Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Gli autori ringraziano Naga Rama Kothapalli per il suo lavoro nello sviluppo di una preparazione dei campioni sia per le cellule sospensioni che per gli esperimenti sul lisato delle cellule. Inoltre, gli autori ringraziano il NIH (R01GM116116 e R21CA204706) per il finanziamento.

1. Fabbricazione della sonda di selezione delle celle di vetro
<ol><li>Convertire il tubo di vetro monoforo in una sonda affoettata con una punta affilata.<ol>
<li>Posizionare un tubo di vetro monoforo (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) nei morsetti di un supporto verticale pipetta, centrando il vetro rispetto alla bobina di riscaldamento e stringere per fissare il tubo in posizione. La bobina di riscaldamento è composta da un filo di resistenza al nichel-cromo 18 calibro 18 (60 mm di lunghezza) attorno a un'asta metallica (diametro : 3,90 mm) 2,5 volte.</li>
		<li>Impostare il tubo di vetro con il programma di temperatura 19,5 (unità del produttore). Questo parametro può essere modificato per un particolare strumento.</li>
		<li>Impostare lo stantuffo solenoide a 4 (unità del produttore). Questo parametro può essere modificato per un particolare strumento.</li>
		<li>Attivare il solenoide per tirare il tubo di vetro. Questo passaggio consente di creare due sonde fuse in corrispondenza della punta.</li>
		<li>Utilizzare una pinzetta per tagliare 1 mm di distanza dalla punta di ogni sonda, creando un orifizio di 10 dollari di diametro sulla punta della sonda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Piegare la sonda in vetro per un facile accoppiamento alla configurazione SCMS ICMP/single-probe.<ol>
<li>Posizionare una sonda di vetro tirato nella microforforgia, posizionando la punta di 3 mm sopra il filo di riscaldamento platino.</li>
		<li>Accendere il calore sul filo di platino al 30% della temperatura massima.</li>
		<li>Piegare la sonda di 45 gradi dalla posizione originale (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Assemblaggio integrato della piattaforma di manipolazione cellulare
<ol><li>Posizionare il microscopio invertito, il microiniettore e due sistemi di manipolazione cellulare su un tavolo motorizzato per un facile accoppiamento con lo spettrometro di massa.<ol>
<li>Modificare uno dei sistemi di manipolazione delle cellule per contenere una sonda singola sostituendo l'estremità con un morsetto del braccio.</li>
		<li>Utilizzare una siringa di plastica con un ago per riempire il microiniettore con olio minerale. Evitare le bolle nel tubo in quanto questo influenzerà l'aspirazione.</li>
		<li>Sostituire l'inserto dello stadio del microscopio invertito con la piastra riscaldata. Impostare la piastra riscaldata a 37 gradi centigradi prima dell'analisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare il dispositivo di selezione delle celle di vetro.<ol>
<li>Inserire la sonda di selezione delle celle di vetro all'interno del supporto metallico del microiniettore posizionando il lato lungo (non piegato) nel supporto capillare e stringendo la vite per fissare la sonda in posizione. Posizionare l'angolo della punta della sonda parallelamente alla piastra riscaldata. AVVISO: La sonda di vetro è molto affilata e fragile, e si rompe facilmente. Proteggere gli occhi ed essere più cauti durante l'inserimento della sonda nel microiniettore.</li>
		<li>Fissare il supporto metallico del microiniettore nel sistema di manipolazione cellulare. Posizionare la punta della sonda vicino al centro della luce del microscopio invertito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Creare un tubo di trasferimento iolone esteso per l'inserito dello spettrometro di massa
<ol><li>Utilizzare una fresa metallica per tagliare un pezzo di tubo in acciaio inossidabile (OD: 0,0625 (1/16) in, ID: 0,021 in) 250 mm di lunghezza.</li>
	<li>Misurare 135 mm dall'estremità e posizionare un metallo selvatico in modo che 135 mm saranno esposti all'atmosfera e 115 mm saranno all'interno dello spettrometro di massa. Fissare la ferale con due chiavi per stringerlo.</li>
</ol>4. Accoppiare l'ICMP con una configurazione a sonda singola
<ol><li>Fissare il vetrino di vetro contenente la singola sonda nel morsetto del sistema di manipolazione cellulare. NOTA: le sonde singole sono fabbricate secondo un protocollo48 pubblicato in precedenza con due piccole modifiche nello studio attuale: l'emettitore nano-ESI è allungato per un facile accoppiamento allo spettrometro di massa e le singole sonde sono incollate al vetro sul lato destro per evitare di interferire con il movimento spaziale del dispositivo di selezione delle celle di vetro (Figura 2).</li>
	<li>Collegare il capillare che fornisce solvente a un'unione conduttiva posizionando il capillare nella manica (1/16 x .005 in) del ferrule di plastica e stringendo le dita del raccordo.<ol>
<li>Collegare l'altro lato dell'unione conduttiva a un capillare (ID: 40 m, OD: 150 m), che è collegato a una siringa contenente il solvente di campionamento, posizionando il capillare nella manica (1/32 x .007 in) e stringendo il raccordo. Utilizzare l'acetonitricolo con 0,1% di acido formico come solvente di campionamento in questi esperimenti. NOTA: Il solvente di campionamento è flessibile, ma deve contenere principalmente acetonitrile (o acetonitrile con acido formico per una migliore ionizzazione) per una lisi cellulare microscala rapida.</li>
		<li>Fissare la siringa nella pompa della siringa sullo spettrometro di massa.</li>
		<li>Posizionare il cavo di tensione ionizzazione su un filo di rame attaccato all'unione conduttiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare l'emettitore nano-ESI 1 mm sull'orifizio del tubo di trasferimento ioezio esteso.<ol>
<li>Utilizzare il sistema di manipolazione cellulare per controllare i movimenti spaziali della sonda singola e posizionare l'emettitore nano-ESI al centro davanti al tubo di trasferimento ioetto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparazione del campione di cellule sospese
<ol><li>Il giorno prima dell'analisi (18-24 h), seminano le cellule per il test in un fiaschetta di coltura cellulare (T25). K562 le cellule leucemiche mieloidi umane sono utilizzate come modelli in questo studio.<ol>
<li>Calore 1x fosfato bufferizzato salina (PBS) e Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio integrato con 10% siero bovino fetale sintetico (FBS) e 1% penicillina-streptomicina a 37 s per 30 min.</li>
		<li>Seme 1 x 106 cellule in un volume totale di 10 mL combinando le celle con il mezzo caldo. In generale, utilizzare una pipetta da 10 mL per inserire 8 mL di mezzo RPMI in un pallone di coltura cellulare. Quindi, utilizzare una pipetta da 2 mL per mettere 2 mL di cellule confluenti K562 il mezzo per 1 x 106 celle.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 e 5% di CO2 fino all'analisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare le celle per l'analisi.<ol>
<li>Cellule pipetine del flaasto di coltura cellulare in un tubo di centrifuga di 15 mL.</li>
		<li>Girare le cellule a 400 x g e 37 gradi centigradi per 5 min e scartare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 4 mL di mezzo RPMI contenente il composto farmacologico alla concentrazione di trattamento desiderata. NOTA: per l'analisi delle celle di controllo, risospendere le celle in 4 mL di supporto RPMI e andare al passaggio 6.</li>
		<li>Incubare le cellule per tutta la durata del tempo di trattamento a 37 e 5% di CO2.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 400 x g e 37 gradi centigradi per 5 min. Aspirate the supernatant.</li>
		<li>Le cellule vengono risospese in 10 mL di PBS e centrificate a 400 x g e 37 gradi centigradi per 5 min. Dopo la filatura, scartare il super-natante. Ripetere questo passaggio 3 volte per ridurre al minimo il rilevamento del farmaco da costituenti extracellulari.</li>
		<li>Risospendere le celle in 4 mL di PBS per l'analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Eseguire misurazioni SCMS utilizzando l'impostazione ICMP/single-probe
<ol><li>Personalizzare i parametri per lo spettrometro di massa per l'esperimento.<ol>
<li>Sotto l'intestazione Modalità di scansione del software dello strumento, selezionare Definisci scansione. Utilizzare una risoluzione di 60.000 m/m a m/z 400, 1 microscan, 100 ms tempo massimo di iniezione e controllo automatico del guadagno (AGC) su. Per gli esperimenti è stata utilizzata una gamma di massa (m/z) di 100-1000. I parametri possono essere modificati in base al modello di strumento.</li>
		<li>In Pompa siringa, selezionare una portata di 150 nL/min. La portata deve essere ottimizzata per ogni esperimento.</li>
		<li>Selezionare Sorgente NSI e applicare una tensione di 4,5 kV. Questo parametro deve anche essere ottimizzato per ogni esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Accendere il microscopio invertito (con l'ingrandimento 40x selezionato sia per la piastra superiore che per l'obiettivo inferiore) e collegarlo alla porta USB di un computer portatile per catturare i feed video dal vivo. Accendere la piastra riscaldata e impostarla a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Sul computer, passare alla scheda Acquisisci dati e selezionare Continuamente sotto Acquisisci tempo.</li>
	<li>Preparare il campione per l'analisi.<ol>
<li>Pipette 2-3 mL di campione nel coperchio di una piccola piastra Petri (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 Posizionare il campione al centro della luce dal microscopio invertito sulla parte superiore della piastra riscaldata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la sonda di selezione delle celle di vetro per l'analisi. Utilizzare il sistema di manipolazione cellulare per spostare la sonda in modo che la sua punta sia focalizzata sotto il microscopio invertito nello stesso piano delle cellule.</li>
	<li>Selezionare una singola cella per l'analisi.<ol>
<li>Utilizzare il sistema di manipolazione delle celle per spostare la punta della sonda di selezione delle celle in una cella di destinazione. Questo processo viene monitorato al microscopio invertito. NOTA: Se la punta della sonda di selezione cellulare non può essere messa a fuoco nello stesso piano delle celle, è possibile che la parte piegata della sonda non sia opportunamente inclinata. Regolare la posizione della sonda di selezione delle cellule fino a quando entrambe le punte della sonda possono essere focalizzate insieme alle cellule al microscopio.</li>
		<li>Ruotare delicatamente la maniglia del microiniettore per regolare la posizione dell'olio minerale all'interno del tubo. Un'aspirazione delicata è fornita dal microiniettore per fissare la cella mirata alla punta della sonda di selezione cellulare. NOTA: Se la cella non può essere catturata dalla sonda di selezione cellulare attraverso la forza di aspirazione, controllare la sonda di selezione della cella per assicurarsi che sia completamente inserita nel supporto capillare. Inoltre, ispezionare i livelli di olio minerale nel microiniettore e tubi, ed espellere l'aria se presente.</li>
		<li>Utilizzare il sistema di manipolazione cellulare per spostare la cella sulla punta della sonda di selezione cellulare sulla punta a sonda singola, utilizzando un microscopio digitale incentrato sulla punta a sonda singola per monitorare questo processo. Quando si tocca, una piccola gocciolina di acetonitrile sulla punta a sonda singola induce una rapida liscizia della cellula, e quindi il lisato cellulare viene immediatamente ionizzato per l'analisi della SM on-line. NOTA: poiché la cella selezionata è fissata alla punta della sonda di selezione cellulare attraverso una leggera aspirazione, questa cella può essere potenzialmente staccata durante il suo trasferimento alla punta a sonda singola. Pertanto, se i segnali ionici dei lipidi cellulari tipici (vedi risultati rappresentativi di seguito) non vengono osservati entro 5 s, è possibile che la cella sia stata scollegata e sia necessaria la selezione di una cella diversa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La piattaforma integrata di manipolazione e analisi delle cellule è costruita per espandere la versatilità del metodo MS a sonda singola, consentendo un'analisi on-line e rapida delle cellule non aderenti in un ambiente quasi nativo. Un grande vantaggio della tecnica è che è necessaria una preparazione minima del campione, quindi le cellule vengono analizzate in condizioni che imitano il loro stato standard. In particolare, le singole cellule di interesse possono essere identificate e selezionate visivamente, riducendo al minimo l'influenza dell'effetto di matrice sull'efficienza della ionizzazione della SM mantenendo le cellule nel loro ambiente naturale, quindi i risultati sono nativi delle cellule più rappresentative status (Figura S3). Questa tecnica può essere potenzialmente utilizzata per studiare le cellule del paziente sospese nei biofluidi in studi futuri. Un altro vantaggio di questa tecnica è la selezione flessibile del solvente di campionamento. È importante includere l'acetonitrile come il principale solvente di campionamento in modo che la lisi microscala possa verificarsi rapidamente. Potenzialmente, le norme interne (ad esempio, composti farmacologici etichettati isotopicamente) possono essere aggiunte nel solvente di campionamento per la quantificazione delle molecole di interesse (ad esempio, molecole di farmaci) da singole cellule, comprese quelle possono svolgere un ruolo chiave nel rivoluzionare personalizzazione dei trattamenti farmacologici in futuro54.
Anche se questo sistema integrato può essere convenientemente utilizzato per analizzare ampi intervalli di cellule, una limitazione del metodo è che né la sonda a sonda singola né la sonda di selezione cellulare sono disponibili in commercio; dettare la necessità di ottimizzazione di molti parametri (ad esempio, portata, tensione, lunghezza tra l'emettitore nano-ESI e i oniriale, ecc.) prima di ogni esperimento. Inoltre, a causa della piccolezza della sonda a sonda singola e della sonda di selezione cellulare, la perturbazione ambientale (ad esempio, il flusso d'aria) può causare difficoltà a stabilire una giunzione tra le due sonde. Una soluzione a breve termine è la piegatura della sonda di selezione delle cellule vicino alla fine per ridurre al minimo la lunghezza del tapering. Il lavoro futuro prevede lo sviluppo di un alloggiamento per racchiudere le parti critiche dell'allestimento per ridurre al minimo gli effetti ambientali. A causa della quantità limitata di contenuti cellulari e del breve tempo di acquisizione (2-3 s) da una cellula, l'analisi MS/MS può essere condotta solo per specie relativamente abbondanti. Altri fattori che influenzano la sensibilità di rilevamento includono l'efficienza di ionizzazione soppressa a causa dell'introduzione della matrice insieme alla cellula e potenziale perdita di ioni attraverso il tubo di trasferimento ioscioe esteso.

La biologia umana, in particolare la biologia delle malattie, è sempre più intesa come il risultato di attività a livello di singole cellule, ma i metodi analitici tradizionali, come la spettrometria di massa della cromatografia liquida (LCMS), sono generalmente utilizzati per analizzare campioni preparati da popolazioni di cellule, mentre le informazioni molecolari acquisite non possono rappresentare con precisione i processi chimici a livello di singole cellule. Questi metodi standard e tradizionali non sono in grado di discernere gli effetti dell'eterogeneità cellulare su una misurazione analitica e il processo di distruzione e miscelazione delle cellule per preparare il lisato porta potenzialmente all'alterazione o alla perdita di cellulare componenti1,2. Queste limitazioni dei metodi tradizionali sono particolarmente importanti nell'analisi delle cellule del paziente, in cui i campioni ottenuti possono contenere una complessa miscela di molti tipi di cellule diverse. Per ovviare a queste carenze, i metodi di analisi molecolare a cellula singola, compresi i metodi di spettrometria di massa a cellule singole (SCMS), sono sempre più sviluppati e applicati alla bioanalisi, in particolare dei metaboliti cellulari e del basso peso molecolare biomolecole3,4.
Le prime tecniche SCMS hanno sviluppato tecniche utilizzate a base di vuoto per eseguire le analisi in condizioni non ambientali2,5,6,7,8,9, 10,11. Le tecniche SCMS non ambientali sono in grado di analizzare lipidi cellulari e metaboliti, ma richiedono un pretrattamento del campione in condizioni artificiali e quindi non sono adatte per l'analisi in tempo reale. Il processo di preparazione dei campioni per l'analisi non ambientale include l'aggiunta di componenti della matrice e questa preparazione può alterare i componenti cellulari dal loro ambiente naturale12. Pertanto, le tecniche di spettrometria di massa ambientale (MS), che non richiedono un vuoto per l'ambiente di campionamento, vengono utilizzate per analizzare le cellule in un ambiente quasi nativo. Non avere un ambiente vuoto permette versatilità nel progetto sperimentale; le telecamere possono essere aggiunte per monitorare il processo cellulare e tecniche di ionizzazionepiù morbide possono essere combinate con tecniche di separazione per ricevere informazioni migliori da ogni esperimento a cella singola 4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
Il metodo SCMS single-probe è una tecnica ambientale che analizza le linee cellulari del cancro dei mammiferi vive in un ambiente quasi nativo21,43,44,45,46. Inoltre, il dispositivo a sonda singola è stato utilizzato per altre applicazioni di spettrometria di massa, tra cui l'analisi di molecole extracellulari negli sferoidi multicellulari e l'imaging MS dei tessuti47,48,49 ,50,51,52. Tuttavia, poiché l'immobilizzazione delle cellule sui substrati è necessaria per questo metodo, le celle di sospensione non possono essere analizzate direttamente utilizzando questa tecnica3,53. Pertanto, il sistema SCMS a sonda singola non poteva essere utilizzato direttamente per campionare cellule singole non aderenti, come linee cellulari non aderenti o cellule di sospensione isolate dal sangue di un paziente o da altri fluidi corporei54. In questo lavoro, una piattaforma di manipolazione cellulare integrata (ICMP) è accoppiata con la tecnica SCMS single-probe per analizzare live, celle sospensione on-line con la preparazione minima campione (Figura 1)46. L'ICMP è costituito da un microscopio invertito per monitorare la selezione delle cellule, una sonda di selezione delle cellule di vetro, un microiniettore per catturare singole cellule galleggianti, una piastra riscaldata per mantenere la temperatura cellulare, due sistemi di manipolazione cellulare per controllare movimenti sia della sonda di selezione delle celle di vetro che di una singola sonda, e di un microscopio digitale per osservare il trasferimento cellulare dalla punta della sonda di selezione cellulare alla punta a sonda singola. La fabbricazione della singola sonda è descritta in dettaglio nelle pubblicazioni precedenti e non sarà affrontata qui21,48. Il sistema ICMP/single-probe è accoppiato a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Questa configurazione integrata consente il campionamento di singole cellule identificate da complessi campioni biologici con effetti minimi dalle molecole a matrice.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

La spettrometria di massa a cella singola (SCMS) consente il rilevamento sensibile e l'analisi accurata di ampie gamme di specie cellulari a livello di singola cellula. La singola sonda, un dispositivo di campionamento e ionizzazione su microscala, può essere accoppiata con uno spettrometro di massa per l'analisi SCMS on-line e rapida dei costituenti cellulari in condizioni ambientali. In precedenza, la tecnica SCMS a sonda singola veniva utilizzata principalmente per misurare le cellule immobilizzate su un substrato, limitando i tipi di cellule per gli studi. Nello studio attuale, la tecnologia SCMS a sonda singola è stata integrata con un sistema di manipolazione cellulare, tipicamente utilizzato per la fecondazione in vitro. Questa piattaforma integrata di manipolazione e analisi delle cellule utilizza una sonda di selezione cellulare per catturare singole cellule galleggianti identificate e trasferire le cellule alla punta a sonda singola per la lisi di microscala, seguita da un'analisi immediata della spettrometria di massa. Questo processo di acquisizione e trasferimento rimuove le cellule dalla soluzione circostante prima dell'analisi, riducendo al minimo l'introduzione di molecole di matrice nell'analisi della spettrometria di massa. Questa configurazione integrata è in grado di eseguire l'analisi SCMS delle cellule mirate isolate dal paziente presenti nei campioni di fluidi corporei (ad esempio, urina, sangue, saliva, ecc.), consentendo potenziali applicazioni dell'analisi SCMS alla medicina umana e alla biologia della malattia.

In primo luogo, le cellule K562 non trattate vengono utilizzate per stabilire il metodo sperimentale. In un tipico esperimento SCMS, è possibile osservare ovvi e ovvi cambiamenti degli spettri di massa dal trasferimento di una cella, durante il rilevamento del contenuto cellulare e dopo aver terminato la misurazione (Figura S1). Tre picchi lipidicellulari comuni (fosfatidicilcolina, PC), tra cui PC(34:4) (m/z 754.536), PC(36:4) (m/z 782.567) e PC (38:5) (m/z 808.583), sono monitorati per garantire che la cella venga trasferita con successo e che la cellula venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella sia trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella sia trasferita correttamente e che la cella sia trasferita correttamente e che la cella venga trasferita correttamente e che la cella venga trasferita corretta contenuto vengono rilevati (Figura S2)21,43,46,55,56. Se i picchi di lipidi non si vedono entro 5 s, il livello di olio minerale nel microiniettore viene modificato per ridurre l'aspirazione che tiene la cella sulla punta della sonda di selezione cellulare; occorre prestare attenzione in modo che nessun olio minerale venga espulso dalla sonda di selezione delle cellule. L'identità di molti PC nell'intervallo di massa di m/z 750-850 viene confermata utilizzando MS/MS su campioni di lysate di cellule non trattate (Figura 3, Figura S2, Tabella 1)46.
Anche le cellule K562 sono sottoposte a trattamento con vari composti farmacologici per espandere la versatilità del metodo. Le cellule K562 sono incubate con gemcitabine (1 M) e taxol (1 M) per 1 h e OSW-1 (100 nM, 1 M) rispettivamente per 4 h e 2 h. Le cellule vengono poi lavate con PBS per ridurre al minimo il rilevamento di composti farmacologici da contenuto extracellulare. Il contributo della matrice (ad esempio, gli ioni dal mezzo di coltura cellulare, PBS e solvente) agli spettri di massa del contenuto cellulare può essere eliminato attraverso la sottrazione dei dati, a causa dei loro segnali ionici significativamente diversi (Figura S3). Tutti e tre i composti di droga vengono rilevati utilizzando l'impostazione Ms ICMP/single-probe (Figura S4)46. Questi risultati suggeriscono che questo metodo può essere utilizzato per studiare lipidi intracellulari, farmaci e metaboliti a livello di singola cellula dalle cellule in soluzione in un ambiente quasi nativo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> come illustrato nella Figura 1. Configurazione sperimentale per esperimenti sulla MS a cella a sospensione singola. (A) La piattaforma di manipolazione cellulare integrata (ICMP) accoppiata con uno spettrometro di massa. (B) Schematica per l'analisi delle celle sospese. (C) Vista sperimentale delle celle K562 da selezionare utilizzando la sonda di selezione delle celle. Ristampato con il permesso diStandke et al. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> come illustrato nella Figura 2. Foto di una sonda singola modificata e di una sonda di selezione cellulare utilizzata per esperimenti sulle MS a cella a singola sospensione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> come illustrato nella figura 3. Spettro di massa ingrandito da una singola cellula che mostra la specie rappresentativa (m/z 750-850). Le strutture chimiche sono confermate mediante l'analisi MS/MS (Figura S1). Ristampato con il permesso di Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Molecola di Droga</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Errore di massa (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabine s.r.l.m.] +
</td>
			<td>Ore 264.076</td>
			<td>11.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol - Na] +
</td>
			<td>876.318</td>
			<td>2.74</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 - Na] +
</td>
			<td>895.445</td>
			<td>0,89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lipidi cellulari</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:4) - H] +
</td>
			<td>754.535</td>
			<td>3.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:3) : H] +
</td>
			<td>756.551</td>
			<td>3.44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:2) - H] +
</td>
			<td>758.569</td>
			<td>0,66 (in inglese)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:5) - H] +
</td>
			<td>780.551</td>
			<td>3.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:4) - H] +
</td>
			<td>782.568</td>
			<td>2.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:3) - H] +
</td>
			<td>784.585</td>
			<td>0,64 (in inglese)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:7) - H] +
</td>
			<td>804.551</td>
			<td>4.1 (in questo stato del documento)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:6) - H] +
</td>
			<td>806.567</td>
			<td>2.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:5) - H] +
</td>
			<td>808.583</td>
			<td>2.72 (in questo stato del documento)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:4) - H] +
</td>
			<td>810.601</td>
			<td>0 (in vie</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(40:7) - H] +
</td>
			<td>832.583</td>
			<td>3.12</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Componenti cellulari identificati mediante la configurazione ICMP/Single-probe. La rilevazione di tutti i composti farmacologici è stata confermata confrontando i risultati MS/MS con il composto standard.

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Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Una piattaforma di manipolazione cellulare integrata è sviluppata per l'uso in combinazione con una configurazione di spettrometria di massa a singola sonda per l'analisi on-line delle singole cellule delle sospensioni in condizioni ambientali.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Poiché questo metodo analizza le cellule dalla soluzione, può essere utilizzato per studiare le cellule in un ambiente quasi nativo. Ciò include l'analisi dei campioni di cellule derivate dal paziente. Questa tecnica richiede poca o nessuna preparazione del campione di cellule.Pertanto, possiamo analizzare singole cellule online in condizioni ambientali, il che ci consente di esplorare l'eterogeneità cellulare. Questa tecnica può essere applicata per studiare biopsie liquide da una varietà di stati di malattia diversi, poiché può analizzare diversi tipi di cellule direttamente isolate dai campioni del paziente. Per convertire i tubi di vetro a foro singolo in una sonda affusolata con una punta affilata, posizionare innanzitutto un singolo tubo di vetro di foro nei morsetti di un supporto di pipetta verticale, centrando il vetro rispetto alla bobina di riscaldamento e stringere per fissare il tubo in posizione.La bobina di riscaldamento è composta da un filo di resistenza al cromo di nichel calibro 18 arrotolato attorno a un'asta metallica 2,5 volte. Impostare il tubo di vetro con programma di temperatura 19.5. Impostare il pistone solenoide alle quattro.Attiva il solenoide per premere i tubi di vetro. Questo passaggio crea due sonde fuse sulla punta. Utilizzare i maglioni per tagliare a circa un millimetro di distanza dalla punta di ogni sonda, creando un orifizio di circa 10 micron di diametro sulla punta della sonda.Per piegare la sonda di vetro per un facile accoppiamento all'ICMP, è necessario impostare SCMS a sonda singola. Per prima cosa impostare una sonda di vetro tirata nella microforgia. Posizionare la parte superiore di circa tre millimetri sopra il filo riscaldante in platino.Quindi, ruotare il calore sul filo di platino al 30% della temperatura massima. Piegare la sonda a circa 45 gradi dalla posizione originale. Posizionare il microscopio invertito in due sistemi di manipolazione cellulare su un tavolo motorizzato per un facile accoppiamento con lo spettrometro di massa.Per impostare il dispositivo di selezione della cella di vetro, inserire la sonda di selezione della cella di vetro all'interno del supporto metallico del microiniettore posizionando il lungo scivolo nel supporto capillare e stringendo la vite per fissare la sonda in posizione. Posizionare le punte della sonda angolate parallelamente alla piastra riscaldata. Fissare il supporto metallico del micro iniettore nel sistema di manipolazione cellulare.Quindi posizionare la punta della sonda vicino al centro della luce del microscopio invertita. Fissare lo scivolo di vetro contenente la singola sonda nel morsetto del braccio del sistema di manipolazione cellulare. Collegare il solvente fornendo capillare a un'unione conduttiva posizionando il capillare nel manicotto del ferrule plastico e stringendo il raccordo.Collegare l'altro lato dell'unione conduttiva a un capillare collegato a una siringa contenente il solvente di campionamento posizionando il capillare nel manicotto e stringendo il raccordo. Utilizzare acetonitrile con acido formico allo 0,1% come solvente di campionamento in questi esperimenti. Fissare la siringa nella pompa della siringa sullo spettrometro di massa.Posizionare la ionizzazione nanoelettrospray o l'emettitore nano ESI di circa un millimetro all'orifizio del tubo di trasferimento ionico esteso. Utilizzare il sistema di manipolazione cellulare per controllare i movimenti spaziale della singola sonda e posizionare l'emettitore nano ESI centralmente di fronte al tubo di trasferimento ionica esteso. Pipettare le cellule dal pallone di coltura cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Ruotare le cellule a 400 volte G in 37 gradi Celsius per cinque minuti e scartare il supernatante. Resuspend le cellule in quattro millilitri di mezzo RPMI contenente il composto farmacologico alla concentrazione di trattamento desiderata. Personalizzare i parametri sperimentali per lo spettrometro di massa.Sotto l'intestazione della modalità di scansione del software dello strumento, selezionare definisci scansione. Utilizzare una risoluzione di 60.000 m su Z 400, un microscan 100 millisecondo di tempo massimo di iniezione e il controllo automatico del guadagno. Sotto la pompa della siringa, selezionare la portata di 150 nanolitri al minuto.Selezionare la sorgente NSI e applicare una tensione di circa 4,5 kilovolt. Accendere il microscopio invertito a 40 volte l'ingrandimento selezionato sia per la piastra superiore che per l'obiettivo inferiore. Collegalo alla porta USB di un laptop per acquisire feed video in diretta.Accendere la piastra riscaldata e impostarla a 37 gradi Celsius. Nel computer, passare alla scheda acquisisci dati e selezionare continuamente sotto il tempo acquisito. Per preparare il campione per l'analisi, pipettare da due a tre del campione nel coperchio di una piccola piastra di Petri.Posizionare il campione al centro della luce dal microscopio invertito sopra la piastra riscaldata. Preparare la sonda di selezione delle celle di vetro per l'analisi. Utilizzare il sistema di manipolazione cellulare per spostare la sonda in modo che la parte superiore sia focalizzata sotto la microcsope invertita nello stesso piano delle celle.Utilizzate il sistema di manipolazione delle celle per spostare la punta della sonda di selezione delle celle in una cella di destinazione per l'analisi. Questo processo viene monitorato utilizzando il microscopio invertito. Ruotare delicatamente la maniglia del microiniettore per regolare la posizione dell'olio minerale all'interno del tubo.Un'aspirazione delicata è fornita dal microiniettore per fissare la cella di destinazione alla punta della sonda di selezione cellulare. Utilizzare il sistema di manipolazione delle celle per spostare la cella nella punta della sonda di selezione delle celle sulla punta della sonda singola utilizzando un microscopio digitale focalizzato sulla punta della singola sonda per monitorare questo processo. Le cellule K-562 non trattate vengono utilizzate per stabilire il metodo sperimentale.In un tipico esperimento SCMS, evidenti cambiamenti di spettri di massa possono essere osservati dal trasferimento di una cellula durante il rilevamento del contenuto cellulare e dopo aver terminato la misurazione. Tre picchi lipidici cellulari comuni tra cui PC 34:4, PC 36:4 e PC 38:5 vengono monitorati per garantire che la cellula venga trasferita correttamente e che il contenuto cellulare venga rilevato. L'identità di molti PC nell'intervallo di massa da 750 a 850 è confermata utilizzando MSMS su campioni di lisato cellulare non trattato.Utilizzando l'ICMP single probe MS set up, Gemcitabine, Taxol e OSW1 sono stati rilevati dopo l'incubazione con cellule K-562. Questi risultati suggeriscono che questo metodo può essere utilizzato per studiare lipidi intracellulari, farmaci e metaboliti a livello di singola cellula dalle cellule in soluzione in un ambiente quasi nativo. Ricordarsi di posizionare in modo sicuro la sonda di selezione della cella di vetro nel supporto della pipetta universale in modo che l'aspirazione possa essere applicata in modo adeguato.Questo metodo può anche essere applicato a campioni derivati dal paziente per distinguere le differenze tra i metaboliti cellulari da una varietà di tipi di cellule, il che ci consente di ottenere una migliore comprensione di questi stati di malattia. Dopo aver sviluppato questo metodo, potremmo potenzialmente implementare la quantificazione dei composti farmaceutici a livello di singola cellula. Quando si lavora con le cellule, è importante avere dispositivi di protezione individuale appropriati tra cui camice da laboratorio e guanti.Un'ulteriore usura degli occhi può essere utilizzata quando si lavora con il vetro.

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