Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Авторы благодарят Нагу Раму Котхапалли за ее работу по разработке подготовки образцов как для подвесных клеток, так и для экспериментов с клеточными лизатными. Кроме того, авторы благодарят NIH (R01GM116116 и R21CA204706) за финансирование.

1. Изготовление зонда сточных клеток
<ol><li>Преобразуйте одностворные стеклянные трубки в конические зонды с острым наконечником.<ol>
<li>Поместите одностворную стеклянную трубку (ID: 0,3 мм, OD: 1,1 мм) в зажимы вертикального держателя пипетки, центрируя стекло по отношению к нагревательной катушке и затягивайте, чтобы закрепить трубку на месте. Отопительная катушка состоит из 18-калиевого никель-хромового сопротивления проволоки (60 мм в длину), сворачивающей вокруг металлического стержня (диаметр омичка 3,90 мм) в 2,5 раза.</li>
		<li>Установите стеклянные трубки с температурной программой 19.5 (единица производителя). Этот параметр может быть изменен для конкретного инструмента.</li>
		<li>Установите соленоидный поршень на 4 (единица производителя). Этот параметр может быть изменен для конкретного инструмента.</li>
		<li>Триггер соленоид, чтобы вытащить стеклянные трубки. Этот шаг создает два зонда, слитых на кончике.</li>
		<li>Используйте пинцет, чтобы отрезать 1 мм от кончика каждого зонда, создавая обита в диаметре 10 мкм в диаметре на кончике зонда.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Согните стеклянный зонд для легкого соединения с ICMP/однозондом SCMS.<ol>
<li>Установите вытащил стеклянный зонд в микрокузе, позиционирование наконечника на 3 мм выше платиновой отопительной проволоки.</li>
		<li>Включите тепло на платиновой проволоке до 30% от максимальной температуры.</li>
		<li>Согните зонд (45) от исходного положения(рисунок 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Интегрированная сборка платформы манипуляции ячейками
<ol><li>Поместите перевернутый микроскоп, микроинжектор и две системы манипуляции ячейками на моторизованном столе для легкого соединения с масс-спектрометром.<ol>
<li>Измените одну из систем манипуляции ячейками для размещения одного зонда, заменив конец зажимом руки.</li>
		<li>Используйте пластиковый шприц с иглой, чтобы заполнить микроинжектор с минеральным маслом. Избегайте пузырьков в трубах, так как это повлияет на всасывание.</li>
		<li>Замените сценическую вставку перевернутого микроскопа на нагреваемую пластину. Установите нагретую пластину на 37 градусов по Цельсию до анализа.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Настройка устройства для выбора стеклянных ячеек.<ol>
<li>Вставьте зонд выбора стеклянных клеток внутри металлического держателя микроинжектора, поместив длинную (не согнутую) сторону в держатель капилляра и затягивая винт, чтобы обеспечить зонд на месте. Расположите угол наконечника зонда параллельно с нагретой пластиной. ВНИМАНИЕ: Стеклянный зонд очень острый и хрупкий, и он легко ломается. Защитите глаза и будьте особенно осторожны при вставке зонда в микроинжектор.</li>
		<li>Закрепите металлический держатель микроинжектора в систему манипуляций ячейки. Расположите наконечник зонда всередине перевернутого света микроскопа.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Создайте расширенную ионную трубку для вхле масс-спектрометра
<ol><li>Используйте металлический резак, чтобы вырезать кусок трубки из нержавеющей стали (OD: 0.0625 (1/16) в, ID: 0,021 дюйма) 250 мм в длину.</li>
	<li>Измерьте 135 мм от конца и поместите металлическую дикую атмосферу, так что 135 мм будут подвергаться воздействию атмосферы, а 115 мм будут находиться внутри масс-спектрометра. Закрепите одичатого с помощью двух гаечных кеги, чтобы затянуть его.</li>
</ol>4. Пара ICMP с установкой одного зонда
<ol><li>Закрепите стеклянную горку, содержащую один зонд, в зажим руки системы манипуляций ячейки. ПРИМЕЧАНИЕ: Однозонды изготавливаются в соответствии с ранее опубликованным протоколом48 с двумя незначительными изменениями в текущем исследовании: излучатель nano-ESI сделан дольше для легкого соединения с масс-спектротером, а однозонды приклеены к стеклу стороны на правой стороне, чтобы избежать вмешательства в пространственное движение устройства выбора стеклянных клеток(рисунок2).</li>
	<li>Подключите капилляр, обеспечивающий растворитель, к проводящему союзу, поместив капилляр в рукав (1/16 x .005 в) пластикового феррула и затягивая фитинг.<ol>
<li>Соедините другую сторону проводящий союз с капилляром (ID: 40 мкм, OD: 150 мкм), который соединен со шприцем, содержащим проектут выборку, поместив капилляр в рукав (1/32 x .007 дюйма) и затягивая примерку. Используйте ацетонитрил с 0,1% для мистовой кислоты в качестве пробного растворителя в этих экспериментах. ПРИМЕЧАНИЕ: Проектор выборки является гибким, но он должен в первую очередь содержать ацетонитрил (или ацетонитрил с formic кислоты для лучшей ионизации) для быстрого микромасштабного лизиса клеток.</li>
		<li>Закрепите шприц в шприц насос на масс-спектрометре.</li>
		<li>Поместите ионизацию вольтового шнура на медную проволоку, прикрепленную к проводному союзу.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Расположите излучатель nano-ESI на 1 мм в проположение расширенной ионной трубки передачи.<ol>
<li>Используйте систему манипуляций ячейками для управления пространственными движениями однозонда и расположения излучателя nano-ESI централизованно перед расширенной трубкой переноса иона.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Подвесная подготовка образца клеток
<ol><li>За день до анализа (18-24 ч), семена из клеток для тестирования в колбе клеточной культуры (T25). K562 человека миелоидных клеток лейкемии используются в качестве моделей в этом исследовании.<ol>
<li>Тепло 1x фосфат буферных солен (PBS) и Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) средний дополнен 10% синтетических фетальных сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 КК в течение 30 мин.</li>
		<li>Семя No 1 х 106 клеток в общей объеме 10 мл, сочетая клетки с теплой средой. В общем, используйте 10-мл пипетку, чтобы поместить 8 мл среды RPMI в колбу клеточной культуры. Затем используйте 2 мл пипетку, чтобы положить 2 мл смещаемых клеток K562 среды для 1 х 106 ячеек.</li>
		<li>Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 до анализа.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовьте клетки к анализу.<ol>
<li>Клетки пипетки из колбы клеточной культуры в 15-мл центрифуги трубки.</li>
		<li>Спин клетки вниз на 400 х г и 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут и отбросить супернатант.</li>
		<li>Перепристой клетки в 4 мл среды RPMI, содержащей соединение препарата при желаемой концентрации лечения. ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа контрольных клеток, повторного приостановки клеток в 4 мл среды RPMI и перейти к шагу 6.</li>
		<li>Инкубировать клетки в течение всего времени лечения при 37градусах Цельсия и 5% CO 2.</li>
		<li>Спин-клетки вниз на 400 х г и 37 кв. c в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.</li>
		<li>Клетки переплетываются в 10 мл PBS, а центрифуга на 400 х г и 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. После вращения, отбросить супернатант. Повторите этот шаг 3 раза, чтобы свести к минимуму обнаружение препарата из внеклеточных компонентов.</li>
		<li>Resuspend клетки в 4 мл PBS для анализа.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Выполняйте измерения SCMS с помощью установки ICMP/одного зонда
<ol><li>Настройте параметры для масс-спектрометра для эксперимента.<ol>
<li>Под заголовком Scan Mode программного обеспечения прибора выберите Define Scan. Используйте разрешение 60 000 м/м при м/з 400, 1 микроскан, 100 мс максимальное время впрыска и автоматический контроль усиления (AGC) на. Для экспериментов использовалась масса (м/з) 100-1000. Параметры могут быть изменены на основе модели прибора.</li>
		<li>При Syringe Pumpвыберите скорость потока 150 nL/min. Скорость потока должна быть оптимизирована для каждого эксперимента.</li>
		<li>Выберите источник NSI и примените напряжение в 4,5 кВ. Этот параметр также должен быть оптимизирован для каждого эксперимента.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Включите перевернутый микроскоп (с 40-кратным увеличением, выбранным как для верхней пластины, так и для нижнего объектива) и подключите его к USB-порту ноутбука для захвата живых видео-каналов. Включите нагретую пластину и установите ее до 37 градусов по Цельсию.</li>
	<li>На компьютере перейдите на вкладку Acquire Data и выберите непрерывно под acquire Time.</li>
	<li>Подготовьте образец для анализа.<ol>
<li>Пипетка 2-3 мл образца в крышку небольшой чашки Петри (35 мм х 12 мм).</li>
		<li>6.4.2 Расположите образец в центре света от перевернутого микроскопа поверх нагретой пластины.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовьте зонд для отбора стеклянных клеток для анализа. Используйте систему манипуляций ячейки для перемещения зонда, чтобы его кончик был сосредоточен под перевернутым микроскопом в той же плоскости, что и клетки.</li>
	<li>Выберите для анализа отдельную ячейку.<ol>
<li>Используйте систему манипуляций ячейки, чтобы переместить наконечник зонда выбора ячейки в целевую ячейку. Этот процесс контролируется с помощью перевернутого микроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Если кончик зонда выбора ячейки не может быть сфокусирован в той же плоскости, что и клетки, возможно, что изогнутая часть зонда не имеет под углом. Отрегулируйте положение зонда выбора клетки до тех пор пока оба подсказки зонда не сфокусировать вместе с клетками под микроскопом.</li>
		<li>Аккуратно поверните ручку микроинжектора, чтобы отрегулировать положение минерального масла внутри трубки. Нежный всасывания обеспечивается микроинжектора для обеспечения целевой ячейки ячейки ячейки зонда кончика. ПРИМЕЧАНИЕ: Если ячейка не может быть захвачена зондом выбора ячейки через силу всасывания, проверьте зонд выбора ячейки, чтобы убедиться, что он полностью вставлен в держатель капилляра. Кроме того, проинспектировать уровни минерального масла в микроинжектора и труб, и изгнать воздух, если таковые имеются.</li>
		<li>Используйте систему манипуляций ячейки для перемещения ячейки на кончике зонда-выбора клеток к наконечнику одного зонда, используя цифровой микроскоп, ориентированный на наконечник одного зонда, чтобы контролировать этот процесс. При прикосновении, небольшая капля ацетонитрила на наконечнике одного зонда индуцирует быстрые лизы клетки, а затем клеточный лизат немедленно ионизируется для он-лайн анализа MS. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку выбранная ячейка закреплена на наконечнике зонда выбора клеток через нежный всасывание, эта ячейка может быть потенциально отделена во время ее передачи в наконечник одного зонда. Поэтому, если ионные сигналы типичных клеточных липидов (см. репрезентативные результаты ниже) не наблюдаются в течение 5 с, возможно, что клетка стала непривязанной, и необходим выбор другой клетки.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Интегрированная платформа для манипуляций и анализа ячейки построена для расширения универсальности метода MS с одним зондом, что позволяет проводить он-лайн, быстрый анализ неприсоединения клеток в почти родной среде. Основным преимуществом метода является то, что требуется минимальный отбор образцов, поэтому клетки анализируются в условиях, имитирующих их стандартное состояние. В частности, отдельные клетки, представляющие интерес, могут быть визуально идентифицированы и выбраны, сведя к минимуму влияние матричного влияния на эффективность ионизации MS при сохранении клеток в их естественной среде обитания, поэтому результаты являются более репрезентативными клетками родной статус(Рисунок S3). Этот метод может быть потенциально использован для изучения клеток пациента приостановлено в биожидкости в будущих исследованиях. Еще одним преимуществом этого метода является гибкий выборочный растворитель. Важно включить ацетонитрил в качестве основного растворителя выборки, так что микромасштабный лиза может произойти быстро. Потенциально внутренние стандарты (например, изотопно-маркированные лекарственные соединения) могут быть добавлены в проектный состав выборки для количественной оценки молекул, представляющих интерес (например, молекулы лекарств) отдельных клеток, в том числе и те, которые могут играть ключевую роль в революции персонализации лечения наркомании в будущем54.
Хотя эта интегрированная система может быть удобно использована для анализа широких диапазонов клеток, ограничение метода заключается в том, что ни один зонд, ни зонд-выбор ячейки зондней не доступны коммерчески; диктует необходимость оптимизации многих параметров (например, скорость потока, напряжение, длина между излучателем нано-ESI и трубками переноса иона и т.д.) до каждого эксперимента. Кроме того, из-за малости зонда с однозондом и зондом отбора клеток возмущение окружающей среды (например, поток воздуха) может привести к трудностям с созданием соединения между двумя зондами. Краткосрочным решением является изгиб зонда выбора клеток близко к концу, чтобы свести к минимуму длину сужающихся. Будущая работа включает в себя разработку жилья, чтобы огразать важнейшие части установки, чтобы свести к минимуму воздействие на окружающую среду. Из-за ограниченного количества клеточного содержимого и короткого времени приобретения (2-3 с) из клетки, MS / MS анализ может быть проведен только для относительно обильных видов. Другие факторы, влияющие на чувствительность обнаружения включают подавленной эффективности ионизации в связи с введением матрицы вместе с клеткой и потенциальной потерей иона через расширенные трубки передачи ионов.

Биология человека, особенно биология болезней, все чаще понимается как результат деятельности на уровне отдельных клеток, но традиционные аналитические методы, такие как жидкая хроматография масс-спектрометрии (LCMS), как правило, используются для анализа образцы, подготовленные из популяций клеток, в то время как полученная молекулярная информация не может точно представлять химические процессы на уровне отдельных клеток. Эти стандартные, традиционные методы не способны различить влияние клеточной неоднородности на аналитическое измерение, а процесс разрушения и смешивания клеток для подготовки лисата потенциально приводит к изменению или потере клеточной компоненты1,2. Эти ограничения традиционных методов особенно важны при анализе клеток пациента, в которых полученные образцы могут содержать сложную смесь различных типов клеток. Для устранения этих недостатков все чаще разрабатываются и применяются методы молекулярного анализа одноклеточных клеток, включая одноклеточные методы масс-спектрометрии (SCMS), и применяются к биоанализу, особенно клеточных метаболитов и низкой молекулярной массе биомолекулы3,4.
Первые методы SCMS, разработанные использовали вакуумные методы длявыполнения анализов в неамбиаентных условиях 2,5,6,7,8,9, 10,11. Несвязанные методы SCMS способны анализировать клеточные липиды и метаболиты, но требуют предварительной обработки образцов в искусственных условиях, и поэтому не подходят для анализа в режиме реального времени. Процесс подготовки образца для неамбиентного анализа включает в себя добавление матричных компонентов, и этот препарат может изменять клеточные компоненты из их естественной среды12. Таким образом, методы окружающей среды масс-спектрометрии (MS), которые не требуют вакуума для среды отбора проб, используются для анализа клеток в почти родной среде. Отсутствие вакуумной среды обеспечивает универсальность в экспериментальном дизайне; камеры могут быть добавлены для мониторинга клеточного процесса и мягкие методы ионизации могут быть объединены с методами разделения, чтобы получить лучшую информацию от каждого одноклеточного эксперимента4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
Метод одного зонда SCMS является методом окружающей среды, который анализирует живые, линии раковых клеток млекопитающих в почти родной среде21,43,44,45,46. Кроме того, однозондное устройство использовалось для других приложений масс-спектрометрии, включая анализ внеклеточных молекул в многоклеточных сфероидах и MS-изображение тканей47,48,49 ,50,51,52. Однако, так как иммобилизация клеток на субстратах требуется для этого метода, подвесные клетки не могут быть непосредственно проанализированы с помощью этой техники3,53. Таким образом, система msms одного зонда не могла быть непосредственно использована для отбора проб неприсоединения одноклеточных клеток, таких как неприсоединения клеточных линий или подвесных клеток, выделенных из крови пациента или других жидкостей организма54. В этой работе, интегрированная платформа манипуляции ячейки (ICMP) в сочетании с одним зондом SCMS техники для анализа живых, подвесных клеток на линии с минимальным подготовки образца (Рисунок 1)46. ICMP состоит из перевернутого микроскопа для мониторинга выбора клеток, зонда выбора стеклянных клеток, микроинжектора для захвата отдельных плавающих клеток, нагретой пластины для поддержания клеточной температуры, двух систем манипуляции ячейками для контроля пространственных движения как зонда выбора стеклянных клеток и одного зонда, так и цифрового микроскопа для наблюдения за передачей клеток от наконечника зонда выбора клеток к наконечнику одного зонда. Изготовление одного зонда подробно описано в предыдущих публикациях и не будет рассмотрено здесь21,48. Система ICMP/один зонд соединена с масс-спектротером высокого разрешения. Эта интегрированная установка позволяет выборки выявленных одиночных клеток из сложных биологических образцов с минимальными эффектами от матричных молекул.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

Одноклеточная масс-спектрометрия (SCMS) позволяет чувствительно обнаруживать и точно анализовать широкие диапазоны клеточных видов на индивидуальном уровне. Однозонд, микромасштабное устройство выборки и ионизации, может быть соединен с масс-спектрометром для он-лайн, быстрого анализа SCMS клеточных компонентов в условиях окружающей среды. Ранее метод одинзонд SCMS в основном использовался для измерения обездвижений клеток на субстрат, ограничивая типы клеток для исследований. В текущем исследовании, один зонд SCMS технология была интегрирована с системой манипуляции ячейки, как правило, используется для экстракорпорального оплодотворения. Эта интегрированная платформа для манипуляций и анализа клеток использует зонд выбора клеток для захвата идентифицированных отдельных плавающих ячеек и передачи клеток в наконечник одного зонда для микромасштабного лиза, за которым следует немедленный анализ масс-спектрометрии. Этот процесс захвата и передачи удаляет клетки из окружающего раствора до анализа, минимизируя введение матричных молекул в анализ масс-спектрометрии. Эта интегрированная установка способна анализом SCMS целевых изолированных клеток пациента, присутствующих в образцах жидкостей организма (например, моча, кровь, слюна и т.д.), что позволяет потенциальное применение анализа SCMS к человеческой медицине и биологии болезней.

Во-первых, для создания экспериментального метода используются необработанные клетки K562. В типичном эксперименте SCMS, очевидные изменения масс-спектра можно наблюдать от передачи клетки, во время обнаружения клеточного содержимого, и после окончания измерения(Рисунок S1). Три общих клеточных липидных пика (фосфатидилхолин, ПК), в том числе ПК (34:4)(м/з 754.536), PC (36:4)(м/z 782.567) и PC (38:5)(м/z 808.583), контролируются для обеспечения успешной передачи клетки и клеточной содержимое обнаружено(рисунок S2)21,43,46,55,56. Если липидные пики не видны в пределах 5 с, уровень минерального масла в микроинжекторе изменяется, чтобы уменьшить всасывание, удерживая клетку на кончике зонда клеточного отбора; осторожность должна быть принята так, что минеральное масло не выталкивается из клеточного селекции зонда. Личность многих ПК в массовом диапазоне м /z 750-850 подтверждена с помощью MS/MS на необработанных образцах клеточного лисата (рисунок3, Рисунок S2, Таблица 1)46.
Клетки K562 также подвергаются лечению различными лекарственными соединениями, чтобы расширить универсальность метода. Клетки K562 инкубируются гемцитабином (1 мкм) и таксолом (1 мкм) на 1 ч и OSW-1 (100 нм, 1 ММ) на 4 ч и 2 ч соответственно. Клетки затем промывают pbS, чтобы свести к минимуму обнаружение соединений препарата от внеклеточного содержания. Вклад матрицы (например, ионы от среды клеточной культуры, PBS и растворителя) в масс-спектры клеточного содержимого могут быть устранены с помощью вычитания данных, из-за их значительно различных ионных сигналов(рисунок S3). Все три соединения наркотиков обнаружены с помощью ICMP / однозонд MS установки(Рисунок S4)46. Эти результаты показывают, что этот метод может быть использован для изучения внутриклеточных липидов, препаратов и метаболитов на одноклеточном уровне из клеток в растворе в почти родной среде.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> Рисунок 1. Экспериментальная установка для экспериментов MS с одной подвесной ячейкой. (A) Интегрированная платформа манипуляции ячейками (ICMP) в сочетании с масс-спектрометром. (B) Схема для анализа взвешенных клеток. (C) Экспериментальный вид клеток K562, которые будут выбраны с помощью зонда выбора клеток. Перепечатано с разрешения Standke et al.46. Авторское право 2019 Американское химическое общество. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> Рисунок 2. Фотографии модифицированного однозонда и зонда выбора клеток, используемых для экспериментов с одной подвесной ячейкой MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> Рисунок 3. Увеличенный масс-спектр из одной клетки, показывающий представительный вид(м/з 750-850). Химические структуры подтверждаются с помощью анализа MS/MS(рисунок S1). Перепечатано с разрешения Standke et al46. Авторское право 2019 Американское химическое общество. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Молекула препарата (англ.)</td>
			<td>м/з</td>
			<td>Массовая ошибка (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Гемцитабин и H) +
</td>
			<td>264.076</td>
			<td>11.32 Для того, чтобы</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Таксол и На) +
</td>
			<td>876.318</td>
			<td>2.74</td>
		</tr>
<tr>
<td>(OSW-1) +
</td>
			<td>895.445</td>
			<td>0,89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Сотовые липиды</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(34:4) +
</td>
			<td>754.535</td>
			<td>3.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(34:3) +
</td>
			<td>756.551</td>
			<td>3,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(34:2) +
</td>
			<td>758.569</td>
			<td>0,66</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(36:5) +
</td>
			<td>780.551</td>
			<td>3,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(36:4) +
</td>
			<td>782.568</td>
			<td>2.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(36:3) +
</td>
			<td>784.585</td>
			<td>0,64</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(38:7) +
</td>
			<td>804.551</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(38:6) +
</td>
			<td>806.567</td>
			<td>2.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(38:5) +
</td>
			<td>808.583</td>
			<td>2.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(38:4) +
</td>
			<td>810.601</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>(PC(40:7) +
</td>
			<td>832.583</td>
			<td>3.12 12.12.2.2.</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Идентифицированы клеточные компоненты с помощью установки ICMP/Single-probe. Обнаружение всех лекарственных соединений было подтверждено путем сравнения результатов MS/MS со стандартным соединением.

Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Интегрированная платформа манипуляции ячейками разработана для использования в сочетании с установкой масс-спектрометрии одного зонда для он-лайн анализа отдельных подвесных клеток в условиях окружающей среды.

Интегрированная платформа манипулирования ячейками в сочетании с однозондом для анализа масс-спектрометрии наркотиков и метаболитов в односуспевающих клетках

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Так как этот метод анализирует клетки из раствора, он может быть использован для изучения клеток в ближайшем родной среде. Это включает в себя анализ производных образцов клеток пациента. Этот метод практически не требует подготовки образцов клеток.Таким образом, мы можем анализировать отдельные клетки онлайн в условиях окружающей среды, что позволяет нам исследовать клеточной неоднородности. Этот метод может быть применен для изучения жидкой биопсии из различных состояний болезни, так как он может анализировать различные типы клеток, непосредственно изолированных от образцов пациента. Для преобразования одной скважины стеклянные трубки в конические зонд с острым кончиком, первое место одной скважины стеклянной трубки в зажимы вертикального держателя пипетки, центрирование стекла по отношению к нагревательной катушки и затянуть для обеспечения трубки на месте.Нагревательная катушка состоит из 18-калиберной проволоки сопротивления никеля хрома, обмотанные вокруг металлического стержня в 2,5 раза. Установите стеклянную трубку с температурной программой 19.5. Установите соленоидный поршень на четыре.Триггер solenoid тянуть стеклянные трубки. Этот шаг создает два зонда, слитых на кончике. Используйте свитера, чтобы отрезать примерно один миллиметр от кончика каждого зонда, создавая отверстие диаметром около 10 микрон на кончике зонда.Чтобы согнуть стеклянный зонд для легкого соединения с ICMP, один зонд SCMS создан. Первый набор вытащил стеклянный зонд в микрофорге. Распоить верхнюю часть примерно на три миллиметра выше платиновой теплопроводки.Затем поверните тепло на платиновой проволоке до 30% от максимальной температуры. Согните зонд примерно на 45 градусов от исходного положения. Поместите перевернутый микроинъектор микроскопа в две системы манипуляции ячейками на моторизованном столе для легкой связи с масс-спектрометром.Чтобы настроить устройство выбора стеклянных ячеек, вставьте зонд выбора стеклянных ячеек внутри металлического держателя микроинъектора, поместив длинный слайд в держатель капилляра и затягивая винт, чтобы обеспечить зонд на месте. Распоить наконечники зонда под углом параллельно нагретой пластине. Закрепив металлический держатель микроинжектора в клеточной системе манипуляции.Затем распоить наконечник зонда в середине перевернутого микроскопа света. Закрепить стеклянную горку, содержащую один зонд, в зажим для рук системы манипуляции ячейками. Подключите растворитель, обеспечивающий капилляр к проводящим союзу, поместив капилляр в рукав пластикового феррула и палец, затягивая фитинг.Соедините другую сторону проводящих союзов с капилляром, который подключен к шприцу, содержащем растворитель выборки, поместив капилляр в рукав и затягивая фитинг. Используйте ацетонитрил с 0,1% кремовой кислоты в качестве растворителя выборки в этих экспериментах. Закрети шприц в шприц-насосе на масс-спектрометре.Распоистите ионизацию наноэлектроскопии или излучатель нано ESI примерно на один миллиметр к отверстию удлиненной ионные трубки передачи. Используйте систему манипуляции ячейками для управления спациальных движений одного зонда и позиционирования нано-излучатель ESI централизованно перед расширенной ионо-передачи труб. Пипетт клетки из колбы клеточной культуры в 15 миллилитров центрифуги трубки.Спин клетки при 400 раз G в 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Повторное содержание клеток в четырех миллилитров RPMI среды, содержащей соединение препарата при желаемой концентрации лечения. Настройка экспериментальных параметров для масс-спектрометра.В режиме сканирования заголовка программного обеспечения инструмента, выберите определить сканирование. Используйте разрешение 60 000 на M более 400, один микроскан 100 миллисекунд максимальное время впрыска и автоматический контроль усиления. Под шприц-насосом выберите скорость потока 150 нанолитров в минуту.Выберите источник NSI и нанесите напряжение около 4,5 киловольт. Включите перевернутый микроскоп при 40-м увеличении, выбранном как для верхней пластины, так и для нижней линзы. Подключите его к USB-порту ноутбука для захвата видео-каналов в реальном времени.Включите нагретую пластину и установите ее до 37 градусов по Цельсию. На компьютере перейдите на вкладку данных и выберите непрерывно в течение приобретенного времени. Чтобы подготовить образец для анализа, пипетка два-три образца в крышку небольшой чашки Петри.Распоить образец в центре света от перевернутого микроскопа поверх нагретой пластины. Подготовь зонд выбора стеклянных клеток для анализа. Используйте систему манипуляции ячейками для перемещения зонда, чтобы его верх был сфокусирован под перевернутым микроксопом в той же плоскости, что и клетки.Используйте систему манипуляции ячейками для перемещения наконечника зонда выбора ячейки в целевую ячейку для анализа. Этот процесс контролируется с помощью перевернутого микроскопа. Аккуратно поверните ручку микроинъектора, чтобы отрегулировать положение минерального масла внутри трубки.Нежный всасывания обеспечивается микроиндом для обеспечения целевой ячейки к кончику зонда выбора клеток. Используйте систему манипуляции ячейки для перемещения ячейки на кончике зонда выбора ячейки к одному наконечнику зонда с помощью цифрового микроскопа, сфокусированного на одном наконечнике зонда для мониторинга этого процесса. Для создания экспериментального метода используются необработанные клетки К-562.В типичном эксперименте SCMS, очевидные изменения спектра массы можно наблюдать от переносить клетку во время обнаружения клетчатого содержания и после заканчивать измерение. Три общих клеточных липидных пика, включая PC 34:4, PC 36:4 и PC 38:5, контролируются, чтобы обеспечить успешное перевод клетки и обнаружение клеточного содержимого. Личность многих ПК в диапазоне масс от 750 до 850 подтверждена с помощью MSMS на необработанных образцах лисата клеток.С помощью одного зонда ICMP MS создан, Gemcitabine, Taxol и OSW1 были обнаружены после инкубации с K-562 клеток. Эти результаты показывают, что этот метод может быть использован для изучения внутриклеточных липидов, препаратов и метаболитов на уровне одной клетки из клеток в растворе в близкой родной среде. Не забудьте надежно поместить зонд выбора стеклянных клеток в универсальный держатель пипетки, так что всасывание может быть адекватно применено.Этот метод также может быть применен к полученным пациентом образцам, чтобы различать различия между клеточными метаболитами от различных типов клеток, что позволяет нам лучше понять эти состояния заболевания. После разработки этого метода, мы могли бы потенциально реализовать количественную оценку соединений наркотиков на уровне одной клетки. При работе с клетками важно иметь соответствующее средства индивидуальной защиты, включая лабораторное пальто и перчатки.Дополнительная одежда глаз может быть использована при работе со стеклом.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Секвенирование растений стены Heteroxylans Использование ферментативной, химической (метилирование) и физический (масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс) Методики

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Визуализация Ambient масс-спектрометрии с использования шлирен Фото

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Удобный метод для извлечения и анализа с высокого давления жидкостной хроматографии и их метаболитов катехоламинов нейротрансмиттеров

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Анализ реального времени дыхание с помощью вторичных Nanoelectrospray ионизации в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Рентгенофлуоресцентного капиллярного электрофореза масс-спектрометрии для метаболомики одноклеточных в жить лягушки (Xenopus laevis) эмбрионов

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Ковалентная маркировка диэтилпирокарбонатом для изучения структуры белка высшего порядка с помощью масс-спектрометрии

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Протеомика масс-спектрометрии под контролем клеточных линий у развивающегося эмбриона (лягушки)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...