Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Forfatterne takker Naga Rama Kothapalli for sitt arbeid i å utvikle prøve forberedelser for både suspensjon celler og celle lysat eksperimenter. I tillegg forfatterne takker NIH (R01GM116116 og R21CA204706) for finansiering.

1. glass celle-valg sonde fabrikasjon
<ol><li>Konverter enkelt-bar glass slange inn i en konisk sonde med et skarpt tips.<ol>
<li>Plasser en single-bar glass Tube (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) inn i klemmene på en vertikal pipette holder, sentrering glasset med hensyn til varme spolen og stram for å feste røret på plass. Varme spolen består av en 18-gauge nikkel-krom motstand wire (~ 60 mm i lengde) spiral rundt en metallstang (diameter = 3,90 mm) 2,5 ganger.</li>
		<li>Still inn glass slangen med temperatur program 19,5 (produsentens enhet). Denne parameteren kan endres for et bestemt instrument.</li>
		<li>Sett magnet stempelet på 4 (produsentens enhet). Denne parameteren kan endres for et bestemt instrument.</li>
		<li>Utløs magneten for å trekke glass slangen. Dette trinnet skaper to sonder smeltet på spissen.</li>
		<li>Bruk pinsett til å kutte ~ 1 mm bort fra spissen av hver sonde, og skaper et munnstykke på ~ 10 μm i diameter ved sonde spissen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bøy glass sonden for enkel kobling til ICMP/single-probe SCMS-oppsettet.<ol>
<li>Sett en trukket glass sonde inn i microforge, posisjonering spissen ~ 3 mm over platina varme wire.</li>
		<li>Snu varmen på platina wire til 30% av maksimal temperatur.</li>
		<li>Bøy proben ~ 45 ° fra den opprinnelige posisjonen (figur 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. integrert celle manipulasjon plattform montering
<ol><li>Plasser invertert mikroskop, microinjector, og to celle manipulasjon systemer på en motorisert bord for enkel kopling med massen spektrometer.<ol>
<li>Endre en av celle manipulasjon systemer for å imøtekomme en enkelt-sonde ved å erstatte enden med en arm klemme.</li>
		<li>Bruk en plastsprøyte med en nål for å fylle microinjector med mineralolje. Unngå bobler i slangen da dette vil påvirke utsuging.</li>
		<li>Sett på etappe innsatsen til det omvendte mikroskopet med den oppvarmede platen. Sett den oppvarmede platen ved 37 ° c før analysen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sett opp glasscelle-valg enhet.<ol>
<li>Sett inn glasscelle valgs sonden inne i metall holde ren på microinjector ved å plassere den lange (ikke-bøyde) siden inn i kapillær holde ren og stramme skruen for å feste proben på plass. Plasser sonde spissen parallelt med den oppvarmede platen. FORSIKTIG: glasset sonden er veldig skarp og skjør, og det bryter lett. Beskytt øynene dine og vær ekstra forsiktige mens du setter sonden inn i microinjector.</li>
		<li>Fest metall holde ren til microinjector i celle manipulasjon systemet. Plasser sonde spissen nær midten av lyset til det omvendte mikroskopet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Opprett et utvidet ion overførings rør for masse spektrometer innløp
<ol><li>Bruk en metall kutter til å skjære et stykke rustfritt stål rør (OD: 0,0625 (1/16) i, ID: 0,021 i) ~ 250 mm i lengde.</li>
	<li>Mål 135 mm fra slutten og plassere en metall feral så ~ 135 mm vil bli utsatt for atmosfæren og ~ 115 mm vil være inne i massen spektrometer. Sikre det feral benytter to skiftenøkler å stramme den.</li>
</ol>4. par ICMP med et oppsett med én sonde
<ol><li>Fest glass skyve ren som inneholder enkelt sonden inn i arm klemmen til celle manipulering systemet. Merk: single-sonder er fabrikkert i henhold til en tidligere publisert protokoll48 med to mindre endringer i den aktuelle studien: nano-ESI emitter er gjort lenger for enkel kopling til massen spektrometer, og enkelt-sonder er limt til glasset side på høyre side for å unngå å forstyrre den romlige bevegelsen av glasscelle valgs enheten (figur 2).</li>
	<li>Koble løsningsmidlet-gi kapillær til en ledende Union ved å plassere kapillær inn i ermet (1/16 x .005 i) av plast dobbsko og finger-stramme montering.<ol>
<li>Koble den andre siden av ledende Union til en kapillær (ID: 40 μm, OD: 150 μm), som er koblet til en sprøyte som inneholder prøvetaking løsemiddel, ved å plassere kapillær inn i ermet (1/32 x .007 i) og stramme beslaget. Bruk acetonitril med 0,1% maursyre syre som sampling løsemiddel i disse eksperimentene. Merk: prøve løsningsmiddelet er fleksibelt, men det bør primært inneholde acetonitril (eller acetonitril med maursyre syre for bedre ionisering) for en hurtig Mikroskala cellelyse.</li>
		<li>Fest sprøyten i sprøyte pumpen på masse spektrometer.</li>
		<li>Plasser den ionisering spennings ledningen på en kobbertråd som er festet til den ledende unionen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasser nano-ESI emitter ~ 1 mm til åpningen av den utvidede ion overføring tube.<ol>
<li>Bruk celle manipulasjon system for å kontrollere den romlige bevegelser av single-sonde og plassere nano-ESI emitter sentralt foran den utvidede ion overføre slangen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. forberedelse av suspendert celleprøve
<ol><li>Dagen før analyse (~ 18-24 h), frø ut celler for testing i en cellekultur kolbe (T25). K562 humant myelogen leukemi celler brukes som modeller i denne studien.<ol>
<li>Heat 1x fosfat bufret saltvann (PBS) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplert med 10% syntetisk fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin-Streptomycin ved 37 ° c i 30 min.</li>
		<li>Seed ~ 1 x 106 celler i et total volum på 10 ml ved å kombinere celler med varmt medium. Generelt, bruk en 10-mL pipette å plassere 8 mL RPMI medium inn i en cellekultur kolbe. Deretter bruker en 2 mL pipette å sette 2 mL confluent K562 celler mediet for ~ 1 x 106 celler.</li>
		<li>Ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2 til analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør celler for analyse.<ol>
<li>Pipetter celler fra celle kulturen kolbe inn i en 15-mL sentrifugerør.</li>
		<li>Snurr celler ned ved 400 x g og 37 ° c i 5 minutter og kast supernatanten.</li>
		<li>Resuspend celler i 4 mL RPMI medium inneholder stoffet sammensatte ved ønsket behandling konsentrasjon. Merk: for analyse av kontroll celler, resuspend cellene i 4 mL RPMI medium og hoppe til trinn 6.</li>
		<li>Ruge cellene så lenge behandlingstiden er på 37 ° c og 5% CO2.</li>
		<li>Snurr celler ned ved 400 x g og 37 ° c i 5 min. aspirer supernatanten.</li>
		<li>Cellene er resuspendert i 10 mL PBS, og sentrifuger ved 400 x g og 37 ° c i 5 min. Etter spinning, kast supernatanten. Gjenta dette trinnet 3 ganger for å minimere påvisning av stoffet fra ekstracellulære bestanddeler.</li>
		<li>Resuspend celler i 4 mL PBS for analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Utfør SCMS målinger ved hjelp av oppsettet ICMP/single-probe
<ol><li>Tilpass parametere for masse spektrometer for eksperimentet.<ol>
<li>Under skannemodus -overskriften til instrument programvaren velger du Definer Skann. Bruk en oppløsning på 60 000 m/∆ m ved m/z 400, 1 microscan, 100 MS maksimal injeksjons tid og automatisk forsterkningskontroll (AGC) på. En masse rekkevidde (m/z) av 100-1000 ble benyttet for eksperimentene. Parametere kan endres basert på instrument modellen.</li>
		<li>Under sprøyte pumpevelger du en strømningshastighet på 150 nl/min. strømningshastighet må optimaliseres for hvert eksperiment.</li>
		<li>Velg NSI-kilde og Påfør en spenning på ~ 4,5 kv. Denne parameteren må også optimaliseres for hvert eksperiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skru på det omvendte mikroskop (med 40x forstørrelsen valgt for begge to overdelen plate og bunnen linsen) og forbinde den å det USB-havn av en bærbar PC å fange bo-video forer. Slå på den oppvarmede platen og sett den til 37 ° c.</li>
	<li>Gå til Hent data -fanen på datamaskinen, og velg kontinuerlig under innhenting av tid.</li>
	<li>Forbered prøve for analyse.<ol>
<li>Pipetter 2-3 mL av prøven inn i lokket på en liten Petri-tallerken (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 plasser prøven i midten av lyset fra det omvendte mikroskopet på toppen av den oppvarmede platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klargjør glasscelle-valg sonde for analyse. Bruk celle manipulasjon systemet til å flytte sonden slik at spissen er fokusert under invertert mikroskop i samme plan som cellene.</li>
	<li>Velg en enkelt celle for analyse.<ol>
<li>Bruk celle manipulasjon systemet til å flytte Cellevalg sonde spissen til en målrettet celle. Denne prosessen overvåkes med det omvendte mikroskopet. Merk: Hvis spissen av celle valgs proben ikke kan fokusere på samme plan som cellene, er det mulig at den bøyde delen av proben ikke er riktig vinklet. Juster posisjonen til celle valgs sonden til begge sonde kan fokuseres sammen med celler under mikroskopet.</li>
		<li>Drei forsiktig håndtaket på microinjector for å justere plasseringen av mineral oljen inne i slangen. En mild sug er gitt av microinjector for å sikre den målrettede cellen til celle-valg sonde spissen. Merk: Hvis cellen ikke kan fanges opp av celle valgs proben gjennom sugekraften, må du kontrollere celle valgs proben for å sikre at den er satt helt inn i kapillær holde ren. I tillegg inspisere mineralolje nivåer i microinjector og rør, og utvise luft hvis det er noen.</li>
		<li>Bruk celle manipulasjon systemet til å flytte cellen på celle-valg sonde spissen til Single-sonde spissen, ved hjelp av et digitalt mikroskop fokusert på single-sonde spissen for å overvåke denne prosessen. Når du berører, en liten acetonitril dråpe på single-sonde spissen induserer en rask analyser av cellen, og deretter celle lysat er umiddelbart ionisert for on-line MS analyse. Merk: fordi den valgte cellen er festet til den celle-valg sonde spissen gjennom en mild sug, kan denne cellen være potensielt løsrevet under overføring til Single-sonde spissen. Derfor, hvis ion signaler av typiske cellulære lipider (se representative resultater nedenfor) ikke er observert innen 5 s, er det mulig at cellen ble fristilt, og valget av en annen celle er nødvendig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Den integrerte celle manipulasjon og analyseplattform er konstruert for å utvide allsidigheten til Single-sonde MS metoden, slik at for on-line, rask analyse av ikke-tilhenger celler i en nær-native miljø. En stor fordel med teknikken er at minimal prøve forberedelser er nødvendig, slik at cellene blir analysert i forhold som etterligner deres standard tilstand. Spesielt kan enkelte celler av interesse være visuelt identifisert og valgt, minimere påvirkning av matrise effekt på MS ionisering effektivitet og samtidig opprettholde celler i deres naturlige miljø, slik at resultatene er mer representative celler innfødte status (figur S3). Denne teknikken kan potensielt brukes til å studere pasient celler suspendert i biofluids i fremtidige studier. En annen fordel med denne teknikken er det fleksible utvalget av prøvetaking løsemiddel. Det er viktig å inkludere acetonitril som den viktigste prøvetaking løsemiddel slik at Mikroskala lyse kan forekomme raskt. Potensielt, interne standarder (f. eks, isotopically-merket legemiddel forbindelser) kan tilsettes i prøvetaking løsemiddel for kvantifisering av molekyler av interesse (f. eks, legemiddel molekyler) fra individuelle celler, inkludert de kan spille en nøkkelrolle i revolusjonerer tilpasse narkotika behandlinger i fremtiden54.
Selv om dette integrerte systemet kan enkelt brukes til å analysere brede celleområder, er en begrensning av metoden at verken enkelt sonde eller celle utvalgs sonde er kommersielt tilgjengelig; dikterer behovet for optimalisering av mange parametre (f. eks, strømningshastighet, spenning, lengde mellom nano-ESI emitter og Ion overføring rør, etc.) før hvert eksperiment. På grunn av smallness av enkelt sonde og celle utvalgs sonde, kan miljø forstyrrelsene (f.eks. luftstrøm) føre til vanskeligheter med å etablere et knutepunkt mellom de to sonder. En kortsiktig løsning er bøying av Cellevalg sonden nær slutten for å minimere lengden av en gang. Fremtidig arbeid omfatter utvikling av en bolig for å sette de kritiske delene av oppsettet for å minimere miljøeffekter. På grunn av den begrensede mengden av mobil innhold og kort oppkjøps tid (~ 2-3 s) fra en celle, MS/MS analyse kan bare gjennomføres for relativt rikelig arter. Andre faktorer som påvirker deteksjons følsomheten inkluderer undertrykt ionisering effektivitet på grunn av innføringen av matrisen sammen med cellen og potensielle ion tap gjennom den utvidede ion overførings slangen.

Human biologi, spesielt sykdoms biologi, er i økende grad forstått å være et resultat av aktiviteter på nivået av individuelle celler, men de tradisjonelle analytiske metoder, som for eksempel flytende kromatografi masse massespektrometri (LCMS), er vanligvis brukt til å analysere prøver fremstilt fra populasjoner av celler, mens ervervet molekylær informasjon ikke kan nøyaktig representere de kjemiske prosessene på det enkelte cellenivå. Disse standard, tradisjonelle metoder er ikke i stand til å skjelne effekten av cellulære heterogenitet på en analytisk måling, og prosessen med å ødelegge og blande cellene for å forberede lysat potensielt fører til endring eller tap av mobilnettet komponenter1,2. Disse begrensningene av tradisjonelle metoder er spesielt viktig i analysen av pasient celler, der de oppnådde prøvene kan inneholde en kompleks blanding av mange forskjellige celletyper. For å overkomme disse manglene, enkelt celle molekylær analysemetoder, inkludert single Cell Mass massespektrometri (SCMS) metoder, er i økende grad utvikles og brukes på bioanalysis, spesielt av cellulære metabolitter og lav molekylvekt biomolekyler3,4.
Den første SCMS teknikker utviklet brukt vakuum-baserte teknikker for å utføre analysene under ikke-ambient forhold2,5,6,7,8,9, 10,11. Ikke-ambient SCMS teknikker er i stand til å analysere cellulære lipider og metabolitter, men krever prøve forbehandling under kunstige forhold, og derfor er ikke egnet for sanntids analyse. Prøven forberedelse prosessen for ikke-ambient analyse omfatter tillegg av matrisen komponenter, og dette preparatet kan endre cellulære komponenter fra sitt naturlige miljø12. Derfor benyttes ambient Mass massespektrometri (MS) teknikker, som ikke krever et vakuum for prøvetaking miljøet, for å analysere celler i en nær-native miljø. Ikke å ha et vakuum miljø gir allsidighet i eksperimentell design; kameraer kan legges til å overvåke cellulære prosessen og mykere ionisering teknikker kan kombineres med separasjon teknikker for å få bedre informasjon fra hver enkelt-celle eksperiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37, 38, 39,40 ,41,42.
Single-probe SCMS metoden er en ambient teknikk som analyserer Live, pattedyr kreftcelle linjer i en nær-native Environment21,43,44,45,46. I tillegg har single-probe enheten blitt brukt til andre masse massespektrometri applikasjoner, inkludert analyse av ekstracellulære molekyler i flercellede spheroids og MS Imaging av vev47,48,49 ,50,51,52. Men siden celle immobilisering på underlag er nødvendig for denne metoden, kan suspensjon celler ikke analyseres direkte ved hjelp av denne teknikken3,53. Derfor kunne SCMS-systemet med én sonde ikke brukes direkte til å prøve ikke-tilhenger enkeltceller, for eksempel ikke-tilhenger cellelinjer eller opphengs celler isolert fra pasientens blod eller andre kroppsvæsker54. I dette arbeidet, en integrert celle manipulasjon plattform (ICMP) er kombinert med single-sonde SCMS teknikk for å analysere Live, suspensjon celler på linje med minimal prøveforberedelse (figur 1)46. ICMP består av en invertert mikroskop for å overvåke celleutvalg, en glasscelle-utvalg sonde, en microinjector å fange individuelle flytende celler, en oppvarmet plate for å opprettholde celle temperatur, to celle manipulasjon systemer for å kontrollere romlig bevegelser av både glasscelle-utvelgelses sonde og Single-sonde, og et digitalt mikroskop for å observere celle overføring fra celle-valg sonde spissen til Single-sonde spissen. Den fabrikasjon av single-sonde er beskrevet i tidligere publikasjoner og vil ikke bli behandlet her21,48. ICMP/single-probe systemet er koplet til en høy oppløsning masse spektrometer. Dette integrerte oppsettet gjør det mulig å prøve ut identifiserte enkeltceller fra komplekse biologiske prøver med minimale effekter fra matrise molekyler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

Enkelt cellemasse massespektrometri (SCMS) muliggjør sensitiv deteksjon og nøyaktig analyse av bredt spekter av cellulære arter på den enkelte cellenivå. Den single-sonde, en Mikroskala prøvetaking og ionisering enhet, kan kombineres med en masse spektrometer for on-line, rask SCMS analyse av cellulære bestanddeler under omgivelsesforhold. Tidligere var den single-probe SCMS teknikken primært brukes til å måleceller immobilisert på et substrat, noe som begrenser hvilke typer celler for studier. I den nåværende studien, den single-sonde SCMS-teknologi har blitt integrert med en celle manipulasjon system, vanligvis brukes for in vitro befruktning. Denne integrerte celle manipulasjon og analyse plattformen bruker en celle-valg sonde å fange identifiserte individuelle flytende celler og overføre celler til Single-sonde spissen for Mikroskala lyse, etterfulgt av umiddelbar masse massespektrometri analyse. Denne fangst og overføre prosessen fjerner celler fra den omkringliggende løsning før analyse, minimere innføringen av matrise molekyler i massen massespektrometri analyse. Dette integrerte oppsettet er i stand til SCMS analyse av målrettede pasient-isolerte celler til stede i kroppsvæsker prøver (f. eks, urin, blod, spytt, etc.), noe som åpner for potensielle anvendelser av SCMS analyse til Human medisin og sykdoms biologi.

Først, ubehandlet K562 celler brukes til å etablere den eksperimentelle metoden. I et typisk SCMS eksperiment, kan åpenbare endringer av masse Spectra observeres fra å overføre en celle, under påvisning av mobil innhold, og etter å ha fullført målingen (figur S1). Tre vanlige cellulære lipid topper (phosphatidylcholine, PC), inkludert PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), og PC (38:5) (m/z 808,583), overvåkes for å sikre at cellen er overført og mobilnettet innholdet oppdages (figur S2)21,43,46,55,56. Hvis lipid topper ikke ses innen 5 s, er mineralolje nivået i microinjector endret for å redusere sug holde cellen på celle-valg sonde spissen; forsiktighet må utvises slik at ingen mineralolje skyves ut fra celle valgs proben. Identiteten til mange PC-er i massen utvalg av m/z 750-850 er bekreftet ved hjelp av MS/MS på ubehandlet celle lysat prøver(figur 3, figur S2, tabell 1)46.
K562 celler er også utsatt for behandling med ulike medikament forbindelser for å utvide allsidigheten til metoden. K562-celler inkubert med gemcitabin (1 μM) og taxol (1 μM) for 1 t og OSW-1 (100 nM, 1 μM) for henholdsvis 4 t og 2 t. Celler blir deretter vasket med PBS å minimere påvisning av narkotika forbindelser fra ekstracellulære innhold. Bidraget av matrise (f. eks, ioner fra cellekultur medium, PBS, og løsemiddel) til massen Spectra av cellulære innholdet kan elimineres gjennom data subtraksjon, på grunn av deres signifikant forskjellige ion-signaler (figur S3). Alle tre legemiddel forbindelsene oppdages ved hjelp av ICMP/single-probe MS Setup (figur S4)46. Disse resultatene tyder på denne metoden kan brukes til å studere intracellulære lipider, narkotika og metabolitter på enkelt cellenivå fra celler i løsningen i en nær-native miljø.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> Figur 1. Eksperimentell oppsett for enkelt suspensjon celle MS eksperimenter. (A) integrert celle manipulasjon plattform (ICMP) kombinert med en masse spektrometer. (B) skjematisk for analyse av suspenderte celler. (C) eksperimentell visning av K562 celler skal velges ved hjelp av celle-valg sonde. Gjengitt med tillatelse fra Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> Figur 2. Bilder av en modifisert single-sonde og en celle-utvalg sonde benyttes for enkelt suspensjon celle MS eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> Figur 3. Zoomet-i massen spektrum fra en enkelt celle som viser representative arter (m/z 750-850). Kjemiske strukturer bekreftes ved hjelp av MS/MS analyse (figur S1). Gjengitt med tillatelse fra Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Drug molekyl*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Masse feil (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabin + H] +
</td>
			<td>264,076 for alle</td>
			<td>11,32 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol + na] +
</td>
			<td>876,318 for alle</td>
			<td>2,74 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 + na] +
</td>
			<td>895,445 for alle</td>
			<td>0,89 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellulære lipider</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:4) + H] +
</td>
			<td>754,535 for alle</td>
			<td>3,71 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:3) + H] +
</td>
			<td>756,551 for alle</td>
			<td>3,44 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:2) + H] +
</td>
			<td>758,569 for alle</td>
			<td>0,66 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:5) + H] +
</td>
			<td>780,551 for alle</td>
			<td>3,07 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:4) + H] +
</td>
			<td>782,568 for alle</td>
			<td>2,17 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:3) + H] +
</td>
			<td>784,585 for alle</td>
			<td>0,64 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:7) + H] +
</td>
			<td>804,551 for alle</td>
			<td>4,1 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:6) + H] +
</td>
			<td>806,567 for alle</td>
			<td>2,48 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:5) + H] +
</td>
			<td>808,583 for alle</td>
			<td>2,72 for alle</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:4) + H] +
</td>
			<td>810,601 for alle</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (40:7) + H] +
</td>
			<td>832,583 for alle</td>
			<td>3,12 for alle</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Identifiserte cellulære komponenter ved hjelp av oppsettet ICMP/single-probe. Påvisning av alle narkotika forbindelser ble bekreftet ved å sammenligne MS/MS resultater med standard sammensatte.

Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

En integrert celle manipulasjon plattform er utviklet for bruk i forbindelse med en enkelt-sonde masse massespektrometri oppsett for on-line analyse av individuelle suspensjon celler under ambient forhold.

Integrert Cell manipulasjon Platform sammen med single-probe for Mass massespektrometri analyse av narkotika og metabolitter i single suspensjon celler

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Siden denne metoden analyserer celler fra løsning, kan den brukes til å studere celler i et nær innfødt miljø. Dette inkluderer analyse av pasientavledede celleprøver. Denne teknikken krever lite eller ingen prøveforberedelse av celler.Derfor kan vi analysere individuelle celler online under omgivelsesforhold, noe som gjør at vi kan utforske cellulær heterogenitet. Denne teknikken kan brukes til å studere flytende biopsier fra en rekke forskjellige sykdomstilstander, siden den kan analysere forskjellige typer celler direkte isolert fra pasientprøver. For å konvertere enkeltbar glassrør til en konisk sonde med en skarp spiss, først plassere en enkelt bar glassrør i klemmene på en vertikal pipette holder, sentrere glasset med hensyn til varmespolen og stram for å feste røret på plass.Varmespolen består av en 18 gauge nikkel krom motstand wire kveilet rundt en metallstang 2,5 ganger. Still inn glassslangen med temperaturprogram 19.5. Sett magnetstempelet på fire.Avtrekk magneten for å trekke i glassslangen. Dette trinnet skaper to sonder smeltet sammen på spissen. Bruk gensere til å kutte omtrent en millimeter fra spissen av hver sonde, og lag en åpning på ca. 10 mikron i diameter på probespissen.For å bøye glasssonden for enkel kobling til ICMP, enkelt sonde SCMS satt opp. Sett først en trukket glasssonde inn i mikroforge. Plasser toppen omtrent tre millimeter over platinavarmeledningen.Deretter slår du varmen på platinaledningen til 30% av maksimumstemperaturen. Bøy sonden ca. 45 grader fra den opprinnelige posisjonen. Plasser den inverterte mikroskopmikroinjektoren i to cellemanipuleringssystemer på et motorisert bord for enkel kobling med massespektrometeret.For å sette opp glasscellevalgenheten setter du inn glasscellevalgsonden inne i metallholderen på mikroinjektoren ved å plassere det lange lysbildet i kapillærholderen og stramme skruen for å feste sonden på plass. Plasser probespissene vinklet parallelt med den oppvarmede platen. Fest metallholderen på mikroinjektoren inn i cellemanipuleringssystemet.Plasser deretter probespissen nær midten av det inverterte mikroskoplyset. Fest glasssklien som inneholder den enkle sonden inn i armklemmen til cellemanipuleringssystemet. Koble oppløsningsvæsken som gir kapillær til en ledende union ved å plassere kapillæren i hylsen på plastbjørken og fingeren som strammer armaturen.Koble den andre siden av konduktiv ledning til en kapillær som er koblet til en sprøyte som inneholder prøvetakingsløsemidlet ved å plassere kapillæren i hylsen og stramme til armaturen. Bruk acetonitril med 0,1% maursyre som prøvetakingsvæske i disse eksperimentene. Fest sprøyten inn i sprøytepumpen på massespektrometeret.Plasser nanoelektrosprayioniseringen eller nano ESI-emitteren omtrent én millimeter til åpningen av det utvidede igreringsrøret. Bruk cellemanipuleringssystemet til å kontrollere de spacial bevegelsene til enkeltsonden og plassere nano ESI-emitteren sentralt foran de utvidede iionoverføringsslangene. Pipette cellene fra cellekulturkolben til et 15 milliliter sentrifugerør.Spinn cellene ved 400 ganger G i 37 grader Celsius i fem minutter og kast supernatanten. Resuspend cellene i fire milliliter av RPMI medium som inneholder stoffet sammensatte ved ønsket behandling konsentrasjon. Tilpass eksperimentelle parametere for massespektrometeret.Velg definer skanning under overskriften for skannemodus for instrumentprogramvaren. Bruk en oppløsning på 60 000 ved M over Z 400, én mikroskanse 100 millisekund maksimal injeksjonstid og automatisk forsterkningskontroll på. Under sprøytepumpe velger du strømningshastigheten på 150 nanoliter per minutt.Velg NSI-kilde og bruk en spenning på ca. 4,5 kilovolt. Slå på det inverterte mikroskopet ved 40 ganger forstørrelse valgt for både toppplaten og bunnlinsen. Koble den til USB-porten på en bærbar DATAMASKIN for å ta opp direktesendte videofeeder.Slå på den oppvarmede platen og sett den til 37 grader Celsius. Gå til kategorien Hent data på datamaskinen, og velg kontinuerlig under innhentet tid. For å forberede prøven for analyse, pipette to til tre av prøven i lokket på en liten petriskål.Plasser prøven i midten av lyset fra det inverterte mikroskopet på toppen av den oppvarmede platen. Forbered glasscelleutvelgelssonden for analyse. Bruk cellemanipuleringssystemet til å flytte sonden slik at toppen er fokusert under den inverterte mikrocsopen i samme plan som cellene.Bruk cellemanipuleringssystemet til å flytte cellevalgsondespissen til en målrettet celle for analyse. Denne prosessen overvåkes ved hjelp av det inverterte mikroskopet. Vri forsiktig håndtaket på mikroinjektoren for å justere plasseringen av mineraloljen inne i slangen.En mild suging er gitt av mikroinjektoren for å sikre den målrettede cellen til cellevalgsondespissen. Bruk cellemanipuleringssystemet til å flytte cellen på celleutvelgelsessondespissen til den enkle probespissen ved hjelp av et digitalt mikroskop fokusert på den enkle probespissen for å overvåke denne prosessen. Ubehandlede K-562-celler brukes til å etablere den eksperimentelle metoden.I et typisk SCMS-eksperiment kan åpenbare endringer av massespektra observeres fra å overføre en celle under påvisning av mobilinnhold og etter endt måling. Tre vanlige cellulære lipidtopper, inkludert PC 34:4, PC 36:4 og PC 38:5, overvåkes for å sikre at cellen overføres og mobilinnhold oppdages. Identiteten til mange PCer i masseområdet 750 til 850 bekreftes ved hjelp av MSMS på ubehandlede cellelylatprøver.Ved hjelp av ICMP enkelt sonde MS satt opp, Gemcitabine, Taxol og OSW1 ble oppdaget etter inkubasjon med K-562 celler. Disse resultatene tyder på at denne metoden kan brukes til å studere intracellulære lipider, legemidler og metabolitter på enkeltcellenivå fra celler i løsning i et nær innfødt miljø. Husk å plassere glasscelleutvalgsproberen på en sikker måte i den universelle pipetteholderen slik at sugekraften kan påføres tilstrekkelig.Denne metoden kan også brukes på pasientavledede prøver for å skille forskjeller mellom cellulære metabolitter fra en rekke celletyper, noe som gjør at vi kan få en bedre forståelse av disse sykdomstilnærmingene. Etter å ha utviklet denne metoden, Vi kan potensielt implementere kvantifisering av narkotika forbindelser på enkeltcellenivå. Når du arbeider med celler, er det viktig å ha passende personlig verneutstyr, inkludert laboratoriefrakk og hansker.Ekstra øyeslitasje kan brukes når du arbeider med glass.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Vilkårlige Metabolomics fra biologiske kilder Bruke UltraPerformance væskekromatografi-High Resolution massespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av Plant Wall Heteroxylans Bruke enzymic, Chemical (Metylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering av Ambient massespektrometri med bruk av Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

En praktisk metode for utvinning og analyse med høyt trykk væske kromatografi katekolaminer nevrotransmittere og deres metabolitter

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Sanntid pusten analyse ved hjelp av sekundære Nanoelectrospray Ionization koblet til høy oppløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillært geleelektroforese massespektrometri for én celle Metabolomics i Live Frog (Xenopus laevis) embryoer

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Kovalent merking med Diethylpyrokarbonat for å studere protein høyere orden struktur ved massespektrometri

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Kapillær elektroforesebasert hydrogen/deuteriumutveksling for konformasjonskarakterisering av proteiner med massespektrometri ovenfra og ned

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Cellelinjeveiledet massespektrometriproteomikk i det utviklende (froske) embryoet

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...