Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
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Die Autoren danken Naga Rama Kothapalli für ihre Arbeit bei der Entwicklung von Probenvorbereitungen sowohl für Suspensionszellen als auch für Zelllysatexperimente. Darüber hinaus danken die Autoren dem NIH (R01GM116116 und R21CA204706) für die Finanzierung.

1. Glaszellen-Auswahlsonde Herstellung
<ol><li>Verwandeln Sie Einbohrglasschläuche in eine verjüngte Sonde mit scharfer Spitze.<ol>
<li>Legen Sie ein Einbohrglasrohr (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) in die Klemmen eines vertikalen Pipettenhalters, zentrieren Sie das Glas in Bezug auf die Heizspule und ziehen Sie es fest, um das Rohr an Ort und Stelle zu befestigen. Die Heizspule besteht aus einem 18-Spur-Nickel-Chrom-Widerstandsdraht (ca. 60 mm Länge), der 2,5-mal um einen Metallstab (Durchmesser = 3,90 mm) gewickelt ist.</li>
		<li>Stellen Sie die Glasschläuche mit Temperaturprogramm 19.5 (Herstellereinheit) ein. Dieser Parameter kann für ein bestimmtes Instrument geändert werden.</li>
		<li>Stellen Sie den Magnetkolben auf 4 (Herstellereinheit) ein. Dieser Parameter kann für ein bestimmtes Instrument geändert werden.</li>
		<li>Lösen Sie den Magneten aus, um den Glasschlauch zu ziehen. In diesem Schritt werden zwei Sonden erstellt, die an der Spitze verschmolzen sind.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um 1 mm von der Spitze jeder Sonde zu schneiden, wodurch an der Sondenspitze eine Öffnung von 10 m Durchmesser entsteht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biegen Sie die Glassonde für eine einfache Kopplung an das ICMP/Single-Sonden-SCMS-Setup.<ol>
<li>Stellen Sie eine gezogene Glassonde in die Mikroschmiede ein und positionieren Sie die Spitze 3 mm über dem Platin-Heizdraht.</li>
		<li>Drehen Sie die Wärme auf dem Platindraht auf 30% der maximalen Temperatur.</li>
		<li>Biegen Sie die Sonde um 45° von der ursprünglichen Position ab (Abbildung 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Integrierte Zellmanipulationsplattform-Baugruppe
<ol><li>Legen Sie das invertierte Mikroskop, den Mikroinjektor und zwei Zellmanipulationssysteme auf einen motorisierten Tisch, um sie einfach mit dem Massenspektrometer zu koppeln.<ol>
<li>Ändern Sie eines der Zellmanipulationssysteme, um eine Einzelsonde aufzunehmen, indem Sie das Ende durch eine Armklemme ersetzen.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Plastikspritze mit einer Nadel, um den Mikroinjektor mit Mineralöl zu füllen. Vermeiden Sie Blasen in den Schläuchen, da dies das Absaugen beeinträchtigt.</li>
		<li>Ersetzen Sie den Bühneneinsatz des invertierten Mikroskops durch die beheizte Platte. Stellen Sie die beheizte Platte vor der Analyse auf 37 °C ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie das Glaszellenauswahlgerät ein.<ol>
<li>Setzen Sie die Glaszellen-Auswahlsonde in den Metallhalter des Mikroinjektors ein, indem Sie die lange (nicht gebogene) Seite in den Kapillarhalter legen und die Schraube anziehen, um die Sonde an Ort und Stelle zu befestigen. Positionieren Sie den Winkel der Sondenspitze parallel zur beheizten Platte. VORSICHT: Die Glassonde ist sehr scharf und zerbrechlich und bricht leicht. Schützen Sie Ihre Augen und seien Sie besonders vorsichtig, während Sie die Sonde in den Mikroinjektor einsetzen.</li>
		<li>Sichern Sie den Metallhalter des Mikroinjektors in das Zellmanipulationssystem. Positionieren Sie die Sondenspitze in der Mitte des invertierten Mikroskoplichts.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Erstellen Sie ein verlängertes Ionentransferrohr für den Massenspektrometer-Einlass
<ol><li>Verwenden Sie einen Metallschneider, um ein Stück Edelstahlrohre (OD: 0,0625 (1/16) in, ID: 0,021 in) mit einer Länge von 250 mm zu schneiden.</li>
	<li>Messen Sie 135 mm vom Ende und legen Sie ein Metall verwildert so 135 mm wird der Atmosphäre ausgesetzt werden und 115 mm innerhalb des Massenspektrometers sein. Sichern Sie das Wild mit zwei Schraubenschlüsseln, um es festzuziehen.</li>
</ol>4. Koppeln Sie den ICMP mit einem Single-Sonden-Setup
<ol><li>Befestigen Sie den Glasschlitten mit der Einzelsonde in der Armklemme des Zellmanipulationssystems. ANMERKUNG: Einzelsonden werden nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll48 mit zwei geringfügigen Änderungen in der aktuellen Studie hergestellt: Der Nano-ESI-Emitter wird für die einfache Kopplung an das Massenspektrometer länger hergestellt, und die Einzelsonden werden an das Glas geklebt Seite auf der rechten Seite, um die räumliche Bewegung der Glaszellenauswahlvorrichtung nicht zu stören (Abbildung 2).</li>
	<li>Verbinden Sie die lösungsmittelliefernde Kapillare mit einer leitfähigen Verbindung, indem Sie die Kapillare in die Hülse (1/16 x .005 in) der Kunststoffferrule legen und die Armatur mit dem Finger anziehen.<ol>
<li>Schließen Sie die andere Seite der leitfähigen Verbindung an eine Kapillare an (ID: 40 m, OD: 150 m), die mit einer Spritze verbunden ist, die das Probenahmelösungsmittel enthält, indem Sie die Kapillare in die Hülse (1/32 x 007 Zoll) legen und die Armatur anziehen. Verwenden Sie Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure als Probenahmelösungsmittel in diesen Experimenten. HINWEIS: Das Probenahmelösungsmittel ist flexibel, sollte aber in erster Linie Acetonitril (oder Acetonitril mit Ameisensäure für eine bessere Ionisation) für eine schnelle Mikrozelllyse enthalten.</li>
		<li>Befestigen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe auf dem Massenspektrometer.</li>
		<li>Legen Sie das Ionisationsspannungskabel auf einen Kupferdraht, der an der leitfähigen Vereinigung befestigt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Positionieren Sie den Nano-ESI-Emitter 1 mm an der Öffnung des verlängerten Ionenübertragungsrohrs.<ol>
<li>Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die räumlichen Bewegungen der Single-Sonde zu steuern und den Nano-ESI-Emitter zentral vor den erweiterten Ionentransferschläuchen zu positionieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Ausgesetzte Zellprobenvorbereitung
<ol><li>Am Tag vor der Analyse (18-24 h) werden Zellen zum Testen in einem Zellkulturkolben (T25) ausgesät. K562 humane myeloische Leukämiezellen werden als Modelle in dieser Studie verwendet.<ol>
<li>1x Phosphat gepufferte Saline (PBS) und Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% synthetischem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C für 30 min.</li>
		<li>Samen 1 x 106 Zellen in einem Gesamtvolumen von 10 ml durch Kombination von Zellen mit warmem Medium. Verwenden Sie im Allgemeinen eine 10-ml-Pipette, um 8 ml RPMI-Medium in einen Zellkulturkolben zu legen. Verwenden Sie dann eine 2 ml Pipette, um 2 ml konfluente K562-Zellen das Medium für 1 x 106 Zellen zu setzen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 bis zur Analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Zellen für die Analyse vor.<ol>
<li>Pipettenzellen aus der Zellkultur in ein 15-ml-Zentrifugenrohr.</li>
		<li>Spin Zellen bei 400 x g und 37 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspend Zellen in 4 ml RPMI-Medium, das die Wirkstoffverbindung in der gewünschten Behandlungskonzentration enthält. ANMERKUNG: Zur Analyse von Kontrollzellen setzen Sie die Zellen in 4 ml RPMI-Medium wieder aus und fahren Sie mit Schritt 6fort.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für die Dauer der Behandlungszeitbei 37 °C und 5% CO2 .</li>
		<li>Spin Zellen nach unten bei 400 x g und 37 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Die Zellen werden in 10 ml PBS und Zentrifuge bei 400 x g und 37 °C für 5 min resuspendiert. Nach dem Spinnen, entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal, um den Nachweis von Medikamenten aus extrazellulären Bestandteilen zu minimieren.</li>
		<li>Resuspend Zellen in 4 ml PBS für die Analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Führen Sie SCMS-Messungen mit dem ICMP/Single-Sonden-Setup durch
<ol><li>Passen Sie die Parameter für das Massenspektrometer für das Experiment an.<ol>
<li>Wählen Sie unter der Überschrift Scanmodus der Instrumentensoftware scandefinieren aus. Verwenden Sie eine Auflösung von 60.000 m/m bei m/z 400, 1 Mikroscan, 100 ms maximale Einspritzzeit und automatische Verstärkungskontrolle (AGC) auf. Für die Experimente wurde ein Massenbereich (m/z) von 100-1000 genutzt. Parameter können basierend auf dem Instrumentenmodell geändert werden.</li>
		<li>Wählen Sie unter Spritzenpumpeeine Durchflussrate von 150 nL/min aus. Die Durchflussrate muss für jedes Experiment optimiert werden.</li>
		<li>Wählen Sie NSI-Quelle und wenden Sie eine Spannung von 4,5 kV an. Dieser Parameter muss auch für jedes Experiment optimiert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schalten Sie das invertierte Mikroskop ein (mit 40-facher Vergrößerung, die sowohl für die obere Platte als auch für die untere Linse ausgewählt ist) und schließen Sie es an den USB-Anschluss eines Laptops an, um Live-Video-Feeds aufzunehmen. Schalten Sie die beheizte Platte ein und stellen Sie sie auf 37 °C ein.</li>
	<li>Wechseln Sie auf dem Computer zur Registerkarte Daten erfassen, und wählen Sie Kontinuierlich unter Zeit erfassen aus.</li>
	<li>Bereiten Sie das Beispiel für die Analyse vor.<ol>
<li>Pipette 2-3 ml Probe in den Deckel einer kleinen Petrischale (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 Positionieren Sie die Probe in der Mitte des Lichts vom invertierten Mikroskop auf der Oberseite der beheizten Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Glaszellenauswahlsonde für die Analyse vor. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Sonde so zu bewegen, dass ihre Spitze unter dem invertierten Mikroskop in der gleichen Ebene wie die Zellen fokussiert ist.</li>
	<li>Wählen Sie eine einzelne Zelle für die Analyse aus.<ol>
<li>Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zellesauswahl-Sondenspitze in eine Zielzelle zu verschieben. Dieser Prozess wird mit dem invertierten Mikroskop überwacht. HINWEIS: Wenn die Spitze der Zellauswahlsonde nicht in derselben Ebene wie die Zellen fokussiert werden kann, ist es möglich, dass der gebogene Teil der Sonde nicht entsprechend abgewinkelt ist. Passen Sie die Position der Zellselektionssonde an, bis beide Sondenspitzen zusammen mit Zellen unter dem Mikroskop fokussiert werden können.</li>
		<li>Drehen Sie den Griff des Mikroinjektors vorsichtig, um die Position des Mineralöls im Inneren des Schlauches anzupassen. Der Mikroinjektor sorgt für eine schonende Absaugung, um die Zielzelle an der Zellauswahls-Sondenspitze zu sichern. HINWEIS: Wenn die Zelle nicht von der Zellauswahlsonde durch die Saugkraft erfasst werden kann, überprüfen Sie die Zellauswahlsonde, um sicherzustellen, dass sie vollständig in den Kapillarhalter eingeführt wird. Prüfen Sie außerdem die Mineralölgehalte im Mikroinjektor und in den Schläuchen, und vertreiben Sie Luft, falls vorhanden.</li>
		<li>Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zelle an der Zellauswahl-Sondenspitze zur Single-Sondenspitze zu bewegen, indem Sie ein digitales Mikroskop verwenden, das sich auf die Einsondenspitze konzentriert, um diesen Prozess zu überwachen. Beim Berühren induziert ein kleines Acetonitril-Tröpfchen an der Single-Sonden-Spitze eine schnelle Lyse der Zelle, und dann wird das Zelllysat sofort für die Online-MS-Analyse ionisiert. HINWEIS: Da die ausgewählte Zelle durch eine sanfte Absaugung an der Zellauswahl-Sondenspitze befestigt ist, kann sie während ihrer Übertragung an die Single-Sondenspitze möglicherweise abgetrennt werden. Wenn daher Ionensignale typischer zellulärer Lipide (siehe repräsentative Ergebnisse unten) nicht innerhalb von 5 s beobachtet werden, ist es möglich, dass die Zelle ungebunden wurde und die Auswahl einer anderen Zelle erforderlich ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die integrierte Zellmanipulations- und Analyseplattform wurde entwickelt, um die Vielseitigkeit der Single-Probe-MS-Methode zu erweitern und eine onlineschnelle Analyse nicht-anhaftender Zellen in einer nahezu nativen Umgebung zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Technik ist, dass eine minimale Probenvorbereitung erforderlich ist, so dass die Zellen unter Bedingungen analysiert werden, die ihren Standardzustand imitieren. Insbesondere können einzelne von Interesse belangliche Zellen visuell identifiziert und ausgewählt werden, wodurch der Einfluss des Matrixeffekts auf die Effizienz der MS-Ionisation minimiert wird, während die Zellen in ihrer natürlichen Umgebung erhalten bleiben, so dass die Ergebnisse repräsentativer eativ sind. Status (Abbildung S3). Diese Technik kann potenziell verwendet werden, um Patientenzellen zu untersuchen, die in Biofluiden in zukünftigen Studien suspendiert sind. Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist die flexible Auswahl des Probenahmelösungsmittels. Es ist wichtig, Acetonitril als Hauptprobelösel einzubeziehen, damit eine mikroskalige Lyse schnell auftreten kann. Potenziell können interne Standards (z. B. isotopisch markierte Wirkstoffverbindungen) in das Probenahmelösungsmittel zur Quantifizierung von Molekülen von Interesse (z. B. Wirkstoffmoleküle) aus einzelnen Zellen aufgenommen werden, einschließlich dieser, die eine Schlüsselrolle bei der Revolutionierung spielen können. Personalisierung von Arzneimittelbehandlungen in der Zukunft54.
Obwohl dieses integrierte System bequem verwendet werden kann, um große Zellbereiche zu analysieren, ist eine Einschränkung der Methode, dass weder die Einzelsonde noch die Zellauswahlsonde kommerziell verfügbar ist; die Notwendigkeit der Optimierung vieler Parameter (z. B. Durchfluss, Spannung, Länge zwischen Nano-ESI-Emitter und Ionenübertragungsschläuchen usw.) vor jedem Experiment. Darüber hinaus kann die Umgebungsstörung (z. B. Luftstrom) aufgrund der Geringen der Einsonden- und Zellselektionssonde zu Schwierigkeiten bei der Herstellung einer Verbindung zwischen den beiden Sonden führen. Eine kurzfristige Lösung ist die Biegung der Zellauswahlsonde in der Nähe des Endes, um die Länge der Verjüngung zu minimieren. Zukünftige Arbeiten umfassen die Entwicklung eines Gehäuses, um die kritischen Teile des Setups einzuschließen, um Umweltauswirkungen zu minimieren. Aufgrund der begrenzten Menge an Zellinhalten und der kurzen Erfassungszeit (ca. 2-3 s) aus einer Zelle kann die MS/MS-Analyse nur für relativ reichlich eitel Arten durchgeführt werden. Andere Faktoren, die die Erkennungsempfindlichkeit beeinflussen, sind die unterdrückte Ionisationseffizienz durch die Einführung der Matrix zusammen mit der Zelle und potenziellen Ionenverlust durch die verlängerten Ionentransferschläuche.

Die Humanbiologie, insbesondere die Krankheitsbiologie, wird zunehmend als das Ergebnis von Aktivitäten auf der Ebene einzelner Zellen verstanden, aber die traditionellen Analysemethoden, wie die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LCMS), werden in der Regel zur Analyse von Proben, die aus Zellpopulationen hergestellt werden, während die erfassten molekularen Informationen die chemischen Prozesse auf der Ebene der einzelnen Zellen nicht genau darstellen können. Diese Standard-, traditionellen Methoden sind nicht in der Lage, die Auswirkungen der zellulären Heterogenität auf eine analytische Messung zu erkennen, und der Prozess der Zerstörung und Mischen der Zellen, um das Lysat vorzubereiten, führt potenziell zur Veränderung oder zum Verlust von zellulären Komponenten1,2. Diese Einschränkungen traditioneller Methoden sind besonders wichtig bei der Analyse von Patientenzellen, bei denen die erhaltenen Proben eine komplexe Mischung aus vielen verschiedenen Zelltypen enthalten können. Um diese Mängel zu beheben, werden einzellige molekulare Analysemethoden, einschließlich Einzelzell-Massenspektrometrie-Methoden (SCMS), zunehmend entwickelt und auf die Bioanalyse angewendet, insbesondere von zellulären Metaboliten und niedermolekularen Biomoleküle3,4.
Die ersten sCMS-Techniken, die entwickelt wurden, verwendeten vakuumbasierte Techniken, um die Analysen unter nicht-Umgebungsbedingungen durchzuführen2,5,6,7,8,9, 10,11. Nicht-Umgebungs-SCMS-Techniken sind in der Lage, zelluläre Lipide und Metaboliten zu analysieren, erfordern jedoch eine Probenvorbehandlung unter künstlichen Bedingungen und sind daher nicht für die Echtzeitanalyse geeignet. Der Probenvorbereitungsprozess für die Nicht-Umgebungsanalyse umfasst die Zugabe von Matrixkomponenten, und diese Zubereitung kann zelluläre Komponenten aus ihrer natürlichen Umgebung verändern12. Daher werden MS-Techniken (Ambient Mass Spectrometry), die für die Samplingumgebung kein Vakuum erfordern, zur Analyse von Zellen in einer nahezu nativen Umgebung verwendet. Das Nicht-Vakuum-Umfeld ermöglicht die Vielseitigkeit im experimentellen Design; Kameras können hinzugefügt werden, um den zellulären Prozess zu überwachen und weichere Ionisationstechniken können mit Trenntechniken kombiniert werden, um bessere Informationen aus jedem Einzelzellexperimentzuerhalten 4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
Die Single-Probe-SCMS-Methode ist eine Umgebungstechnik, die lebende, Säugetierkrebszelllinien in einer nahezu nativen Umgebung analysiert21,43,44,45,46. Darüber hinaus wurde das Einsondengerät für andere Massenspektrometrieanwendungen eingesetzt, einschließlich der Analyse extrazellulärer Moleküle in mehrzelligen Sphäroiden und ms-Bildgebung von Geweben47,48,49 ,50,51,52. Da jedoch eine Zellimmobilisierung auf Substraten für diese Methode erforderlich ist, können Suspensionszellen mit dieser Technik nicht direkt analysiert werden3,53. Daher konnte das Single-Sonden-SCMS-System nicht direkt zur Probe von nicht haftenden Einzelzellen verwendet werden, wie z. B. nicht haftenden Zelllinien oder Suspensionszellen, die aus dem Blut eines Patienten oder anderen Körperflüssigkeiten isoliert sind54. In dieser Arbeit wird eine integrierte Zellmanipulationsplattform (ICMP) mit der Single-Probe-SCMS-Technik zur Online-Analyse von lebenden Suspensionszellen mit minimaler Probenvorbereitung gekoppelt (Abbildung 1)46. Das ICMP besteht aus einem invertierten Mikroskop zur Überwachung der Zellauswahl, einer Glaszellen-Selektionssonde, einem Mikroinjektor zur Erfassung einzelner schwimmender Zellen, einer beheizten Platte zur Aufrechterhaltung der Zelltemperatur, zwei Zellmanipulationssystemen zur Steuerung räumlicher Bewegungen sowohl der Glaszellen-Selektionssonde als auch der Einzelsonde sowie eines digitalen Mikroskops zur Beobachtung der Zellübertragung von der Zellauswahl-Sondenspitze zur Single-Sondenspitze. Die Herstellung der Single-Probe ist in früheren Veröffentlichungen detailliert und wird hier nicht behandelt21,48. Das ICMP/Single-Sonden-System ist an ein hochauflösendes Massenspektrometer gekoppelt. Dieses integrierte Setup ermöglicht die Probenahme identifizierter Einzelzellen aus komplexen biologischen Proben mit minimalen Effekten von Matrixmolekülen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

Die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) ermöglicht eine sensible Detektion und genaue Analyse großer Bereiche zellulärer Arten auf der Ebene der einzelnen Zellen. Die Single-Sonde, eine Mikroskalen-Probenahme- und Ionisationsvorrichtung, kann mit einem Massenspektrometer für die online-schnelle SCMS-Analyse von zellulären Bestandteilen unter Umgebungsbedingungen gekoppelt werden. Zuvor wurde die Single-Sonden-SCMS-Technik hauptsächlich verwendet, um Zellen zu messen, die auf einem Substrat immobilisiert wurden, wodurch die Zelltypen für Studien eingeschränkt wurden. In der aktuellen Studie wurde die Single-Sonden-SCMS-Technologie in ein Zellmanipulationssystem integriert, das typischerweise für die In-vitro-Fertilisation verwendet wird. Diese integrierte Zellmanipulations- und Analyseplattform nutzt eine Zellauswahlsonde, um identifizierte einzelne schwimmende Zellen zu erfassen und die Zellen zur Mikroskalenlyse an die Single-Sondenspitze zu übertragen, gefolgt von einer sofortigen Massenspektrometrieanalyse. Dieser Erfassungs- und Übertragungsprozess entfernt die Zellen vor der Analyse aus der umgebenden Lösung, wodurch die Einführung von Matrixmolekülen in die Massenspektrometrieanalyse minimiert wird. Dieses integrierte Setup ist in der Lage, gezielte patientenisolierte Zellen in Körperflüssigkeitsproben (z. B. Urin, Blut, Speichel usw.) zu analysieren und mögliche Anwendungen der SCMS-Analyse in der Humanmedizin und Krankheitsbiologie zu ermöglichen.

Zunächst werden unbehandelte K562-Zellen verwendet, um die experimentelle Methode zu etablieren. In einem typischen SCMS-Experiment können offensichtliche Veränderungen von Massenspektren beobachtet werden, wenn eine Zelle übertragen wird, während der Detektion von Zellinhalten und nach Abschluss der Messung (Abbildung S1). Drei häufige zelluläre Lipidspitzen (Phosphatidylcholin, PC), einschließlich PC(34:4) (m/z 754.536), PC(36:4) (m/z 782.567) und PC(38:5) (m/z 808.583), werden überwacht, um sicherzustellen, dass die Zelle erfolgreich übertragen und zellular Inhalt erkannt werden (Abbildung S2)21,43,46,55,56. Wenn Lipidspitzen nicht innerhalb von 5 s zu sehen sind, wird der Mineralölgehalt im Mikroinjektor verändert, um die Absaugung der Zelle an der Zellselektionssonde zu reduzieren; Es ist Vorsicht geboten, damit kein Mineralöl aus der Zellselektionssonde herausgeschoben wird. Die Identität vieler PCs im Massenbereich von m/z 750-850 wird mit MS/MS an unbehandelten Zelllysatproben bestätigt (Abbildung 3, Abbildung S2, Tabelle 1)46.
K562-Zellen werden auch mit verschiedenen Wirkstoffverbindungen behandelt, um die Vielseitigkeit der Methode zu erweitern. K562-Zellen werden mit Gemcitabin (1 m) und Taxol (1 m) für 1 h und OSW-1 (100 nM, 1 m) für 4 h bzw. 2 h inkubiert. Die Zellen werden dann mit PBS gewaschen, um den Nachweis von Wirkstoffverbindungen aus extrazellulärem Gehalt zu minimieren. Der Beitrag von Matrix (z.B. Ionen aus Zellkulturmedium, PBS und Lösungsmittel) zu Massenspektren zellulärer Inhalte kann durch Datensubtraktion aufgrund ihrer deutlich unterschiedlichen Ionensignale eliminiert werden (Abbildung S3). Alle drei Wirkstoffverbindungen werden mit dem ICMP/Single-Probe MS-Setup nachgewiesen (Abbildung S4)46. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode verwendet werden kann, um intrazelluläre Lipide, Medikamente, und Metaboliten auf der Einzelzellebene von Zellen in Lösung in einer nah-nativen Umgebung zu studieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> Abbildung 1. Experimentelles Setup für MS-Experimente mit einzelsuspensionszelle. (A) Die integrierte Zellmanipulationsplattform (ICMP) gekoppelt mit einem Massenspektrometer. (B) Schematisch für die Analyse von suspendierten Zellen. (C) Experimentelle Ansicht der K562-Zellen, die mit dem Zellauswahlpunkt ausgewählt werden sollen. Nachdruck mit Genehmigung von Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> Abbildung 2. Fotos einer modifizierten Einzelsonde und einer Zellselektionssonde, die für MS-Experimente mit einzelsuspensionszellen verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> Abbildung 3. Vergrößertes Massenspektrum aus einer einzelnen Zelle, die die repräsentative Art zeigt (m/z 750-850). Chemische Strukturen werden mittels MS/MS-Analyse bestätigt (Abbildung S1). Nachdruck mit Genehmigung von Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Medikament Molekül*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Massenfehler (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabin + H] +
</td>
			<td>264.076</td>
			<td>11.32 Uhr</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol + Na] +
</td>
			<td>876.318</td>
			<td>2,74</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 + Na] +
</td>
			<td>895.445</td>
			<td>0,89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zelluläre Lipide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:4) + H] +
</td>
			<td>754.535</td>
			<td>3,71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:3) + H] +
</td>
			<td>756.551</td>
			<td>3,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:2) + H] +
</td>
			<td>758.569</td>
			<td>0,66</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:5) + H] +
</td>
			<td>780,551</td>
			<td>3,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:4) + H] +
</td>
			<td>782.568</td>
			<td>2.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:3) + H] +
</td>
			<td>784.585</td>
			<td>0,64</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:7) + H] +
</td>
			<td>804.551</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:6) + H] +
</td>
			<td>806.567</td>
			<td>2,48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:5) + H] +
</td>
			<td>808.583</td>
			<td>2,72</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:4) + H] +
</td>
			<td>810.601</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(40:7) + H] +
</td>
			<td>832.583</td>
			<td>3.12</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Identifizierte zelluläre Komponenten mit dem ICMP/Single-Probe-Setup. Der Nachweis aller Wirkstoffverbindungen wurde durch den Vergleich der MS/MS-Ergebnisse mit standard-Verbindung bestätigt.

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Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Für den Einsatz in Verbindung mit einem Einzelsonden-Massenspektrometrie-Setup wird eine integrierte Zellmanipulationsplattform für die Online-Analyse einzelner Suspensionszellen unter Umgebungsbedingungen entwickelt.

Integrierte Zellmanipulationsplattform gekoppelt mit der Single-Sonde zur Massenspektrometrie-Analyse von Medikamenten und Metaboliten in einzelförmigen Suspensionszellen

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Da diese Methode Zellen aus lösungsweise analysiert, kann sie verwendet werden, um Zellen in einer nahezu nativen Umgebung zu untersuchen. Dazu gehört auch die Analyse von patientenabgeleiteten Zellproben. Diese Technik erfordert wenig bis gar keine Probenvorbereitung von Zellen.Daher können wir einzelne Zellen online unter Umgebungsbedingungen analysieren, was es uns ermöglicht, die zelluläre Heterogenität zu erforschen. Diese Technik kann angewendet werden, um flüssige Biopsien aus einer Vielzahl von verschiedenen Krankheitszuständen zu untersuchen, da sie verschiedene Arten von Zellen analysieren kann, die direkt aus Patientenproben isoliert sind. Um einbohrende Glasschläuche in eine verjüngte Sonde mit scharfer Spitze umzuwandeln, legen Sie zunächst ein einzelnes Glasrohr in die Klemmen eines vertikalen Pipettenhalters, wobei das Glas in Bezug auf die Heizspule zentriert und festgezogen wird, um das Rohr an Ort und Stelle zu sichern.Die Heizspule besteht aus einem 18 Gauge Nickel Chromwiderstandsdraht, der 2,5-mal um einen Metallstab gewickelt ist. Stellen Sie die Glasschläuche mit Temperaturprogramm 19.5 ein. Stellen Sie den Magnetkolben auf vier.Lösen Sie den Magneten aus, um den Glasschlauch zu ziehen. In diesem Schritt werden zwei Sonden erstellt, die an der Spitze verschmolzen sind. Verwenden Sie Pullover, um etwa einen Millimeter von der Spitze jeder Sonde zu schneiden, wodurch eine Öffnung von etwa 10 Mikrometern Durchmesser an der Sondenspitze entsteht.Um die Glassonde zur einfachen Kopplung an den ICMP zu biegen, wird Einessonde SCMS eingerichtet. Setzen Sie zunächst eine gezogene Glassonde in die Mikroschmiede. Positionieren Sie die Oberseite etwa drei Millimeter über dem Platin-Heizdraht.Dann drehen Sie die Wärme auf dem Platindraht auf 30% der maximalen Temperatur. Biegen Sie die Sonde etwa 45 Grad von der ursprünglichen Position. Legen Sie den invertierten Mikroskop-Mikroinjektor in zwei Zellmanipulationssysteme auf einen motorisierten Tisch, um das Massenspektrometer einfach zu koppeln.Um die Glaszellenauswahlvorrichtung einzurichten, legen Sie die Glaszellen-Selektionsonden in den Metallhalter des Mikroinjektors ein, indem Sie den langen Schlitten in den Kapillarhalter legen und die Schraube anziehen, um die Sonde an Ort und Stelle zu befestigen. Positionieren Sie die Sondenspitzen parallel zur beheizten Platte. Sichern Sie den Metallhalter des Mikroinjektors in das Zellmanipulationssystem.Positionieren Sie dann die Sondenspitze in der Mitte des invertierten Mikroskoplichts. Befestigen Sie den Glasschlitten mit der einzelsonde in der Armklemme des Zellmanipulationssystems. Verbinden Sie das mit Kapillare versorgende Lösungsmittel mit einer leitfähigen Verbindung, indem Sie die Kapillare in die Hülse der Kunststoffferrule legen und die Armatur mit dem Finger anziehen.Verbinden Sie die andere Seite der leitfähigen Verbindung mit einer Kapillare, die mit einer Spritze verbunden ist, die das Probenahmelösungsmittel enthält, indem Sie die Kapillare in die Hülse legen und die Armatur anziehen. Verwenden Sie Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure als Probenahmelösungsmittel in diesen Experimenten. Befestigen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe auf dem Massenspektrometer.Positionieren Sie den Nanoelektrospray-Ionisations- oder Nano-ESI-Emitter etwa einen Millimeter auf die Öffnung des verlängerten Ionentransferrohrs. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die räumlichen Bewegungen der einzelnen Sonde zu steuern und den Nano-ESI-Emitter zentral vor dem verlängerten Ionentransferschlauch zu positionieren. Pipette die Zellen aus der Zellkultur Kolben in eine 15 Milliliter Zentrifugenröhre.Drehen Sie die Zellen bei 400 mal G in 37 Grad Celsius für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in vier Millilitern RPMI-Medium, das die Wirkstoffverbindung enthält, in der gewünschten Behandlungskonzentration aus. Passen Sie die experimentellen Parameter für das Massenspektrometer an.Wählen Sie unter der Scanmodusüberschrift der Gerätesoftware Scan definieren aus. Verwenden Sie eine Auflösung von 60.000 bei M über Z 400, ein Mikroscan 100 Millisekunden maximale Injektionszeit und automatische Verstärkungskontrolle auf. Wählen Sie unter Spritzenpumpe den Durchfluss von 150 Nanoliterpro Minute aus.Wählen Sie nSI-Quelle und wenden Sie eine Spannung von ca. 4,5 Kilovolt an. Schalten Sie das invertierte Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung ein, die sowohl für die obere Platte als auch für die untere Linse ausgewählt wurde. Schließen Sie es an den USB-Anschluss eines Laptops an, um Live-Video-Feeds aufzunehmen.Schalten Sie die beheizte Platte ein und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Gehen Sie auf dem Computer zur Registerkarte Daten erfassen und wählen Sie kontinuierlich unter erworbener Zeit aus. Um die Probe für die Analyse vorzubereiten, Pipette zwei bis drei der Probe in den Deckel einer kleinen Petrischale.Positionieren Sie die Probe in der Mitte des Lichts vom invertierten Mikroskop auf der Oberseite der beheizten Platte. Bereiten Sie die Glaszellenauswahlsonde für die Analyse vor. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Sonde so zu bewegen, dass ihre Oberseite unter dem invertierten Mikrocsope in derselben Ebene wie die Zellen fokussiert ist.Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zelleselektions-Sondenspitze zur Analyse in eine Zielzelle zu verschieben. Dieser Prozess wird mit dem invertierten Mikroskop überwacht. Drehen Sie den Griff des Mikroinjektors vorsichtig, um die Position des Mineralöls im Inneren des Schlauches anzupassen.Der Mikroinjektor sorgt für eine schonende Absaugung, um die Zielzelle an der Zellselektionssonde zu sichern. Verwenden Sie das Zellmanipulationssystem, um die Zelle an der Zellauswahlssondenspitze mithilfe eines digitalen Mikroskops, das auf die einzelne Sondenspitze fokussiert ist, zur Einzelsondenspitze zu bewegen, um diesen Prozess zu überwachen. Unbehandelte K-562-Zellen werden verwendet, um die experimentelle Methode zu etablieren.In einem typischen SCMS-Experiment können offensichtliche Veränderungen von Massenspektren beobachtet werden, wenn eine Zelle während der Detektion von Zellinhalten und nach Abschluss der Messung übertragen wird. Drei häufige zelluläre Lipidspitzen, einschließlich PC 34:4, PC 36:4 und PC 38:5, werden überwacht, um sicherzustellen, dass die Zelle erfolgreich übertragen und zelluläre Inhalte erkannt werden. Die Identität vieler PCs im Massenbereich von 750 bis 850 wird mit MSMS an unbehandelten Zelllysatproben bestätigt.Mit Hilfe der ICMP-Einzelsonde MS-Einrichtung wurden Gemcitabin, Taxol und OSW1 nach der Inkubation mit K-562-Zellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode verwendet werden kann, um intrazelluläre Lipide, Medikamente, und Metaboliten auf der Ebene der einzelnen Zellen von Zellen in Lösung in einer nahen nativen Umgebung zu studieren. Denken Sie daran, die Glaszellen-Selektionsonde sicher in den universellen Pipettenhalter zu legen, damit die Absaugung angemessen angewendet werden kann.Diese Methode kann auch auf Patienten entnommen Proben angewendet werden, um Unterschiede zwischen zellulären Metaboliten aus einer Vielzahl von Zelltypen zu unterscheiden, was uns ermöglicht, ein besseres Verständnis dieser Krankheitszustände zu gewinnen. Nach der Entwicklung dieser Methode könnten wir potenziell die Quantifizierung von Wirkstoffverbindungen auf Einzelzellebene umsetzen. Bei der Arbeit mit Zellen ist es wichtig, über eine geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Labormantel und Handschuhe zu verfügen.Bei der Arbeit mit Glas kann zusätzliche Augenverschleiß verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

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