Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

लेखकों दोनों निलंबन कोशिकाओं और सेल lysate प्रयोगों के लिए नमूना तैयारी के विकास में अपने काम के लिए नागा राम कोठापल्ली धन्यवाद. इसके अतिरिक्त, लेखकों NIH धन्यवाद (R01GM116116 और R21CA204706) धन के लिए.

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

एकीकृत सेल हेरफेर और विश्लेषण मंच एकल जांच एमएस विधि की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए निर्माण किया है, ऑन लाइन के लिए अनुमति देता है, एक के पास देशी वातावरण में गैर-अनुकूल कोशिकाओं के तेजी से विश्लेषण. तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि कम से कम नमूना तैयारी की आवश्यकता है, तो कोशिकाओं की स्थिति है कि उनके मानक राज्य की नकल में विश्लेषण कर रहे हैं. विशेष रूप से, ब्याज की व्यक्तिगत कोशिकाओं नेत्रहीन की पहचान की और चयनित किया जा सकता है, एमएस आयनन दक्षता पर मैट्रिक्स प्रभाव के प्रभाव को कम करते हुए उनके प्राकृतिक वातावरण में कोशिकाओं को बनाए रखने, तो परिणाम अधिक प्रतिनिधि कोशिकाओं 'मूल हैं स्थिति (चित्र S3)। इस तकनीक संभावित भविष्य के अध्ययन में biofluids में निलंबित रोगी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक का एक और लाभ नमूना विलायक के लचीला चयन है. यह मुख्य नमूना विलायक के रूप में एसीटोनिट्रिल शामिल करने के लिए इतना है कि microscale lysis तेजी से हो सकता है महत्वपूर्ण है. संभावित रूप से, आंतरिक मानकों (जैसे, isotopically लेबल दवा यौगिकों) ब्याज के अणुओं के परिमाणीकरण के लिए नमूना विलायक में जोड़ा जा सकता है (उदाहरण के लिए, दवा अणुओं) अलग-अलग कोशिकाओं से, उन सहित क्रांति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं भविष्य में दवा उपचार personalizing54|
हालांकि इस एकीकृत प्रणाली आसानी से कोशिकाओं की व्यापक श्रेणियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विधि की एक सीमा है कि न तो एकल जांच और न ही सेल चयन जांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है; प्रत्येक प्रयोग से पहले कई पैरामीटर (जैसे, प्रवाह दर, वोल्टेज, नैनो-ईएसआई उत्सर्जक और आयन स्थानांतरण टयूबिंग, आदि के बीच लंबाई) के अनुकूलन की आवश्यकता को आदेश देना। इसके अलावा, एकल जांच और सेल चयन जांच की छोटीता के कारण, पर्यावरणक्ष (उदा., वायु प्रवाह) के कारण दो जांचों के बीच एक जंक्शन स्थापित करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ सकता है। एक अल्पकालिक समाधान टेपिंग की लंबाई को कम करने के लिए अंत के करीब सेल-चयन जांच के झुकने है। भविष्य के काम में पर्यावरणीय प्रभावों को कम करने के लिए सेटअप के महत्वपूर्ण भागों को संलग्न करने के लिए एक आवास का विकास शामिल है। किसी सेल से सेलकी सामग्री और अल्प अर्जन समय ($2-3 s) की सीमित मात्रा के कारण, एमएस/एमएस विश्लेषण केवल अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में प्रजातियों के लिए ही आयोजित किया जा सकता है। पता लगाने संवेदनशीलता को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों में विस्तारित आयन स्थानांतरण टयूबिंग के माध्यम से सेल और संभावित आयन हानि के साथ मैट्रिक्स की शुरूआत के कारण दबा आयनन दक्षता शामिल है।

मानव जीव विज्ञान, विशेष रूप से रोग जीव विज्ञान, तेजी से व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर गतिविधियों का परिणाम माना जाता है, लेकिन पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों, जैसे तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LCMS), आम तौर पर विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है कोशिकाओं की आबादी से तैयार किए गए नमूने, जबकि अर्जित आणविक जानकारी व्यक्तिगत-कोशिका स्तर पर रासायनिक प्रक्रियाओं का सही प्रतिनिधित्व नहीं कर सकती। इन मानक, पारंपरिक तरीकों के लिए एक विश्लेषणात्मक माप पर सेलुलर विषमता के प्रभाव को विचार करने में असमर्थ हैं, और को नष्ट करने और कोशिकाओं को मिश्रण की प्रक्रिया को नष्ट करने और कोशिकाओं को मिश्रण करने के लिए lysate संभावित परिवर्तन या सेलुलर के नुकसान की ओर जाता है घटक1,2. पारंपरिक तरीकों की इन सीमाओं रोगी कोशिकाओं के विश्लेषण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, जिसमें प्राप्त नमूने कई अलग अलग सेल प्रकार के एक जटिल मिश्रण शामिल कर सकते हैं. इन कमियों को दूर करने के लिए, एकल सेल आणविक विश्लेषण विधियों, एकल सेल द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री सहित (SCMS) तरीकों, तेजी से विकसित किया जा रहा है और जैव विश्लेषण के लिए लागू किया जा रहा है, विशेष रूप से सेलुलर चयापचयों और कम आणविक वजन की जैव अणु3,4.
पहले एससीएमएस तकनीक ों का इस्तेमाल किया वैक्यूम आधारित तकनीक का इस्तेमाल किया गैर-परिवेश की स्थिति2,5,6,7,8,9, के तहत विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिएविकसित 10,11. गैर-एम्बिएंट SCMS तकनीक सेलुलर लिपिड और चयापचयों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं, लेकिन कृत्रिम परिस्थितियों के तहत नमूना pretreatment की आवश्यकता होती है, और इसलिए वास्तविक समय विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं. गैर-परिवेश विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी प्रक्रिया मैट्रिक्स घटकों के अलावा भी शामिल है, और इस तैयारी उनके प्राकृतिक वातावरण से सेलुलर घटकों को बदल सकते हैं12. इसलिए, परिवेश मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) तकनीक, जो नमूना वातावरण के लिए एक निर्वात की आवश्यकता नहीं है, एक के पास देशी वातावरण में कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है. एक वैक्यूम वातावरण नहीं होने प्रयोगात्मक डिजाइन में बहुमुखी प्रतिभा के लिए अनुमति देता है; कैमरों सेलुलर प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए जोड़ा जा सकता है और नरम आयनन तकनीक जुदाई तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है प्रत्येक एकल सेल प्रयोग से बेहतर जानकारी प्राप्त करने के लिए4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
एकल जांच SCMS विधि एक परिवेश तकनीक है कि एक निकट देशी वातावरण में रहते विश्लेषण करती है, स्तनधारी कैंसर सेल लाइनों21,43,44,45,46. इसके अलावा, एकल जांच डिवाइस अन्य बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, multicellular अगोलीय में extracellular अणुओं के विश्लेषण और ऊतकों के एमएस इमेजिंगसहित 47,48,49 ,50,51,52. तथापि, चूंकि इस विधि के लिए सबस्ट्राट्स पर सेल स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है, इसलिए निलंबन कोशिकाओं का इस तकनीक3,53का उपयोग करके सीधे विश्लेषित नहीं किया जा सकता। इसलिए, एकल जांच SCMS प्रणाली सीधे गैर-अनुकूल एकल कोशिकाओं, जैसे गैर-अनुकूल सेल लाइनों या निलंबन कोशिकाओं एक रोगी के रक्त या अन्य शारीरिक तरल पदार्थ54से अलग नमूना करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इस कार्य में, एक एकीकृत सेल जोड़-तोड़ मंच (आईसीएमपी) को एकल-प्रोब एससीएमएस तकनीक के साथ जोड़ा जाता है ताकि लाइव का विश्लेषण किया जा सके, निलंबन कोशिकाओं को न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ ऑन-लाइन (चित्र 1)46. ICMP सेल चयन की निगरानी करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के होते हैं, एक ग्लास सेल चयन जांच, एक microinstor व्यक्तिगत अस्थायी कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए, सेलुलर तापमान बनाए रखने के लिए एक गर्म थाली, स्थानिक नियंत्रित करने के लिए दो सेल हेरफेर प्रणाली दोनों ग्लास सेल चयन जांच और एकल जांच के आंदोलनों, और एक डिजिटल माइक्रोस्कोप सेल चयन जांच टिप से एकल जांच टिप करने के लिए सेल हस्तांतरण का निरीक्षण करने के लिए। एकल जांच का निर्माण पिछले प्रकाशनों में विस्तृत है और यहाँ21,48संबोधित नहीं किया जाएगा . ICMP/एकल-प्रोब प्रणाली को उच्च रिज़ॉल्यूशन द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में युग्मित किया जाता है। इस एकीकृत सेटअप मैट्रिक्स अणुओं से न्यूनतम प्रभाव के साथ जटिल जैविक नमूनों से पहचान की एकल कोशिकाओं के नमूने के लिए अनुमति देता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

एकल सेल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (SCMS) संवेदनशील का पता लगाने और व्यक्तिगत सेल स्तर पर सेलुलर प्रजातियों की व्यापक श्रेणियों का सटीक विश्लेषण सक्षम बनाता है. एकल जांच, एक microscale नमूना और आयनन डिवाइस, पर लाइन के लिए एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित किया जा सकता है, परिवेश की स्थिति के तहत सेलुलर घटकों के तेजी से SCMS विश्लेषण. पहले, एकल-प्रोब SCMS तकनीक मुख्य रूप से कोशिकाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था एक सब्सट्रेट पर immobilized, अध्ययन के लिए कोशिकाओं के प्रकार सीमित. वर्तमान अध्ययन में, एकल जांच SCMS प्रौद्योगिकी एक सेल हेरफेर प्रणाली के साथ एकीकृत किया गया है, आम तौर पर इन विट्रो निषेचन के लिए इस्तेमाल किया. यह एकीकृत सेल हेरफेर और विश्लेषण मंच एक सेल चयन जांच का उपयोग करता है की पहचान की अस्थायी कोशिकाओं पर कब्जा और microscale lysis के लिए एकल जांच टिप करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित, तत्काल मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद. इस पर कब्जा और हस्तांतरण प्रक्रिया विश्लेषण करने से पहले आसपास के समाधान से कोशिकाओं को हटा, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में मैट्रिक्स अणुओं की शुरूआत को कम से कम. इस एकीकृत सेटअप लक्षित रोगी अलग शरीर के तरल पदार्थ के नमूनों में मौजूद कोशिकाओं के SCMS विश्लेषण करने में सक्षम है (उदाहरण के लिए, मूत्र, रक्त, लार, आदि), मानव चिकित्सा और रोग जीव विज्ञान के लिए SCMS विश्लेषण के संभावित अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है.

सबसे पहले, अनुपचारित K562 कोशिकाओं प्रयोगात्मक विधि स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक ठेठ SCMS प्रयोग में, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम के स्पष्ट परिवर्तन एक सेल स्थानांतरित करने से देखा जा सकता है, सेलुलर सामग्री का पता लगाने के दौरान, और माप खत्म करने के बाद (चित्र S1). तीन आम सेलुलर लिपिड चोटियों (phosphatidylcholine, पीसी), पीसी सहित (34:4) (m/z 754.536), पीसी (36:4) (m/z 782.567), और पीसी (38:5) (m/z 808.583), सेल सफलतापूर्वक स्थानांतरित और सेलुलर सुनिश्चित करने के लिए निगरानी कर रहे हैं सामग्री का पता लगाया जाता है (चित्र S2)21,43,46,55,56. यदि लिपिड चोटियों 5 s के भीतर नहीं देखा जाता है, तो माइक्रोइंजेक्टर में खनिज तेल स्तर सेल-चयन जांच टिप पर सेल पकड़े चूषण को कम करने के लिए बदल जाता है; सावधानी बरतने की जरूरत है ताकि कोई खनिज तेल सेल चयन जांच से बाहर धकेल दिया है. m/z 750-850 के द्रव्यमान श्रेणी में कई PC की पहचान की पुष्टि अनुपचारित सेल lysate नमूनों पर MS/MS का उपयोग करके की जाती है (चित्र 3, चित्र S2, तालिका 1)46.
K562 कोशिकाओं को भी विधि की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए विभिन्न दवा यौगिकों के साथ उपचार के अधीन हैं. K562 कोशिकाओं gemcitabine के साथ इनक्यूबेट कर रहे हैं (1 $M) और taxol (1 $M) के लिए 1 एच और OSW-1 (100 एनएम, 1 $M) के लिए 4 एच और 2 एच, क्रमशः. कोशिकाओं तो PBS के साथ धोया जाता है extracellular सामग्री से दवा यौगिकों का पता लगाने को कम करने के लिए. मैट्रिक्स का योगदान (जैसे, सेल संस्कृति माध्यम से आयनों, पीबीएस, और विलायक) सेलुलर सामग्री के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम के लिए डेटा घटाव के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है, उनके काफी अलग आयन संकेतों के कारण (चित्र S3). आईसीएमपी/एकल-प्रोब एमएस सेटअप (चित्र एस44 )46का उपयोग करके सभी तीन औषध यौगिकों का पता लगाया जाता है . इन परिणामों का सुझाव है कि इस विधि intracellular लिपिड का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, दवाओं, और चयापचयों के समाधान में एक से एकल कोशिका स्तर पर एक निकट देशी वातावरण में.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> चित्र 1. एकल निलंबन सेल एमएस प्रयोगों के लिए प्रायोगिक सेटअप. (क) एकीकृत सेल हेरफेर मंच (आईसीएमपी) एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित। (B) निलंबित कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए योजना तैयार की गई है। (C) कक्ष-चयन जांच का उपयोग करके चयनित किए जाने वाले K562 कक्षों का प्रायोगिक दृश्य. Standke एट अल से अनुमति के साथ reprinted46. कॉपीराइट 2019 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> चित्र 2. एक संशोधित एकल जांच और एक सेल चयन जांच की तस्वीरें एकल निलंबन सेल एमएस प्रयोगों के लिए उपयोग किया. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> चित्र 3. प्रतिनिधि प्रजाति को दर्शाने वाली एकल कोशिका से ज़ूम-इन मास स्पेक्ट्रम (m/z 750-850)| एमएस/एमएस विश्लेषण (चित्रS1)का उपयोग करके रासायनिक संरचनाओं की पुष्टि की जाती है। Standke एट अल46से अनुमति के साथ reprinted . कॉपीराइट 2019 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
दवा अणु*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>मास त्रुटि (पीपीएम)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabine + एच] +
</td>
			<td>264.076</td>
			<td>11.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>[टैक्सॉल + ना] +
</td>
			<td>876.318</td>
			<td>2.74</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 + ना] +
</td>
			<td>895.445</td>
			<td>0.89</td>
		</tr>
<tr>
<td>सेलुलर लिपिड</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (34:4) + एच] +
</td>
			<td>754.535</td>
			<td>3.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (34:3) + एच] +
</td>
			<td>756.551</td>
			<td>3.44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (34:2) + एच] +
</td>
			<td>758.569</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (36:5) + एच] +
</td>
			<td>780.551</td>
			<td>3.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (36:4) + एच] +
</td>
			<td>782.568</td>
			<td>2.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (36:3) + एच] +
</td>
			<td>784.585</td>
			<td>0.64</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (38:7) + एच] +
</td>
			<td>804.551</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (38:6) + एच] +
</td>
			<td>806.567</td>
			<td>2.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (38:5) + एच] +
</td>
			<td>808.583</td>
			<td>2.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (38:4) + एच] +
</td>
			<td>810.601</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[पीसी (40:7) + एच] +
</td>
			<td>832.583</td>
			<td>3.12</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1. आईसीएमपी/एकल-प्रोब सेटअप का उपयोग करके सेल्युलर घटकों की पहचान की। एमएस/एमएस परिणामों की मानक यौगिक के साथ तुलना करके सभी औषध यौगिकों का पता लगाने की पुष्टि की गई थी।

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Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

एक एकीकृत सेल हेरफेर मंच परिवेश की स्थिति के तहत व्यक्तिगत निलंबन कोशिकाओं की ऑन लाइन विश्लेषण के लिए एक एकल जांच मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेटअप के साथ संयोजन के रूप में उपयोग के लिए विकसित की है.

एकीकृत सेल हेरफेर मंच एकल निलंबन कोशिकाओं में दवाओं और चयापचयों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल जांच के साथ युग्मित

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

चूंकि यह विधि समाधान से कोशिकाओं का विश्लेषण करती है, इसलिए इसका उपयोग निकट देशी वातावरण में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसमें रोगी व्युत्पन्न कोशिका नमूनों का विश्लेषण शामिल है। इस तकनीक को कोशिकाओं के कोई नमूना तैयार करने के लिए थोड़ा की आवश्यकता है।इसलिए, हम परिवेश की स्थितियों के तहत ऑनलाइन व्यक्तिगत कोशिकाओं का विश्लेषण कर सकते हैं, जो हमें सेलुलर विषमता का पता लगाने की अनुमति देता है। इस तकनीक को विभिन्न रोग राज्यों से तरल बायोप्सी का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह रोगी के नमूनों से सीधे अलग कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार का विश्लेषण कर सकता है। एक तेज टिप के साथ एक पतला जांच में एकल बोर ग्लास ट्यूबिंग को परिवर्तित करने के लिए, पहले एक बोर ग्लास ट्यूब को एक ऊर्ध्वाधर पिपेट धारक के क्लैंप में रखें, जो हीटिंग कॉइल के संबंध में ग्लास को केंद्रित करता है और ट्यूब को सुरक्षित करने के लिए कसता है।हीटिंग कॉइल में 18 गेज निकल क्रोमियम रेजिस्टेंस वायर शामिल है जो धातु की छड़ के चारों ओर 2.5 गुना है। तापमान कार्यक्रम 19.5 के साथ ग्लास ट्यूबिंग सेट करें। सोनालिका प्लंजर को चार पर सेट करें।ग्लास ट्यूबिंग खींचने के लिए सोनालिका को ट्रिगर करें। यह कदम टिप पर जुड़े दो जांच बनाता है । स्वेटर का उपयोग करने के लिए लगभग एक मिलीमीटर प्रत्येक जांच की नोक से दूर कटौती, जांच टिप पर व्यास में लगभग 10 माइक्रोन की एक छिद्र बनाने ।आईसीएमपी के लिए आसान कपलिंग के लिए कांच की जांच को मोड़ने के लिए, एकल जांच एससीएमएस स्थापित की गई। सबसे पहले माइक्रोफॉर्ज में एक खींचा ग्लास जांच सेट करें । प्लेटिनम हीटिंग तार के ऊपर शीर्ष लगभग तीन मिलीमीटर स्थिति।इसके बाद प्लैटिनम वायर पर आंच को अधिकतम तापमान के 30% तक चालू कर दें। जांच को मूल स्थिति से लगभग 45 डिग्री मोड़ें। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ आसान युग्मन के लिए एक मोटरीकृत मेज पर दो सेल हेरफेर प्रणाली में उल्टे माइक्रोस्कोप माइक्रोइंजेक्टर रखें।ग्लास सेल चयन डिवाइस स्थापित करने के लिए, केशिका धारक में लंबी स्लाइड रखकर माइक्रोइंजेक्टर के धातु धारक के अंदर ग्लास सेल चयन जांच डालें और जांच को सुरक्षित करने के लिए पेंच को मजबूत करें। जांच युक्तियों को गर्म प्लेट के समानांतर कोण की स्थिति। माइक्रो इंजेक्टर के धातु धारक को कोशिका हेरफेर प्रणाली में सुरक्षित करें।फिर उल्टे माइक्रोस्कोप प्रकाश के बीच के पास जांच टिप स्थिति। सेल हेरफेर प्रणाली के हाथ क्लैंप में एकल जांच युक्त ग्लास स्लाइड को सुरक्षित करें। प्लास्टिक फेरुल और उंगली फिटिंग कस की आस्तीन में केशिका रखकर एक प्रवाहकीय संघ के लिए केशिका प्रदान विलायक कनेक्ट करें।प्रवाहकीय संघ के दूसरे पक्ष को एक केशिका से कनेक्ट करें जो आस्तीन में केशिका रखकर और फिटिंग को कसकर नमूना विलायक युक्त सिरिंज से जुड़ा होता है। इन प्रयोगों में सैंपलिंग सॉल्वेंट के रूप में 0.1% फॉरमिक एसिड के साथ एसीटोनिट्रिल का उपयोग करें। सिरिंज को मास स्पेक्ट्रोमीटर पर सिरिंज पंप में सुरक्षित करें।नैनोइलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण या नैनो ईएसआई उत्सर्जक को विस्तारित आयन हस्तांतरण ट्यूब के छिद्र में लगभग एक मिलीमीटर रखें। एकल जांच के स्थानिक आंदोलनों को नियंत्रित करने और विस्तारित आयन हस्तांतरण ट्यूबिंग के सामने केंद्रीय रूप से नैनो ईएसआई उत्सर्जक की स्थिति के लिए सेल हेरफेर प्रणाली का उपयोग करें। कोशिका संस्कृति फ्लास्क से कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में पिपेट करें।कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में 400 बार जी पर स्पिन करें और सुपरनैंट को त्यागें। वांछित उपचार एकाग्रता पर दवा यौगिक युक्त आरपीएमआई माध्यम के चार मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों को अनुकूलित करें।उपकरण सॉफ्टवेयर के स्कैन मोड शीर्षक के तहत, स्कैन को परिभाषित करने का चयन करें। जेड 400 पर एम पर 60, 000 के रेजोल्यूशन का इस्तेमाल करें, एक माइक्रोस्कैन 100 मिलीसेकंड अधिकतम इंजेक्शन समय और ऑटोमैटिक गेन कंट्रोल ऑन करें। सिरिंज पंप के तहत, प्रति मिनट 150 नैनोलीटर की प्रवाह दर का चयन करें।एनएसआई स्रोत का चयन करें और लगभग 4.5 किलोवोल्ट का वोल्टेज लागू करें। शीर्ष प्लेट और नीचे दोनों लेंस के लिए चयनित 40 गुना आवर्धन पर उल्टे माइक्रोस्कोप चालू करें। लाइव वीडियो फीड कैप्चर करने के लिए इसे लैपटॉप के यूएसबी पोर्ट से कनेक्ट करें।गर्म प्लेट चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। कंप्यूटर पर, अधिग्रहण डेटा टैब पर जाएं और अधिग्रहीत समय के तहत लगातार चयन करें। विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने के लिए, एक छोटे पेट्री डिश के ढक्कन में नमूना के दो से तीन पिपेट।गर्म प्लेट के शीर्ष पर उल्टे माइक्रोस्कोप से प्रकाश के केंद्र में नमूना स्थिति। विश्लेषण के लिए ग्लास सेल चयन जांच तैयार करें। जांच को स्थानांतरित करने के लिए सेल हेरफेर प्रणाली का उपयोग करें ताकि इसका शीर्ष कोशिकाओं के समान विमान में उल्टे माइक्रोसोप के नीचे केंद्रित हो।सेल हेरफेर प्रणाली का उपयोग विश्लेषण के लिए एक लक्षित सेल के लिए सेल चयन जांच टिप स्थानांतरित करने के लिए। उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इस प्रक्रिया की निगरानी की जाती है। धीरे-धीरे ट्यूबिंग के अंदर खनिज तेल की स्थिति को समायोजित करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर के हैंडल को चालू करें।माइक्रोइंजेक्टर द्वारा कोशिका चयन जांच टिप के लिए लक्षित सेल को सुरक्षित करने के लिए एक सौम्य सक्शन प्रदान किया जाता है। इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए एकल जांच टिप पर केंद्रित डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल चयन जांच टिप पर सेल को एकल जांच टिप पर स्थानांतरित करने के लिए सेल हेरफेर प्रणाली का उपयोग करें। प्रयोगात्मक विधि स्थापित करने के लिए अनुपचारित K-562 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है।एक विशिष्ट एससीएमएस प्रयोग में, सेलुलर सामग्री का पता लगाने के दौरान और माप खत्म करने के बाद एक कोशिका को स्थानांतरित करने से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के स्पष्ट परिवर्तन देखे जा सकते हैं। पीसी 34:4, पीसी 36:4, और पीसी 38:5 सहित तीन आम सेलुलर लिपिड चोटियों को सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जाती है कि सेल सफलतापूर्वक स्थानांतरित हो और सेलुलर सामग्री का पता लगाया जाए। 750 से 850 की मास रेंज में कई पीसी की पहचान अनुपचारित सेल lysate नमूनों पर एमएसएमएस का उपयोग कर की पुष्टि कर रहे हैं।आईसीएमपी एकल जांच एमएस सेट अप का उपयोग करना, Gemcitabine, Taxol और OSW1 K-५६२ कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेशन के बाद पता चला । इन परिणामों का सुझाव है कि इस विधि का उपयोग निकट देशी वातावरण में समाधान में कोशिकाओं से एकल कोशिका स्तर पर इंट्रासेलुलर लिपिड, दवाओं और मेटाबोलाइट्स का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यूनिवर्सल पिपेट धारक में ग्लास सेल चयन जांच को सुरक्षित रूप से रखना याद रखें ताकि सक्शन को पर्याप्त रूप से लागू किया जा सके।इस विधि को विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों से सेलुलर मेटाबोलाइट्स के बीच मतभेदों को अलग करने के लिए रोगी व्युत्पन्न नमूनों पर भी लागू किया जा सकता है, जो हमें इन रोग राज्यों की बेहतर समझ हासिल करने की अनुमति देता है। इस विधि को विकसित करने के बाद, हम संभावित रूप से एकल कोशिका स्तर पर दवा यौगिकों के परिमाणीकरण को लागू कर सकते हैं। कोशिकाओं के साथ काम करते समय, प्रयोगशाला कोट और दस्ताने सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण होना महत्वपूर्ण है।कांच के साथ काम करते समय अतिरिक्त आंख पहनने का उपयोग किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ultraperformance लिक्विड क्रोमैटोग्राफी उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) का उपयोग जैविक स्रोतों से अलक्षित Metabolomics

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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संयंत्र दीवार Heteroxylans का अनुक्रमण Enzymic, रासायनिक (मेथिलिकरण) और शारीरिक (मास स्पेक्ट्रोमेट्री, परमाणु चुंबकीय अनुनाद) तकनीकों का प्रयोग

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

ज्यूरिक में फोटोग्राफी का उपयोग के साथ परिवेश मास स्पेक्ट्रोमेट्री के दृश्य

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

निष्कर्षण और Catecholamine न्यूरोट्रांसमीटर और उनके चयापचयों के उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक तरीका

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित माध्यमिक Nanoelectrospray Ionization का उपयोग करके वास्तविक समय सांस विश्लेषण

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Oligo-peptoids का संश्लेषण एवं मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

लाइव मेंढक (Xenopus laevis) भ्रूण में एकल कोशिका Metabolomics के लिए Microprobe केशिका ट्रो मास स्पेक्ट्रोमेट्री

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन उच्च-आदेश संरचना का अध्ययन करने के लिए डायथिलपाइरोकार्बोनेट के साथ सहसंयोजक लेबलिंग

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

केशिका वैद्युतकणसंचलन-आधारित हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

विकासशील (मेंढक) भ्रूण में सेल-वंश निर्देशित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...