,567</td>
			<td>2,48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:5) + H] +
</td>
			<td>808,583</td>
			<td>2,72</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:4) + H] +
</td>
			<td>810,601</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (40:7) + H] +
</td>
			<td>832,583</td>
			<td>3,12</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Geïdentificeerde cellulaire componenten met behulp van de ICMP/single-probe Setup. De opsporing van alle drugs verbindingen werd bevestigd door de resultaten van MS/MS met standaardsamenstelling te vergelijken.

Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Een geïntegreerde cel manipulatie platform is ontwikkeld voor gebruik in combinatie met een single-probe massaspectrometrie Setup voor de on-line analyse van individuele schorsing cellen onder omgevingsomstandigheden.

Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Aangezien deze methode cellen van oplossing analyseert, kan het worden gebruikt om cellen in een dichtbijgelegen inheemse omgeving te bestuderen. Dit omvat de analyse van door de patiënt afgeleide celmonsters. Deze techniek vereist weinig tot geen monstervoorbereiding van cellen.Daarom kunnen we individuele cellen online analyseren onder omgevingsomstandigheden, waardoor we cellulaire heterogeniteit kunnen verkennen. Deze techniek kan worden toegepast om vloeibare biopten uit verschillende ziektetoestanden te bestuderen, omdat het verschillende soorten cellen kan analyseren die rechtstreeks zijn geïsoleerd uit patiëntmonsters. Om enkele boring glazen buizen om te zetten in een taps toelopende sonde met een scherpe punt, plaats eerst een enkele boring glazen buis in de klemmen van een verticale pipet houder, centreren van het glas met betrekking tot de verwarmingsspoel en draai aan om de buis vast te zetten op zijn plaats.De verwarmingsspoel bestaat uit een 18-meters nikkel chroomweerstanddraad die 2,5 keer rond een metalen staaf is opgerold. Stel de glazen buizen met temperatuurprogramma 19,5 in. Zet de solenoïde zuiger op vier.Activeer de solenoïde om de glazen buizen te trekken. Deze stap maakt twee sondes gesmolten aan de punt. Gebruik truien om ongeveer een millimeter van het puntje van elke sonde te snijden, waardoor een opening van ongeveer 10 micron in diameter ontstaat bij de sondepunt.Om de glazen sonde te buigen voor een eenvoudige koppeling aan de ICMP, stelt enkele sonde SCMS zich op. Stel eerst een getrokken glassonde in de microforge. Plaats de top ongeveer drie millimeter boven de platina verwarmingsdraad.Zet vervolgens het vuur op de platinadraad op 30% van de maximale temperatuur. Buig de sonde ongeveer 45 graden van de oorspronkelijke positie. Plaats de geverteerde microinjector in twee celmanipulatiesystemen op een gemotoriseerde tafel voor eenvoudige koppeling met de massaspectrometer.Als u het apparaat voor de selectie van de glazen cel wilt instellen, plaatst u de sonde voor de selectie van de glazen cel in de metalen houder van de microinjector door de lange schuif in de capillaire houder te plaatsen en de schroef aan te draaien om de sonde op zijn plaats te krijgen. Plaats de sondetips schuin parallel aan de verwarmde plaat. Beveilig de metalen houder van de micro-injector in het celmanipulatiesysteem.Plaats vervolgens de sonde tip in de buurt van het midden van de omgekeerde microscoop licht. Zet de glazen schuif met de enkele sonde in de armklem van het celmanipulatiesysteem. Sluit het oplosmiddel dat capillair aan een geleidende unie verstrekt door het capillair in de koker van de plastic ferrule te plaatsen en de vinger aan te draaien.Sluit de andere kant van de geleidende unie aan op een capillair dat is aangesloten op een spuit die het bemonsteringsmiddel bevat door de capillaire in de mouw te plaatsen en de fitting aan te spannen. Gebruik acetonitril met 0,1%mierenzuur als bemonsteringsoplosmiddel in deze experimenten. Zet de spuit vast in de spuitpomp op de massaspectrometer.Plaats de nanoelectrospray ionisatie of nano ESI zender ongeveer een millimeter aan de opening van de uitgebreide ionen transfer buis. Gebruik het celmanipulatiesysteem om de ruimtelijke bewegingen van de enkele sonde te regelen en de nano ESI-zender centraal voor de uitgebreide ionenoverdrachtsbuizen te plaatsen. Pipette de cellen van de celcultuurkolf in een 15 milliliter centrifugebuis.Draai de cellen op 400 keer G in 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Resuspend de cellen in vier milliliter RPMI medium met de drug verbinding bij de gewenste behandeling concentratie. Pas de experimentele parameters voor de massaspectrometer aan.Selecteer onder de kop scanmodus van de instrumentsoftware de optie Scan definiëren. Gebruik een resolutie van 60.000 bij M over Z 400, één microscan maximale injectietijd van 100 milliseconden en automatische versterkingscontrole. Selecteer onder spuitpomp de stroomsnelheid van 150 nanoliters per minuut.Selecteer NSI-bron en breng een spanning van ongeveer 4,5 kilovolt aan. Zet de omgekeerde microscoop op 40 keer vergroting geselecteerd voor zowel de bovenste plaat en onderste lens. Sluit deze aan op de USB-poort van een laptop om live videofeeds vast te leggen.Zet de verwarmde plaat aan en zet deze in op 37 graden Celsius. Ga op de computer naar het tabblad gegevens verwerven en selecteer continu onder verkregen tijd. Om het monster voor te bereiden op analyse, pipet twee tot drie van het monster in het deksel van een kleine petrischaal.Plaats het monster in het midden van het licht van de omgekeerde microscoop bovenop de verwarmde plaat. Bereid de sonde voor de selectie van de glascel voor op analyse. Gebruik het celmanipulatiesysteem om de sonde te verplaatsen, zodat de bovenkant onder het omgekeerde microcsope in hetzelfde vlak als de cellen is gericht.Gebruik het celmanipulatiesysteem om de testpunt voor celselectie naar een gerichte cel te verplaatsen voor analyse. Dit proces wordt gecontroleerd met behulp van de omgekeerde microscoop. Draai voorzichtig het handvat van de microinjector om de positie van de minerale olie in de slang aan te passen.Een zachte zuigkracht wordt geleverd door de microinjector om de beoogde cel te beveiligen om de cel selectie sonde tip. Gebruik het celmanipulatiesysteem om de cel op de celselectiesondepunt naar de enkele sondetip te verplaatsen met behulp van een digitale microscoop die is gericht op de enkele sondetip om dit proces te controleren. Onbehandelde K-562-cellen worden gebruikt om de experimentele methode vast te stellen.In een typisch SCMS-experiment kunnen duidelijke veranderingen van massaspectra worden waargenomen van het overbrengen van een cel tijdens de detectie van cellulaire inhoud en na het beëindigen van de meting. Drie veelvoorkomende cellulaire lipidepieken, waaronder PC 34:4, PC 36:4 en PC 38:5, worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de cel met succes wordt overgedragen en mobiele inhoud wordt gedetecteerd. De identiteit van veel pc's in het massabereik van 750 tot 850 wordt bevestigd met MSMS op onbehandelde celmonsters.Met behulp van de ICMP single probe MS set-up werden Gemcitabine, Taxol en OSW1 gedetecteerd na incubatie met K-562 cellen. Deze resultaten suggereren deze methode kan worden gebruikt om intracellulaire lipiden, drugs en metabolieten te bestuderen op het niveau van de eencellige cellen van cellen in oplossing in een bijna inheemse omgeving. Vergeet niet om de glascelselectiesonde veilig in de universele pipethouder te plaatsen, zodat de zuigkracht adequaat kan worden toegepast.Deze methode kan ook worden toegepast op patiënt afgeleide monsters om verschillen tussen cellulaire metabolieten te onderscheiden van een verscheidenheid van celtypen, die ons in staat stelt om een beter begrip van deze ziektetoestanden te krijgen. Na het ontwikkelen van deze methode, kunnen we mogelijk de kwantificering van geneesmiddelenverbindingen op het niveau van eencellige implementeren. Bij het werken met cellen is het belangrijk om over passende persoonlijke beschermingsmiddelen te beschikken, waaronder een labjas en handschoenen.Extra oogslijtage kan worden gebruikt bij het werken met glas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisatie van Ambient Massaspectrometrie met het gebruik van Schlieren fotografie

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Real-time adem analyse met behulp van secundaire Nanoelectrospray ionisatie gekoppeld aan massaspectrometrie voor hoge resolutie

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...