Name: integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Författarna tackar Naga Rama Kothapalli för hennes arbete med att utveckla prov preparering för både SUS pensions celler och celllysat experiment. Dessutom författarna tackar NIH (R01GM116116 och R21CA204706) för finansiering.

1. sond tillverkning för val av glas celler
<ol><li>Omvandla enkelborrade glas slangar till en avsmalnande sond med en vass spets.<ol>
<li>Placera ett glas rör med ett hål (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) i klämmorna på en vertikal pipetthållare, centrera glaset med avseende på värme spolen och dra åt för att säkra röret på plats. Värme batteriet består av en 18-gauge nickel-krom motstånd tråd (~ 60 mm lång) rullade runt en metall stav (diameter = 3,90 mm) 2,5 gånger.</li>
		<li>Ställ in glas slangen med temperatur program 19,5 (tillverkarens enhet). Den här parametern kan ändras för ett visst instrument.</li>
		<li>Ställ in magnet kolven på 4 (tillverkarens enhet). Den här parametern kan ändras för ett visst instrument.</li>
		<li>Utlös solenoiden för att dra glas slangen. Detta steg skapar två sonder smält på spetsen.</li>
		<li>Använd pincett för att klippa ~ 1 mm bort från spetsen på varje sond, vilket skapar en öppning av ~ 10 μm i diameter vid sond spetsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Böj glas sonden för enkel koppling till ICMP/Single-Probe SCMS setup.<ol>
<li>Ställ en dragen glas sond i microforge, positionering spetsen ~ 3 mm ovanför platina värme tråden.</li>
		<li>Vrid värmen på platina tråden till 30% av den maximala temperaturen.</li>
		<li>Böj sonden ~ 45 ° från den ursprungliga positionen (figur 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. integrerad cell manipulation plattform montering
<ol><li>Placera det inverterade Mikroskop, mikroinjektor, och två cell manipulation system på ett motoriserat bord för enkel koppling med masspektrometer.<ol>
<li>Modifiera en om cell manipulationen systemen till inhysa en enkel-sond vid ersättande den ände med en arm klämma.</li>
		<li>Använd en plast spruta med en nål för att fylla mikroinjektorn med mineral olja. Undvik bubblor i slangen eftersom detta kommer att påverka suctioning.</li>
		<li>Byt ut steg insatsen på det inverterade mikroskopet mot den uppvärmda plattan. Ställ den uppvärmda plattan vid 37 ° c före analys.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ställ in enheten för cell val av glas.<ol>
<li>Sätt in sonden för cell val av glas inuti metall hållaren på mikroinjektorn genom att placera den långa (icke-böjda) sidan i kapillärhållaren och dra åt skruven för att fästa sonden på plats. Placera sond Spetsens vinkel parallellt med den uppvärmda plattan. Varning: glas sonden är mycket skarp och ömtålig, och den bryts lätt. Skydda dina ögon och vara extra försiktig när du sätter in sonden i microinjektor.</li>
		<li>Fäst metall hållaren på mikroinjektorn i cell manipulations systemet. Placera sond spetsen nära mitten av det inverterade Mikroskop ljuset.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. skapa ett utökat Jon överförings rör för masspektromometerns inlopp
<ol><li>Använd en metall fräs för att skära en bit av rost fritt stål slangar (OD: 0,0625 (1/16) i, ID: 0,021 i) ~ 250 mm i längd.</li>
	<li>Mät 135 mm från änden och placera en metall förvildade så ~ 135 mm kommer att utsättas för atmosfären och ~ 115 mm kommer att vara inne i masspektrometer. Säkra Feral med hjälp av två SKIFT nycklar för att dra åt den.</li>
</ol>4. koppla ihop ICMP med en ensondinställning
<ol><li>Fäst glas glaset som innehåller den enkla sonden i arm klämman på cell manipulations systemet. Obs: Single-sonder tillverkas enligt ett tidigare publicerat protokoll48 med två smärre förändringar i den aktuella studien: Nano-ESI emitter görs längre för enkel koppling till masspektrometer, och de enda sonderna är limmade till glaset sidan på höger sida för att undvika att störa den rumsliga förflyttningen av enheten för cell val av glas (figur 2).</li>
	<li>Anslut lösnings medlet-som ger kapillär till en ledande förening genom att placera kapillär i hylsan (1/16 x .005 i) av plast hylsan och finger-åtdragning tillbehöret.<ol>
<li>Anslut den andra sidan av den ledande föreningen till en kapillär (ID: 40 μm, OD: 150 μm), som är ansluten till en spruta som innehåller provtagning lösnings medel, genom att placera kapillär i hylsan (1/32 x .007 i) och åtdragning av tillbehöret. Använd acetonitril med 0,1% myrsyra som provtagnings vätska i dessa experiment. Anmärkning: provtagnings vätskan är flexibel, men den bör i första hand innehålla acetonitril (eller acetonitril med myrsyra för bättre jonisering) för en snabb mikroskalscell Lys.</li>
		<li>Fäst sprutan i sprutpumpen på masspektrometer.</li>
		<li>Placera joniseringsspänningssladden på en koppar tråd som fästs vid den ledande föreningen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placera nano-ESI-sändaren ~ 1 mm till öppningen på det utökade Jon överförings röret.<ol>
<li>Använd cell manipulations systemet för att kontrol lera de rumsliga rörelserna hos Single-Probe och placera nano-ESI-sändaren centralt framför den utökade Jon överförings slangen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. suspenderad cell prov beredning
<ol><li>Dagen före analys (~ 18-24 h), frö ut celler för testning i en cell kulturkolv (T25). K562 humana myeloida leukemiceller används som modeller i denna studie.<ol>
<li>Värm 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium kompletterat med 10% syntetiskt fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° c i 30 min.</li>
		<li>Seed ~ 1 x 106 celler i en total volym av 10 ml genom att kombinera celler med varmt medium. Använd i allmänhet en 10 mL pipett för att placera 8 mL RPMI-medium i en cellkulturkolv. Använd sedan en 2 ml pipett för att sätta 2 ml konfluenta K562 celler mediet för ~ 1 x 106 celler.</li>
		<li>Inkubera cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 fram till analysen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered cellerna för analys.<ol>
<li>Pipettera cellerna från cell odlings kol ven till ett 15 mL centrifugerör.</li>
		<li>Snurra cellerna ner vid 400 x g och 37 ° c i 5 min och Kassera supernatanten.</li>
		<li>Omsuspendera cellerna i 4 mL RPMI-medium som innehåller läkemedels substansen vid önskad behandlings koncentration. Anmärkning: för analys av kontroll celler, omsuspendera cellerna i 4 mL RPMI-medium och hoppa till steg 6.</li>
		<li>Inkubera cellerna under behandlings tiden vid 37 ° c och 5% CO2.</li>
		<li>Snurra cellerna ner vid 400 x g och 37 ° c i 5 min. aspirera supernatanten.</li>
		<li>Cellerna resuspenderas i 10 mL PBS och centrifugera vid 400 x g och 37 ° c i 5 min. Kassera supernatanten efter spinning. Upprepa detta steg 3 gånger för att minimera upptäckten av läkemedel från extracellulära bestånds delar.</li>
		<li>Omsuspendera cellerna i 4 mL PBS för analys.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. utför SCMS-mätningar med hjälp av ICMP/Single-Probe setup
<ol><li>Anpassa parametrar för masspektrometer för experimentet.<ol>
<li>Välj definiera skanningunder rubriken skannings läge på instrumentets program vara. Använd en upplösning på 60 000 m/∆ m vid m/z 400, 1 microscan, 100 ms maximal injektions tid och automatisk förstärknings kontroll (AGC) på. Ett Mass intervall (m/z) på 100-1000 utnyttjades för experimenten. Parametrarna kan ändras baserat på instrument modellen.</li>
		<li>Under sprutpump, Välj en flödes hastighet på 150 nl/min. flödes hastigheten måste optimeras för varje experiment.</li>
		<li>Välj NSI source och tillämpa en spänning på ~ 4,5 kV. Den här parametern måste också optimeras för varje experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slå på det inverterade mikroskopet (med 40x förstoring valt för både den övre plattan och botten linsen) och Anslut den till USB-porten på en bärbar dator för att fånga live-video-feeds. Slå på den uppvärmda plattan och Ställ in den på 37 ° c.</li>
	<li>Gå till fliken Hämta data på datorn och välj kontinuerligt under Hämta tid.</li>
	<li>Förbered provet för analys.<ol>
<li>Pipettera 2-3 mL av provet i locket på en liten petriskål (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 Placera provet i mitten av ljuset från det inverterade mikroskopet ovanpå den uppvärmda plattan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered glaset cell urvals sonden för analys. Använd cell manipulation systemet för att flytta sonden så dess spetsen är fokuserad under inverterade Mikroskop i samma plan som cellerna.</li>
	<li>Välj en enskild cell för analys.<ol>
<li>Använd cell manipulation systemet för att flytta cell markeringen sond spetsen till en riktad cell. Denna process övervakas med hjälp av inverterat Mikroskop. Obs: om spetsen på cell markerings sonden inte kan fokuseras i samma plan som cellerna, är det möjligt att den böjda delen av sonden inte är korrekt vinklad. Justera positionen för cell markerings sonden tills båda sond spetsarna kan fokuseras tillsammans med celler under mikroskopet.</li>
		<li>Vrid försiktigt handtaget på mikroinjektorn för att justera placeringen av mineral oljan inuti slangen. En mild sugning tillhandahålls av mikroinjektorn för att säkra den riktade cellen till cell-urval sond spetsen. Anmärkning: om cellen inte kan fångas upp av cell urvals sonden genom sug kraften, kontrol lera cell urvals sonden för att säkerställa att den är helt insatt i kapillärhållaren. Dessutom inspektera mineral olja nivåer i mikroinjektor och slangar, och utvisa luft om det finns någon.</li>
		<li>Använd cell manipulation systemet för att flytta cellen vid cell-markeringen sond spetsen till Single-sond spetsen, med hjälp av ett digitalt mikroskop fokuserat på Single-sond spetsen för att övervaka denna process. Vid beröring, en liten acetonitril droplet vid Single-sond spetsen inducerar en snabb lyserar av cellen, och sedan cell lysate omedelbart joniseras för on-line MS analys. Anmärkning: eftersom den valda cellen är säkrad till cell-markeringen sond spetsen genom en skonsam sugning, kan denna cell potentiellt lossas under dess överföring till Single-Probe spets. Därför, om Jon signaler av typiska cellulära lipider (se representativa resultat nedan) inte observeras inom 5 s, det är möjligt att cellen blev utan fäste, och valet av en annan cell behövs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Den integrerade cell manipulation och analys plattform är konstruerad för att utöka mångsidigheten hos Single-Probe MS-metoden, vilket möjliggör on-line, snabb analys av icke-anhängare celler i en nära-Native miljö. En stor fördel med tekniken är att minimal prov beredning krävs, så att cellerna analyseras under förhållanden som efterliknar deras standard tillstånd. Särskilt kan enskilda celler av intresse identifieras visuellt och väljas, vilket minimerar påverkan av mat ris effekten på MS joniseringseffektivitet samtidigt som cellerna bibehålls i sin naturliga miljö, så resultaten är mer representativa celler infödda status (figur S3). Denna teknik kan potentiellt användas för att studera patient celler suspenderade i biofluider i framtida studier. En annan fördel med denna teknik är det flexibla urvalet av provtagnings vätskan. Det är viktigt att inkludera acetonitril som huvud provtagning lösnings medel så att mikroskala Lys kan inträffa snabbt. Eventuellt kan interna standarder (t. ex. isotopiskt märkta läkemedels föreningar) tillsättas i provtagnings vätskan för kvantifiering av molekyler av intresse (t. ex. läkemedels molekyler) från enskilda celler, inklusive sådana som kan spela en nyckel roll för att revolutionera anpassa läkemedels behandlingar i framtiden54.
Även om detta integrerade system praktiskt kan användas för att analysera breda cell områden, är en begränsning av metoden att varken Single-Probe eller cell urvals sonden är kommersiellt tillgänglig. dikterar behovet av optimering av många parametrar (t. ex. flödes hastighet, spänning, längd mellan nano-ESI-sändare och Jon överförings slang, etc.) före varje experiment. Dessutom, på grund av den litenhet av single-Probe och cell-selektion sond, miljö störningar (t. ex. luft flöde) kan resultera i svårigheter att upprätta en korsning mellan de två sonderna. En kortsiktig lösning är böjning av cell-selektion sonden nära änden för att minimera längden på avsmalnande. I det framtida arbetet ingår att utveckla ett hölje för att omsluta de kritiska delarna av installationen för att minimera miljö påverkan. På grund av den begränsade mängden cellulära innehåll och kort förvärvs tid (~ 2-3 s) från en cell, MS/MS-analys kan endast utföras för relativt rikligt arter. Andra faktorer som påverkar detektions känsligheten är bland annat den undertryckta joniseringseffektiviteten på grund av införandet av matris tillsammans med cellen och potentiell Jon förlust genom den utökade Jon överförings slangen.

Mänsklig biologi, särskilt sjukdoms bio logi, uppfattas i allt högre grad som ett resultat av aktiviteter på individ nivå, men de traditionella analys metoderna, såsom vätskekromatografimasspektrometri (LCMS), används i allmänhet för att analysera prover som framställts från populationer av celler, medan den förvärvade molekyl ära informationen inte korrekt kan representera de kemiska processerna på individ-cellnivå. Dessa standard, traditionella metoder är oförmögna att urskilja effekterna av cellulär heterogenitet på en analytisk mätning, och processen att förstöra och blanda cellerna för att förbereda lysat potentiellt leder till förändring eller förlust av cellulära komponenter1,2. Dessa begränsningar av traditionella metoder är särskilt viktiga i analysen av patient celler, där de erhållna proverna kan innehålla en komplex blandning av många olika cell typer. För att övervinna dessa brister, är encelliga molekyl ära analys metoder, inklusive Single cell masspektrometri (SCMS) metoder, alltmer utvecklas och tillämpas på bio analys, särskilt av cellulära metaboliter och låg molekyl vikt biomoleculer3,4.
Den första SCMS tekniker som utvecklats används vakuum-baserade tekniker för att utföra analyserna under icke-omgivande förhållanden2,5,6,7,8,9, 10,11. Icke-ambient SCMS tekniker kan analysera cellulära lipider och metaboliter, men kräver prov förbehandling under konstgjorda förhållanden, och därför är inte lämpliga för Real tids analys. Prov berednings processen för icke-ambient analys omfattar tillsats av mat ris komponenter, och denna beredning kan förändra cellulära komponenter från deras naturliga miljö12. Därför används ambient masspektrometri (MS) tekniker, som inte kräver ett vakuum för provtagning miljö, för att analysera celler i en nära-Native miljö. Att inte ha en vakuum miljö möjliggör mångsidighet i experimentell design; kameror kan läggas till för att övervaka den cellulära processen och mjukare joniseringstekniker kan kombineras med separations tekniker för att få bättre information från varje Single-cell experiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
Den Single-Probe SCMS metoden är en omgivande teknik som analyserar levande, däggdjurs cancer cellinjer i en nära-Native miljö21,43,44,45,46. Dessutom har enheten med en sond använts för andra masspektrometriska tillämpningar, inklusive analys av extracellulära molekyler i multicellulära sfäroider och MS Imaging av vävnader47,48,49 ,50,51,52. Men eftersom cell immobilisering på substrat krävs för denna metod, SUS pensions celler kan inte analyseras direkt med denna teknik3,53. Därför kunde Single-Probe SCMS system inte direkt användas för att prova icke-anhängare enstaka celler, såsom icke-anhängare cellinjer eller SUS pension celler isolerade från patientens blod eller andra kropps vätskor54. I detta arbete är en integrerad cell manipulation plattform (ICMP) tillsammans med Single-Probe SCMS teknik för att analysera levande, SUS pension celler on-line med minimal prov beredning (figur 1)46. ICMP består av ett inverterat Mikroskop för att övervaka cell val, en sond för cell val av glas, en mikroinjektor för att fånga enskilda flytande celler, en uppvärmd platta för att bibehålla cellulär temperatur, två cell manipulation system för att kontrol lera rumsliga förflyttning av både sonden för val av glas cell och en enda sond, och ett digitalt mikroskop för att observera cell överföring från sond spetsen för cell urval till den enda sond spetsen. Tillverkningen av single-Probe är detaljerad i tidigare publikationer och kommer inte att behandlas här21,48. ICMP/Single-Probe systemet är kopplat till en hög upplöst masspektrometer. Denna integrerade installation möjliggör provtagning av identifierade enstaka celler från komplexa biologiska prover med minimala effekter från mat ris molekyler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetontrile</td>
			<td>Millipore Co.</td>
			<td>AX0145-1</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram Vario</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6221</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper wire</td>
			<td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td>
			<td>Dead soft, round, 20 guage, 25 ft</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereomicroscope</td>
			<td>Shenzhen D&#38;F Co.</td>
			<td>Supereyes T004</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micropipette, 1-5 &#181;L</td>
			<td>Rochester Scientific</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual bore quartz tubing, 1.120&#34;x0.005&#34;x12&#34;</td>
			<td>Friedrich &#38; Dimmock, Inc.</td>
			<td>MBT-005-020-2Q</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>Part No. 20945</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cell manipulation system</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Transferman NK517800397-U.R.</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External nut</td>
			<td>VALCO*CHEMINERT</td>
			<td>EN1</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>399388-500ML</td>
			<td>Sampling solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 40 &#181;m, OD: 100 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td>Single-probe fabrication, conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary, ID: 50 &#181;m, OD: 150 &#181;m</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150015</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>SH3006603</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline MicroFilter</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-520</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED UV lamp</td>
			<td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td>
			<td>LY-C240</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ Orbitrap XL</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>MF-9</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microunion</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>M-539</td>
			<td>Conductive union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1576</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>1577</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35x10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-334</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0780-50L</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>Narishige, Co.</td>
			<td>Model PT-A</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PSM-2120</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI, 1X with Corning glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-bore tubes</td>
			<td>Boralex</td>
			<td>5065</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel ferrules, for 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>VHP-200-01x</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tubing, 1/32x 205 &#181;m x30 cm</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science LLC</td>
			<td>U-1128</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 250 &#181;L</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725LTN250UL</td>
			<td>Sampling syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>690160</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo LTQ XL ion source interface flange</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PB5500</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>55R30N</td>
			<td>ICMP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cutter, for 1/16&#34; stainless steel</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>58692-U</td>
			<td>Ion transfer tube fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB digital photography microscope</td>
			<td>dx.com</td>
			<td>SO2 25~500X</td>
			<td>Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV curing resin</td>
			<td>Prime Dental</td>
			<td>Item No. 006.030</td>
			<td>Single-probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 720</td>
			<td>Cell-selection probe fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage housing</td>
			<td>PicoChip</td>
			<td>PCH-A00120</td>
			<td>ICMP/MS interface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire cutter</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>4 1/2 in end nipper</td>
			<td>Conductive union setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells

Single cell masspektrometri (SCMS) möjliggör känslig detektering och noggrann analys av breda spektrum av cellulära arter på individ-cell nivå. Single-Probe, en Micro provtagning och jonisering enhet, kan kombineras med en masspektrometer för on-line, snabb SCMS analys av cellulära bestånds delar under omgivnings förhållanden. Tidigare användes Single-Probe SCMS-tekniken främst för att mäta celler immobiliserade på ett substrat, vilket begränsar de typer av celler för studier. I den aktuella studien, Single-Probe SCMS-teknik har integrerats med en cell manipulation system, som vanligt vis används för provrörsbefruktning. Denna integrerade cell manipulation och analys plattform använder en cell-urval sond för att fånga identifierade enskilda flytande celler och överföra cellerna till Single-sond spetsen för Micro Lys, följt av omedelbar masspektrometri analys. Denna infångnings-och överförings process avlägsnar cellerna från den omgivande lösningen före analysen, vilket minimerar introduktionen av mat ris molekyler i masspektrometrianalysen. Denna integrerade installation kan SCMS analys av riktade patientisolerade celler som finns i kropps vätskor prover (t. ex., urin, blod, saliv, etc.), vilket möjliggör potentiella tillämpningar av SCMS analys för Human medicin och sjukdoms bio Logi.

Först, obehandlade K562 celler används för att fastställa den experimentella metoden. I en typisk SCMS experiment, uppenbara förändringar av massa spektra kan observeras från att överföra en cell, under upptäckten av cellulära innehåll, och efter avslutad mätningen (figur S1). Tre vanliga cellulära lipidtoppar (fosfatidylkolin, PC), inklusive PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), och PC (38:5) (m/z 808,583), övervakas för att säkerställa att cellen överförs framgångs rikt och cellulära innehållet detekteras (figur S2)21,43,46,55,56. Om lipidtoppar inte ses inom 5 s, är mineral olje nivån i microinjektorn ändras för att minska sug hålla cellen vid cell-urval sond spetsen; försiktighet måste iakttas så att ingen mineral olja trycks ut från cell urvals sonden. Identiteten för många datorer i massa intervallet m/z 750-850 bekräftas med MS/MS på obehandlade celllysat prover (figur 3, figur S2, tabell 1)46.
K562 celler utsätts också för behandling med olika läkemedels föreningar för att utöka mångsidigheten hos metoden. K562-celler inkuberas med gemcitabin (1 μM) och Taxol (1 μM) för 1 h och OSW-1 (100 nM, 1 μM) i 4 h respektive 2 h. Cellerna tvättas sedan med PBS för att minimera upptäckten av läkemedels föreningar från extracellulära innehåll. Matrisens bidrag (t. ex. joner från cell odlings mediet, PBS och lösnings medel) till Mass spektrum av cellulära innehåll kan elimineras genom data subtraktion, på grund av deras signifikant olika Jon signaler (figur S3). Alla tre läkemedels föreningarna detekteras med hjälp av ICMP/Single-Probe MS Setup (figur S4)46. Dessa resultat tyder på att denna metod kan användas för att studera intracellulära lipider, droger, och metaboliter på encellig nivå från celler i lösning i en nära-Native miljö.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> I figur 1. Experimentell inställning för enstaka SUS pension cell MS experiment. (A) den integrerade cell manipulations PLATTFORMEN (ICMP) tillsammans med en masspektrometer. (B) Schematisk för analys av suspenderade celler. (C) experimentell vy av K562 celler som skall väljas med hjälp av cell urvals sonden. Omtryckt med tillstånd från Standke et al.46. Copyright 2019 amerikanska kemiska föreningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> I figur 2. Bilder av en modifierad singel-sond och en cell-urval sond används för enstaka SUS pension cell MS experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> I figur 3. Inzoomat Mass spektrum från en enda cell som visar den representativa arten (m/z 750-850). Kemiska strukturer bekräftas med MS/MS-analys (figur S1). Omtryckt med tillstånd från Standke et al46. Copyright 2019 amerikanska kemiska föreningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Läkemedels molekyl*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Mass fel (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabin + H] +
</td>
			<td>264,076</td>
			<td>11,32</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol + na] +
</td>
			<td>876,318</td>
			<td>2,74</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 + na] +
</td>
			<td>895,445</td>
			<td>0,89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellulära lipider</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:4) + H] +
</td>
			<td>754,535</td>
			<td>3,71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:3) + H] +
</td>
			<td>756,551</td>
			<td>3,44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (34:2) + H] +
</td>
			<td>758,569</td>
			<td>0,66</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:5) + H] +
</td>
			<td>780,551</td>
			<td>3,07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:4) + H] +
</td>
			<td>782,568</td>
			<td>2,17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (36:3) + H] +
</td>
			<td>784,585</td>
			<td>0,64</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:7) + H] +
</td>
			<td>804,551</td>
			<td>4,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:6) + H] +
</td>
			<td>806,567</td>
			<td>2,48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:5) + H] +
</td>
			<td>808,583</td>
			<td>2,72</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (38:4) + H] +
</td>
			<td>810,601</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC (40:7) + H] +
</td>
			<td>832,583</td>
			<td>3,12</td>
		</tr>
</tbody></table>I tabell 1. Identifierade cellulära komponenter med hjälp av ICMP/Single-Probe setup. Upptäckten av alla läkemedels substanser bekräftades genom att jämföra MS/MS-resultaten med standard sammansättningen.

Watch this Scientific Journal Video about Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells at JoVE

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

En integrerad cell manipulation plattform är utvecklad för användning i samband med en enda sond masspektrometri setup för on-line analys av enskilda SUS pension celler under omgivnings förhållanden.

Integrerad cell manipulation Platform tillsammans med Single-Probe för masspektrometri analys av droger och metaboliter i singel SUS pension celler

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Eftersom denna metod analyserar celler från lösning, kan den användas för att studera celler i en nära infödd miljö. Detta inkluderar analys av patienten härledda cell prover. Denna teknik kräver liten till ingen provberedning av celler.Därför kan vi analysera enskilda celler online under omgivande förhållanden, vilket gör att vi kan utforska cellulär heterogenitet. Denna teknik kan tillämpas för att studera flytande tarmbiopsier från en mängd olika sjukdomsstater, eftersom den kan analysera olika typer av celler direkt isolerade från patientprover. För att omvandla enstaka borrglasrör till en avsmalnande sond med en skarp spets, placera först ett enda borrglasrör i klämmorna på en vertikal pipetthållare, centrera glaset med avseende på värmespolen och dra åt för att säkra röret på plats.Värmespolen består av en 18 gauge nickel krom motstånd tråd coiled runt en metall stav 2,5 gånger. Ställ in glasslangen med temperaturprogram 19.5. Ställ solenoidkolven på fyra.Utlösa solenoiden för att dra i glasslangen. Detta steg skapar två sonder smält vid spetsen. Använd tröjor för att skära ungefär en millimeter bort från spetsen på varje sond, vilket skapar en öppning på cirka 10 mikrometer i diameter vid sondspetsen.För att böja glassonden för enkel koppling till ICMP, single probe SCMS inrättas. Först ställa in en pulled glas sond i mikroforge. Placera toppen cirka tre millimeter över platinavärmetråden.Därefter, vrid värmen på platinatråden till 30%av maxtemperaturen. Böj sonden ungefär 45 grader från ursprungsläget. Placera den inverterade mikroskopmikronsktorn i två cellmanipuleringssystem på ett motoriserat bord för enkel koppling med masspektrometern.För att ställa in glascellvalsanordningen, sätt in glascellsvalssonden inuti metallhållaren på mikroinjektorn genom att placera den långa glidningen i kapillärhållaren och dra åt skruven för att fästa sonden på plats. Placera sondspetsarna vinklade parallellt med den uppvärmda plattan. Säkra mikroinjektorns metallhållare i cellmanipuleringssystemet.Placera sedan sondspetsen nära mitten av det inverterade mikroskopljuset. Säkra glasglaset som innehåller den enda sonden i cellmanipuleringssystemets armklämma. Anslut lösningsmedlet som ger kapillär till en ledande förening genom att placera kapillären i hylsan på plast ferrule och finger åtdragning av montering.Anslut den andra sidan av den ledande unionen till en kapillär som är ansluten till en spruta som innehåller provtagningslösningsmedlet genom att sätta kapillären i hylsan och dra åt inpassningen. Använd acetonitril med 0,1%myrsyra som provtagningslösningsmedel i dessa experiment. Säkra sprutan i sprutpumpen på masspektrometern.Placera nanoelektrosprayjonisationen eller nano ESI-emittern ungefär en millimeter till öppningen av det utökade jonöverföringsröret. Använd cellmanipulationssystemet för att kontrollera den enda sondens spaciala rörelser och placera nano ESI-emittern centralt framför den utökade jonöverföringsslangen. Pipettera cellerna från cellodlingskolven till ett centrifugrör på 15 milliliter.Snurra cellerna på 400 gånger G i 37 grader Celsius i fem minuter och kasta supernatanten. Resuspend cellerna i fyra milliliter av RPMI medium som innehåller läkemedelsföreningen vid önskad behandlingskoncentration. Anpassa de experimentella parametrarna för masspektrometern.Under instrumentprogramvarans skanningslägesrubrik väljer du definiera skanning. Använd en upplösning på 60, 000 vid M över Z 400, en mikroskan 100 millisekunder maximal injektionstid och automatisk förstärkningskontroll på. Välj flödeshastigheten på 150 nanoliter per minut under sprutpump.Välj NSI källa och tillämpa en spänning på cirka 4,5 kilovolt. Sätt på det inverterade mikroskopet i 40 gångers förstoring som valts för både toppplattan och bottenlinsen. Anslut den till USB-porten på en bärbar dator för att fånga live video-flöden.Sätt på den uppvärmda plattan och ställ in den på 37 grader Celsius. På datorn går du till fliken förvärva data och väljer kontinuerligt under förvärvad tid. För att förbereda provet för analys, pipettera två till tre av provet i locket på en liten petriskål.Placera provet i mitten av ljuset från det inverterade mikroskopet ovanpå den uppvärmda plattan. Förbered glascellsvalssonden för analys. Använd cellen manipulation systemet för att flytta sonden så dess topp är fokuserad under inverterade microcsope i samma plan som cellerna.Använd cellmanipulationssystemet för att flytta cellmarkeringssondspetsen till en riktad cell för analys. Denna process övervakas med hjälp av det inverterade mikroskopet. Vrid försiktigt handtaget på mikroinjektorn för att justera mineraloljans position inuti slangen.En mild sug tillhandahålls av mikroinjektorn för att säkra den riktade cellen till cellens valsondspets. Använd cellmanipulationssystemet för att flytta cellen vid cellselektriseringssondspetsen till den enda probspetsen med hjälp av ett digitalt mikroskop fokuserat på den enda sondspetsen för att övervaka denna process. Obehandlad K-562 celler används för att fastställa den experimentella metoden.I ett typiskt SCMS-experiment kan uppenbara förändringar av massspektra observeras från att överföra en cell under detektion av cellulärt innehåll och efter avslutad mätning. Tre vanliga cellulära lipidtoppar inklusive PC 34:4, PC 36:4 och PC 38:5 övervakas för att säkerställa att cellen överförs framgångsrikt och cellulärt innehåll identifieras. Identiteten för många pc i massintervallet 750 till 850 bekräftas med hjälp av MSMS på obehandlade cell lysate prover.Med hjälp av ICMP enda sond MS inrättas, Gemcitabine, Taxol och OSW1 upptäcktes efter inkubation med K-562 celler. Dessa resultat tyder på denna metod kan användas för att studera intracellulära lipider, droger, och metaboliter på encellsnivå från celler i lösning i en nära infödda miljö. Kom ihåg att säkert placera glascellsvalssonden i universalpipethållaren så att sug kan appliceras på ett tillfredsställande sätt.Denna metod kan också tillämpas på patienten härledda prover för att skilja skillnader mellan cellulära metaboliter från en mängd olika celltyper, vilket gör att vi kan få en bättre förståelse av dessa sjukdomsstater. Efter att ha utvecklat denna metod, vi skulle kunna genomföra kvantifiering av läkemedelsföreningar på encellsnivå. När du arbetar med celler är det viktigt att ha lämplig personlig skyddsutrustning inklusive labbrock och handskar.Ytterligare ögonförslitning kan användas vid arbete med glas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Oriktade Metabolomics från biologiska källor Använda Ultraperformance vätskekromatografi-högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av växt Wall Heteroxylans Använda enzym, Chemical (metylering) och fysiska (masspektrometri, kärnmagnetisk resonans) Tekniker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering av Ambient masspektrometri med användning av schlierenfotografering

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

En behändig metod för extraktion och analys med vätskekromatografi högtrycks av katekolamin signalsubstanser och deras metaboliter

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Realtid andedräkt analys med hjälp av sekundära Nanoelectrospray jonisering kopplat till hög upplösning masspektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kapillärelektrofores Mass Spectrometry för Single-cell metabolomik i Live groda (Xenopus laevis) embryon

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Kovavt märkning med Diethylpyrocarbonate för studier av protein högre order struktur av masspektrometri

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Kapillärelektroforesbaserat väte/deuteriumutbyte för konformationskarakterisering av proteiner med masspektrometri uppifrån och ner

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Cell-Lineage guidad masspektrometri proteomik i det utvecklande (groda) embryot

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...