Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

저자는 현탁액 세포와 세포 용해 실험 모두에 대한 샘플 준비를 개발하는 그녀의 작품에 대한 나가 라마 Kothapalli 감사합니다. 또한, 저자는 자금 에 대한 NIH (R01GM116116 및 R21CA204706)에 감사드립니다.

1. 유리 셀 선택 프로브 제조
<ol><li>단일 보어 유리 튜브를 날카로운 팁으로 테이퍼 드 프로브로 변환합니다.<ol>
<li>단일 보어 유리 튜브(ID: 0.3 mm, OD: 1.1. mm)를 수직 파이펫 홀더의 클램프에 넣고 가열 코일과 관련하여 유리를 중앙에 배치하고 튜브를 제자리에 고정시도록 조입니다. 가열 코일은 금속 막대 (직경 = 3.90 mm) 2.5 배 주위에 코일 18 게이지 니켈 크롬 저항 와이어 (~ 60mm 길이)로 구성되어 있습니다.</li>
		<li>온도 프로그램 19.5 (제조업체의 단위)와 유리 튜브를 설정합니다. 이 매개 변수는 특정 계측기에서 수정할 수 있습니다.</li>
		<li>솔레로이드 플런저를 4(제조업체 의 장치)로 설정합니다. 이 매개 변수는 특정 계측기에서 수정할 수 있습니다.</li>
		<li>솔레노이드를 트리거하여 유리 튜브를 당깁니다. 이 단계에서는 팁에 융합된 두 개의 프로브를 만듭니다.</li>
		<li>핀셋을 사용하여 각 프로브의 끝에서 ~1mm 떨어진 곳에서 절단하여 프로브 팁에서 직경 ~10 μm의 오리피스를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ICMP/단일 프로브 SCMS 설정에 쉽게 결합할 수 있도록 유리 프로브를 구부립니다.<ol>
<li>당겨진 유리 프로브를 마이크로 포지에 넣고 백금 가열 와이어 위에 ~ 3mm의 팁을 배치합니다.</li>
		<li>백금 와이어의 열을 최대 온도의 30%로 돌립니다.</li>
		<li>프로브를 원래 위치에서 ~45°로구부립니다(그림 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 통합 셀 조작 플랫폼 조립
<ol><li>역현미경, 마이크로인젝터 및 두 개의 세포 조작 시스템을 전동 테이블에 놓아 질량 분석기와 쉽게 결합할 수 있습니다.<ol>
<li>끝을 암 클램프로 대체하여 단일 프로브를 수용하도록 셀 조작 시스템 중 하나를 수정합니다.</li>
		<li>바늘이 달린 플라스틱 주사기를 사용하여 마이크로 인젝터를 미네랄 오일로 채웁니다. 이것은 흡입에 영향을 미치기 때문에 튜브에 있는 거품을 피하십시오.</li>
		<li>반전된 현미경의 스테이지 삽입을 가열 플레이트로 교체합니다. 분석 전에 가열 플레이트를 37°C로 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리 셀 선택 장치를 설정합니다.<ol>
<li>긴(비구부러진) 면을 모세관 홀더에 넣고 나사를 조여 프로브를 제자리에 고정하여 마이크로인젝터의 금속 홀더 내부에 유리 셀 선택 프로브를 삽입합니다. 프로브 팁의 각도를 가열 플레이트와 평행하게 놓습니다. 주의: 유리 프로브는 매우 날카롭고 깨지기 쉬우며 쉽게 부서집니다. 마이크로인젝터에 프로브를 삽입하는 동안 눈을 보호하고 각별한 주의를 기울이십시오.</li>
		<li>마이크로인젝터의 금속 홀더를 셀 조작 시스템에 고정합니다. 프로브 팁을 반전된 현미경 광의 중간 부근에 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 질량 분석기 입구를 위한 확장된 이온 전달 튜브 만들기
<ol><li>금속 커터를 사용하여 스테인리스 스틸 튜브 조각 (OD : 0.0625 (1/16), ID : 0.021 in) ~ 250mm 길이를 절단하십시오.</li>
	<li>끝에서 135mm를 측정하고 금속 야성을 배치하므로 ~ 135mm가 대기에 노출되고 ~ 115mm가 질량 분광계 내부에 있을 것입니다. 두 개의 렌치를 사용하여 야생을 고정하여 조입니다.</li>
</ol>4. ICMP를 단일 프로브 설정과 결합
<ol><li>단일 프로브를 포함하는 유리 슬라이드를 셀 조작 시스템의 암 클램프에 고정합니다. 참고 : 단일 프로브는 현재 연구에서 두 가지 사소한 변화와 함께 이전에 게시 된 프로토콜48에 따라 제작됩니다 : 나노 ESI 방출기는 질량 분석계에 쉽게 결합하기 위해 더 오래 만들어지고 단일 프로브는 유리에 접착됩니다. 유리 셀 선택 장치의 공간 이동을 방해하지 않도록 오른쪽 측면에 있습니다(그림 2).</li>
	<li>플라스틱 페룰의 슬리브(1/16 x .005 in)에 모세관을 넣고 피팅을 손가락으로 조여 용매를 제공하는 모세관을 전도성 결합에 연결합니다.<ol>
<li>전도성 연합의 다른 쪽을 모세관(ID: 40 μm, OD: 150 μm)에 연결하여 샘플링 용매를 포함하는 주사기에 연결하여 모세관을 슬리브(1/32 x .007 in)에 넣고 피팅을 조여 서 이 실험에서 샘플링 용매로 0.1% 포르믹산을 가진 아세토니트릴을 사용하십시오. 참고 : 샘플링 용매는 유연하지만, 빠른 마이크로 스케일 세포 용해를위해 주로 아세토니트릴 (또는 더 나은 이온화를 위한 포산이있는 아세토니트릴)을 포함해야합니다.</li>
		<li>질량 분석기의 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다.</li>
		<li>이온화 전압 코드를 전도성 결합에 부착된 구리 와이어에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>나노-ESI 방출기를 확장된 이온 전달 튜브의 오리피스에 ~1 mm 위치.<ol>
<li>셀 조작 시스템을 사용하여 단일 프로브의 공간 이동을 제어하고 나노 ESI 방출기를 확장 된 이온 전달 튜브 앞에 중앙에 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 일시 중단 된 세포 샘플 준비
<ol><li>분석 전날(~18-24시간), 세포 배양 플라스크(T25)에서 검사를 위한 세포를 시드 아웃한다. K562 인간 골수성 백혈병 세포는 본 연구에서 모델로 사용된다.<ol>
<li>열 1x 인산완충 식염수 (PBS) 및 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 매체는 10 % 합성 태아 소 혈청 (FBS) 및 37 °C에서 1 % 페니실린 - 스트렙 토마이신을 30 분 동안 보충했습니다.</li>
		<li>종자 ~1 x 106 세포를 따뜻한 배지와 결합하여 총 부피 10 mL. 일반적으로, 10 mL 파이펫을 사용하여 RPMI 배지의 8 mL을 세포 배양 플라스크내로 배치한다. 이어서, 2 mL 파이펫을 사용하여 2 mL의 Confluent K562 세포를 ~1 x 106 세포에 대한 배지를 넣는다.</li>
		<li>분석전까지 세포를 37°C 및 5% CO2에서 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석을 위해 셀을 준비합니다.<ol>
<li>세포 배양 플라스크로부터 15 mL 원심분리기 튜브내로 피펫 세포.</li>
		<li>400 x g 및 37 °C에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운하고 상류를 버립니다.</li>
		<li>원하는 치료 농도에서 약물 화합물을 함유하는 RPMI 배지의 4 mL에서 세포를 재중단한다. 참고 : 제어 셀의 분석을 위해 RPMI 배지의 4 mL에서 셀을 다시 일시 중단하고 6 단계로건너 뜁니다.</li>
		<li>37°C 및 5% CO2에서 치료 시간 동안 세포를배양한다.</li>
		<li>400 x g 및 37 °C에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운합니다.</li>
		<li>세포는 PBS의 10 mL에서 재중단되고, 원심분리기는 400 x g 및 37°C에서 5분 동안 이다. 회전 후 상급체를 버리십시오. 세포외 성분에서 약물의 검출을 최소화하기 위해 이 단계를 3번 반복하십시오.</li>
		<li>분석을 위해 PBS 4mL에서 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ICMP/단일 프로브 설정을 사용하여 SCMS 측정 수행
<ol><li>실험의 질량 분석기매개변수를 사용자 지정합니다.<ol>
<li>계측기 소프트웨어의 스캔 모드 제목 아래에서 스캔 정의를선택합니다. m/z 400, 마이크로스캔 1마이크로스캔, 최대 사출 시간 100ms, 자동 게인 제어(AGC)에서 60,000m/m의 해상도를 사용합니다. 100-1000의 질량 범위(m/z)를 실험에 활용하였다. 계측기 모델에 따라 매개 변수를 수정할 수 있습니다.</li>
		<li>주사기펌프에서 150 nL/min의 유량을 선택합니다.</li>
		<li>NSI 소스를 선택하고 ~ 4.5 kV의 전압을 적용합니다. 또한 이 매개 변수는 각 실험에 대해 최적화되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뒤집힌 현미경(상단 플레이트 및 하단 렌즈 모두에 대해 40배 배율 선택)을 켜고 랩톱의 USB 포트에 연결하여 라이브 비디오 피드를 캡처합니다. 가열 된 플레이트를 켜고 37 °C로 설정합니다.</li>
	<li>컴퓨터에서 데이터 획득 탭으로 이동하여 획득 시간에서 계속 을 선택합니다.</li>
	<li>분석을 위해 샘플을 준비합니다.<ol>
<li>작은 페트리 접시 (35mm x 12mm)의 뚜껑에 샘플 의 파이펫 2-3 mL.</li>
		<li>6.4.2 가열된 플레이트 위에 반전된 현미경으로부터 빛의 중심에 시료를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석을 위해 유리 셀 선택 프로브를 준비합니다. 세포 조작 시스템을 사용하여 프로브의 끝이 세포와 동일한 평면의 반전된 현미경 아래에 집중되도록 프로브를 이동합니다.</li>
	<li>분석을 위해 개별 셀을 선택합니다.<ol>
<li>셀 조작 시스템을 사용하여 셀 선택 프로브 팁을 대상 셀로 이동합니다. 이 프로세스는 반전된 현미경을 사용하여 감시됩니다. 참고: 셀 선택 프로브의 팁이 셀과 동일한 평면에 초점을 맞출 수 없는 경우 프로브의 구부러진 부분이 적절하게 각도가 지정되지 않았을 수 있습니다. 두 프로브 팁이 현미경의 밑에 세포와 함께 집중될 수 있을 때까지 세포 선택 프로브의 위치를 조정합니다.</li>
		<li>마이크로인젝터의 손잡이를 부드럽게 돌려 튜브 내부의 미네랄 오일의 위치를 조정합니다. 미세 인젝터는 표적 세포를 셀 선택 프로브 팁에 고정시키기 위해 부드러운 흡입을 제공합니다. 참고: 흡입력을 통해 셀 선택 프로브에 의해 셀을 포착할 수 없는 경우 셀 선택 프로브를 확인하여 모세관 홀더에 완전히 삽입되었는지 확인합니다. 또한, 마이크로 인젝터와 튜브의 미네랄 오일 수준을 검사하고, 있는 경우 공기를 배출.</li>
		<li>셀 조작 시스템을 사용하여 셀 선택 프로브 팁에서 세포를 단일 프로브 팁으로 이동하여 단일 프로브 팁에 초점을 맞춘 디지털 현미경을 사용하여 이 프로세스를 모니터링합니다. 만질 때, 단일 프로브 팁에 작은 아세토니트릴 방울은 세포의 급속한 용해를 유도하고, 그 후 세포 용해는 온라인 MS 분석을 위해 즉시 이온화된다. 참고: 선택한 셀은 부드러운 흡입을 통해 셀 선택 프로브 팁에 고정되기 때문에 이 셀은 단일 프로브 팁으로 전송하는 동안 잠재적으로 분리될 수 있습니다. 따라서, 전형적인 세포 지질의 이온 신호(아래 대표적인 결과 참조)가 5초 이내에 관찰되지 않으면, 세포가 부착되지 않게 되고, 다른 세포의 선택이 필요할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

통합 된 셀 조작 및 분석 플랫폼은 단일 프로브 MS 방법의 다양성을 확장하도록 구성되어 거의 기본 환경에서 비 부착 셀을 온라인, 신속하게 분석 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 시료 전처리가 필요하므로 세포가 표준 상태를 모방하는 조건에서 분석된다는 것입니다. 특히, 관심 있는 개별 세포를 시각적으로 식별하고 선택할 수 있어 자연 환경에서 세포를 유지하면서 MS 이온화 효율에 대한 매트릭스 효과의 영향을 최소화할 수 있으므로 그 결과는 보다 대표적인 세포의 기본 세포입니다. 상태(그림S3)를참조하십시오. 이 기술은 잠재적으로 미래 연구에서 생체 유체에 중단 된 환자 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 또 다른 장점은 샘플링 용매의 유연한 선택입니다. 미세 스케일 용해가 빠르게 발생할 수 있도록 주요 샘플링 용매로 아세토니트릴을 포함하는 것이 중요합니다. 잠재적으로, 내부 표준(예를 들어, 동위원소 표지된 약물 화합물)은 개별 세포로부터 관심 있는 분자(예를 들어, 약물 분자)의 정량화를 위한 샘플링 용매에 첨가될 수 있으며, 이를 포함하여 혁명에 중요한 역할을 할 수 있다. 향후 약물 치료 개인화54.
이 통합 시스템은 광범위한 셀을 분석하는 데 편리하게 사용될 수 있지만, 방법의 한계는 단일 프로브 또는 셀 선택 프로브가 시판되지 않는다는 것입니다. 각 실험 에 앞서 많은 파라미터(예: 유량, 전압, 나노 ESI 방사체 및 이온 전달 튜브 사이의 길이)의 최적화필요성을 지시한다. 또한, 단일 프로브 및 셀 선택 프로브의 소박함으로 인해 환경 적 동요(예를 들어, 공기 흐름)는 두 프로브 사이의 접합을 확립하는 데 어려움을 초래할 수 있다. 단기 용액은 테이핑 길이를 최소화하기 위해 종단에 가까운 셀 선택 프로브의 굽힘입니다. 향후 작업에는 환경 영향을 최소화하기 위해 설정의 중요한 부분을 둘러싸는 주택 개발이 포함됩니다. 세포에서 세포 내용물의 제한된 양과 짧은 수집 시간 (~ 2-3 s)으로 인해 MS / MS 분석은 상대적으로 풍부한 종에 대해서만 수행 될 수 있습니다. 검출 감도에 영향을 미치는 다른 요인으로는 확장된 이온 전달 튜브를 통한 전지 및 잠재적 이온 손실과 함께 매트릭스의 도입으로 인한 억제된 이온화 효율이 포함됩니다.

인간 생물학, 특히 질병 생물학은 개별 세포의 수준에 있는 활동의 결과로 점점 이해되고 있습니다, 그러나 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LCMS)와 같은 전통적인 분석 방법은 일반적으로 분석하기 위하여 이용됩니다 취득한 분자 정보가 개별 세포 수준에 화학 프로세스를 정확하게 나타낼 수 없는 반면, 세포의 인구에서 준비된 견본은. 이러한 표준, 전통적인 방법은 분석 측정에 대한 세포 이질성의 영향을 분별 할 수 없으며, 세포를 파괴하고 혼합하여 포식을 준비하는 과정은 잠재적으로 세포의 변경 또는 손실로 이어집니다. 구성요소 1,2. 전통적인 방법의 이 제한은 얻어진 견본이 많은 다른 세포 모형의 복잡한 혼합물을 포함할 수 있는 참을성 있는 세포의 분석에서 특히 중요합니다. 이러한 결핍을 극복하기 위해 단일 세포 질량 분석법(SCMS) 방법을 포함한 단일 세포 분자 분석 방법이 점점 더 개발되고 있으며, 특히 세포 대사 산물과 낮은 분자량의 생물 분석에 적용되고 있습니다. 생체 분자3,4.
첫번째 SCMS 기술은 비 주변 조건2,5,6,7,8,9에서 분석을 수행하기 위해 진공 기반 기술을 사용했습니다. 10,11. 비주변 SCMS 기술은 세포 지질 및 대사 산물을 분석할 수 있지만 인공 조건하에서 시료 전처리가 필요하므로 실시간 분석에 적합하지 않습니다. 비주변 분석을 위한 샘플 준비 과정에는 매트릭스 성분의 첨가가 포함되며, 이러한 제제는 그들의 자연 환경으로부터 세포 성분을 변화시킬 수 있다12. 따라서 샘플링 환경에 대한 진공이 필요하지 않은 주변 질량 분석법(MS) 기술은 거의 기본 환경에 있는 세포를 분석하는 데 활용됩니다. 진공 환경이 없는 경우 실험 설계에서 다재다능함이 가능합니다. 카메라는 셀룰러 공정을 모니터링하기 위해 추가 될 수 있으며 부드러운 이온화 기술은 각단일 세포 실험 4,12,13에서 더 나은 정보를 수신하기 위해 분리 기술과 결합 될 수있다 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
단일 프로브 SCMS 방법은 거의 네이티브 환경에서 살아있는 포유류 암 세포주를 분석하는 주변 기술이다21,43,44,45,46. 또한, 단일 프로브 장치는 다세포 스페로이드에서 세포외 분자의 분석및 조직의 MS 이미징을 포함한 다른 질량 분석 응용 분야에 사용되어 왔으며47,48,49 ,50,51,52. 그러나, 이 방법에는 기판상 세포 고정이 필요하기 때문에, 현탁액세포는 이 기술을 사용하여 직접 분석될 수 없다 3,53. 따라서, 단일 프로브 SCMS 시스템은 환자의 혈액 또는 다른 체액으로부터 분리된 비부착 세포주 또는 현탁액 세포와 같은 비부착 단일 세포를 시료화하기 위해 직접 사용될 수없었다(54) 이 작업에서, 통합 된 세포 조작 플랫폼 (ICMP)은 최소한의 샘플 준비와 온라인 라이브, 현탁액 세포를분석하는 단일 프로브 SCMS 기술과 결합 (도 1)46. ICMP는 세포 선택을 모니터링하는 반전 된 현미경, 유리 셀 선택 프로브, 개별 부동 세포를 캡처하는 마이크로 인젝터, 세포 온도를 유지하는 가열 플레이트, 공간 제어를위한 두 개의 세포 조작 시스템으로 구성됩니다. 유리 셀 선택 프로브와 단일 프로브, 그리고 셀 선택 프로브 팁에서 단일 프로브 팁으로의 세포 전달을 관찰하는 디지털 현미경의 움직임. 단일 프로브의 제작은 이전 간행물에서 자세히 설명되어 있으며 여기서21,48로다루지 않습니다. ICMP/단일 프로브 시스템은 고분해능 질량 분석기와 결합됩니다. 이 통합 된 설정은 매트릭스 분자에서 최소한의 효과와 복잡한 생물학적 샘플에서 확인 된 단일 세포의 샘플링을 할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

단세포 질량 분석법(SCMS)을 통해 개별 세포 수준에서 광범위한 세포 종을 감지하고 정확하게 분석할 수 있습니다. 마이크로 스케일 샘플링 및 이온화 장치인 단일 프로브는 주변 조건하에서 세포 성분에 대한 온라인, 신속한 SCMS 분석을 위한 질량 분석기와 결합될 수 있습니다. 이전에는 단일 프로브 SCMS 기술을 주로 기판에 고정된 세포를 측정하여 연구를 위한 세포 유형을 제한하는 데 사용되었습니다. 현재 연구에서, 단일 프로브 SCMS 기술은 세포 조작 시스템과 통합되어 있으며, 일반적으로 체외 수정에 사용된다. 이 통합 된 세포 조작 및 분석 플랫폼은 세포 선택 프로브를 사용하여 식별 된 개별 부동 세포를 캡처하고 마이크로 스케일 용해를위한 단일 프로브 팁으로 세포를 전송한 다음 즉각적인 질량 분석 분석을 수행합니다. 이 포획 및 전달 프로세스는 질량 분석 분석에서 매트릭스 분자의 도입을 최소화하면서 분석 전에 주변 용액에서 세포를 제거합니다. 이 통합 된 설정은 체액 샘플 (예 : 소변, 혈액, 타액 등)에 존재하는 표적 환자 분리 세포의 SCMS 분석을 가능하게하여 인간 의학 및 질병 생물학에 SCMS 분석을 잠재적으로 적용 할 수 있습니다.

첫째, 치료되지 않은 K562 세포는 실험 방법을 확립하는 데 사용된다. 일반적인 SCMS 실험에서, 질량 스펙트럼의 명백한 변화는 세포 전달, 세포 내용물의 검출 동안, 및 측정을 마친 후에 관찰될 수 있다(도S1). PC(34:4)(m/z 754.536), PC(36:4) 및 PC(m/z 88:5)(m/z 808.583)를 포함한 세 가지 일반적인 세포 지질 피크(포스파티딜콜린, PC)가 세포가 성공적으로 전송되고 전송되도록 모니터링됩니다. 내용이 감지됩니다(그림 S2)21,43,46,55,56. 지질 피크가 5초 이내에 보이지 않는 경우, 마이크로인젝터내의 미네랄 오일 수준은 세포 선택 프로브 팁에서 세포를 보유하는 흡입을 감소시키기 위해 변경된다; 미네랄 오일이 세포 선택 프로브에서 밀려나지않도록 주의를 기울여야 합니다. m/z 750-850의 질량 범위에서 많은 PC의 신원은 처리되지 않은 세포 용해 샘플에 MS/MS를 사용하여 확인된다(도 3, 도 서2, 표 1)46.
K562 세포는 또한 방법의 다양성을 확장하기 위해 다양한 약물 화합물로 치료를 받습니다. K562 세포는 각각 4시간 및 2시간 동안 1시간 및 OSW-1(100 nM, 1 μM)에 대해 젬시타빈(1 μM) 및 탁솔(1 μM)으로 배양된다. 세포는 그 때 세포외 내용물에서 약 화합물의 검출을 극소화하기 위하여 PBS로 세척됩니다. 셀룰러 내용물의 질량 스펙트럼에 대한 매트릭스(예를 들어, 이온에서 이온)의 기여도는 현저하게 상이한 이온 신호로 인해 데이터 빼기를 통해 제거될 수 있다(도서 S3). 세 가지 약물 화합물은 모두 ICMP/단일 프로브 MS 설정(도S4)46을사용하여 검출된다. 이러한 결과는 이 방법을 세포내 지질, 약물 및 거의 네이티브 환경에서 용액의 세포에서 단일 세포 수준에서 대사 산물을 연구하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> 그림 1. 단일 현탁액 세포 MS 실험을 위한 실험 설정. (a) 질량 분석기와 결합된 통합 전지 조작 플랫폼(ICMP). (B) 부유 세포의 분석을위한 회로도. (C) 셀 선택 프로브를 사용하여 선택되는 K562 셀의 실험보기. Standke 등의 허가를 받아 전재된46. 저작권 2019 미국 화학 협회. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> 그림 2. 단일 현탁액 세포 MS 실험에 활용된 변형된 단일 프로브 및 셀 선택 프로브의 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> 그림 3. 대표적인종(m/z 750-850)을 나타내는 단일 세포로부터 의 질량스펙트럼을 확대하였다. 화학 구조는 MS/MS 분석을사용하여 확인됩니다(그림 S1). Standke 외46의허가를 받아 재인쇄 . 저작권 2019 미국 화학 협회. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
약물 분자*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>질량 오류(ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>【 젬시타빈 + H 】 +
</td>
			<td>264.076</td>
			<td>11.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>[탁솔 + 나] +
</td>
			<td>876.318</td>
			<td>2.74</td>
		</tr>
<tr>
<td>【OSW-1+Na】 +
</td>
			<td>895.445</td>
			<td>0.89</td>
		</tr>
<tr>
<td>세포 지질</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:4) + H] +
</td>
			<td>754.535</td>
			<td>3.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:3) + H] +
</td>
			<td>756.551</td>
			<td>3.44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:2) + H] +
</td>
			<td>758.569</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:5) + H] +
</td>
			<td>780.551</td>
			<td>3.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:4) + H] +
</td>
			<td>782.568</td>
			<td>2.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:3) + H] +
</td>
			<td>784.585</td>
			<td>0.64</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:7) + H] +
</td>
			<td>804.551</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:6) + H] +
</td>
			<td>806.567</td>
			<td>2.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:5) + H] +
</td>
			<td>808.583</td>
			<td>2.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:4) + H] +
</td>
			<td>810.601</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(40:7) + H] +
</td>
			<td>832.583</td>
			<td>3.12</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. ICMP/단일 프로브 설정을 사용하여 식별된 셀룰러 구성 요소. 모든 약물 화합물의 검출은 MS/MS 결과를 표준 화합물과 비교하여 확인되었다.

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Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

통합 셀 조작 플랫폼은 주변 조건하에서 개별 현탁액 셀의 온라인 분석을 위한 단일 프로브 질량 분석 설정과 함께 사용하기 위해 개발되었습니다.

단일 현탁액 세포에서 약물 및 대사 산물의 질량 분석 분석을 위한 단일 프로브와 결합된 통합 셀 조작 플랫폼

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

이 방법은 용액에서 세포를 분석하기 때문에 가까운 네이티브 환경에서 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에는 환자 유래 세포 샘플의 분석이 포함됩니다. 이 기술은 세포의 거의 또는 전혀 샘플 준비를 필요로한다.따라서, 우리는 우리가 세포 이질성을 탐구할 수 있는 주변 조건하에서 온라인으로 개별 세포를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 환자 견본에서 직접 분리된 세포의 다른 모형을 분석할 수 있기 때문에, 다양한 다른 질병 상태에서 액체 생검을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 날카로운 팁테이퍼 프로브로 단일 보어 유리 튜브를 변환하려면 먼저 단일 보어 유리 튜브를 수직 파이펫 홀더의 클램프에 넣고 가열 코일에 대한 유리를 중심으로 튜브를 제자리에 고정시합니다.가열 코일은 금속 막대 2.5 배 주위에 코일 18 게이지 니켈 크롬 저항 와이어로 구성되어 있습니다. 온도 프로그램 19.5와 유리 튜브를 설정합니다. 솔레노이드 플런저를 4개에서 설정합니다.유리 튜브를 당기기 위해 솔레노이드를 트리거합니다. 이 단계는 끝에 융합된 두 개의 프로브를 만듭니다. 스웨터를 사용하여 각 프로브의 끝에서 약 1mm 떨어진 곳에서 절단하여 프로브 팁에서 직경 약 10미크론의 오리피스를 만듭니다.ICMP에 쉽게 결합할 수 있도록 유리 프로브를 구부리려면 단일 프로브 SCMS가 설정됩니다. 먼저 뽑아낸 유리 프로브를 마이크로포지에 넣습니다. 상단을 백금 가열 와이어 위에 약 3밀리미터 높이 배치합니다.그런 다음 백금 와이어의 열을 최대 온도의 30 %로 켭니다. 프로브를 원래 위치에서 약 45도 구부립니다. 거꾸로 된 현미경 현미경 마이크로 인젝터를 전동 테이블에 두 개의 세포 조작 시스템에 배치하여 질량 분광계와 쉽게 결합할 수 있습니다.유리 세포 선택 장치를 설정하려면 긴 슬라이드를 모세관 홀더에 넣고 나사를 조이서 마이크로인젝터의 금속 홀더 내부에 유리 셀 선택 프로브를 삽입하여 프로브를 제자리에 고정시하십시오. 가열된 플레이트에 평행하게 기울어진 프로브 팁을 배치합니다. 마이크로 인젝터의 금속 홀더를 세포 조작 시스템에 고정합니다.그런 다음 프로브 팁을 반전 된 현미경 광의 중간 근처에 배치합니다. 단일 프로브를 포함하는 유리 슬라이드를 셀 조작 시스템의 암 클램프에 고정합니다. 모세관을 전도성 조합에 연결하는 용매를 플라스틱 페룰의 슬리브에 넣고 손가락이 피팅을 조이도록 하여 전도성 조합에 연결합니다.모세관을 슬리브에 배치하고 피팅을 조여 샘플링 용매를 포함하는 주사기에 연결된 모세관에 전도성 조합의 다른 면을 연결합니다. 이러한 실험에서 샘플링 용매로 0.1%의 포믹산을 가진 아세토나이트를 사용한다. 질량 분광계의 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다.나노 전기 분무 이온화 또는 나노 ESI 방출기 약 1 밀리미터확장 이온 전달 튜브의 오리피스에 배치. 세포 조작 시스템을 사용하여 단일 프로브의 간격 이동을 제어하고 나노 ESI 방출기를 확장 된 이온 전달 튜브 앞에 중앙으로 배치합니다. 세포 배양에서 세포가 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 플라스크를 피펫합니다.셀을 섭씨 37도에서 섭씨 37도에서 400회 G로 5분간 회전하고 상체를 폐기합니다. 원하는 치료 농도에서 약물 화합물을 함유하는 RPMI 배지의 4밀리리터에서 세포를 재연한다. 질량 분광계에 대한 실험 매개 변수를 사용자 정의합니다.계측기 소프트웨어의 스캔 모드 제목 아래에서 검사를 정의합니다. Z 400 이상의 M에서 60, 000의 해상도, 1개의 현미경 100밀리초 최대 주입 시간 및 자동 게인 제어를 사용합니다. 주사기 펌프에서 분당 150 나노리터의 유량을 선택합니다.NSI 소스를 선택하고 약 4.5 킬로볼트의 전압을 적용합니다. 위플레이트와 하단 렌즈 모두에 대해 선택된 배율의 40배배에서 반전 된 현미경을 켭니다. 라이브 비디오 피드를 캡처하려면 랩톱의 USB 포트에 연결합니다.가열 된 접시를 켜고 섭씨 37도로 설정합니다. 컴퓨터에서 수집 된 데이터 탭으로 이동하여 획득 된 시간 에서 계속 선택하십시오. 분석을 위해 샘플을 준비하기 위해 샘플 의 2 ~3 개를 작은 페트리 접시 뚜껑에 넣습니다.가열 된 플레이트 위에 반전 된 현미경에서 빛의 중심에 샘플을 배치합니다. 분석을 위해 유리 셀 선택 프로브를 준비합니다. 그 상단이 세포와 같은 평면의 반전 된 마이크로 소프 아래에 초점을 맞출 수 있도록 세포 조작 시스템을 사용하여 프로브를 이동합니다.셀 조작 시스템을 사용하여 셀 선택 프로브 팁을 분석을 위한 표적 셀로 이동합니다. 이 과정은 반전 된 현미경을 사용하여 모니터링됩니다. 마이크로인젝터의 손잡이를 부드럽게 돌려 튜브 내부의 미네랄 오일위치를 조정합니다.미세 인젝터에서 미세 주입기에서 세포 선택 프로브 팁에 표적 셀을 고정하기 위해 부드러운 흡입이 제공됩니다. 셀 조작 시스템을 사용하여 단일 프로브 팁에 초점을 맞춘 디지털 현미경을 사용하여 셀 선택 프로브 팁에서 셀을 단일 프로브 팁으로 이동하여 이 과정을 모니터링합니다. 처리되지 않은 K-562 세포는 실험 방법을 확립하는 데 사용된다.일반적인 SCMS 실험에서, 질량 스펙트럼의 명백한 변화는 세포 내용물의 검출 도중 및 측정을 완료한 후에 세포를 전송에서 관찰될 수 있습니다. PC 34:4, PC 36:4 및 PC 38:5를 포함한 3개의 일반적인 세포 지질 피크가 모니터링되어 셀이 성공적으로 전송되고 셀룰러 내용이 검출되도록 합니다. 750 ~ 850의 질량 범위에서 많은 PC의 ID는 처리되지 않은 세포 용해 시료에 MSMS를 사용하여 확인된다.ICMP 단일 프로브 MS 를 사용하여 젬시타빈, 탁솔 및 OSW1은 K-562 셀을 이용한 배양 후 검출되었다. 이러한 결과는 이 방법이 가까운 네이티브 환경에서 용액의 세포로부터 단일 세포 수준에서 세포 내 지질, 약물 및 대사산물을 연구하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 진공 흡입을 적절하게 적용할 수 있도록 유리 셀 선택 프로브를 범용 파이펫 홀더에 단단히 배치해야 합니다.이 방법은 또한 우리가 이 질병 상태의 더 나은 이해를 얻을 수 있는 세포 형체 사이 다름을 구별하기 위하여 환자 파생한 견본에 적용될 수 있습니다. 이 방법을 개발 한 후, 우리는 잠재적으로 단일 세포 수준에서 약물 화합물의 정량화를 구현할 수 있습니다. 세포와 함께 작업 할 때, 실험실 코트와 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 가지고하는 것이 중요합니다.유리로 작업할 때 추가 적인 눈 마모를 사용할 수 있습니다.

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