Name: induced differentiation of m cell-like cells in human stem cell-derived ileal enteroid monolayers
Uploaded: 2019-07-26T14:00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIAID U19AI131126 ד ר Isberg (בית הספר לרפואה של האוניברסיטה של טאפטס) וד ר קפלן (אוניברסיטת טאפטס); (JM הוא מנהיג פרויקט 2) ו NIAID R21AI128093 ל-JM. ACF נתמך בחלקו על ידי NIAID T32AI007077. התמיכה ב-סאב ו-MKE נתמכה על ידי NIAID U19AI116497-05. אנו מודים לחברי מעבדת Mecsas, מעבדת Ng, וד ר Isberg בבית הספר לרפואה של האוניברסיטה של טאפטס לדיונים שימושיים. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ההדמיה הקונקלית בוצעה במרכז טאפטס לחקר מדעי המוח, P30 NS047243.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת טאפטס IBC ו IRB.
1. גרימת בידול התא באמצעות המעי האנושי בידור-מונאולאיירס נגזר
הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-ileal בידור שנגזר מביופסיה של רקמת האדם. נא לעיין פרוטוקולים שפורסמו עבור שיטות על איך לצמוח ומעבר תאים אלה18,24. השיטות הבאות לפיתוח מונאולאיירס הותאמו מ-Zou et al.24. שיטות לגרימת תאים M ב התרבויות הנגזרות ileal, הותאמו מדיווחים קודמים21,22,23. כל העבודות מתבצעות במכסה התרבותי של הרקמה הסטרילית, והincubations באינקובטור של תרבות הרקמה כמצוין. ראה את הטבלה של חומרים הדרושים כדי להכין ileal בידור monolayers ומדיה שונים.
<ol><li>הגדל ileal בידור עבור 4-10 ימים ב מטריצה החילוץ (ECM) (ראה טבלה של חומרים) (איור 1), בהתאם לקצבי הצמיחה הפנימיים שלהם, לפני זריעה על טרנסולס.</li>
	<li>ממברנות כיסויים
	<ol>
<li>הניחו את מספר הטרנסוולס הרצוי בצלחת של 24 שעות ביצירת מערכת דו-קאמרית.</li>
		<li>לדלל ECM 25-מקפלים קר מלוחים סטרילי באגירה המלח (PBS) ולהוסיף 100 μL של פתרון קר מדולל לתוך כל תא עליון על הקרום. הערה: את הפתרון ECM ומדולל יש לשמור על הקרח עד מיד לפני חיבור.</li>
		<li>כסו את הצלחת 24-באר עם מכסה ומניחים את הצלחת לתוך חממה לתרבות רקמות ב 37 ° צ' עבור 2 h כדי להתיר מיצוק ECM על הקרום.</li>
		<li>לאחר 2 h, להסיר את הצלחת מן החממה ומקום בשכונה תרבות רקמה. שימוש בפינצטה סטרילית, היפוך כל transwell כדי להסיר בעדינות את הפתרון הנותר. הניחו לקרומים להתייבש בכיפה עם המכסה הפתוח בזמן איסוף התאים (שלבים 1.3.1-1.3.11).</li>
	</ol></li>
	<li>הנתק את בידור ה-ileal לתאים בודדים
	<ol><li>הסר את הצלחת של ileal בידור מן החממה ולהסיר בעדינות את מדיית התרבות מכל הבאר על ידי שאיפה ואקום או עם פיפטה. הערה: אחד היטב של בידור באמצעות המכיל כ 100 ציסטות בריאות מספיקה זרע 1.5-2 בארות.</li>
		<li>להוסיף 500 μL של קרח קר 0.5 mM השפעת החומצה (EDTA) על כל טוב המכיל את מזהי ileal מושעה ECM לשבור את ECM. פיפטה למעלה ולמטה במרץ עם P1000 ttor להגדיר ב 500 μL כדי לשבור ECM ובכך לשחרר את ileal הפתרון. כדי לשפר את פירוק ECM, לאחר ליטוף, לנענע את הצלחת במרץ 4 ° צ' עבור 30 דקות.</li>
		<li>לאסוף את הפתרון מכל טוב לתוך 15 מ ל שפופרות חרוט. הערה: איסוף עד 10 בארות לכל 15 מ"ל שפופרת חרוטי עבור אוסף מיטבי של תא יחיד.</li>
		<li>גלולה את התאים בצנטריפוגה ב 140 x g ו 4 ° צ' עבור 5 Min. גלולה צריך להיות גלוי אבל יכול בקלות להיות מחוץ, כך לאט להסיר את supernatant על ידי שאיפה ואקום או עם פיפטה. הערה: אם מודאגים לגבי אובדן של גלולה ותאים, השתמש בפיפטה ושמור את הסופרנטנט בצינור נפרד.</li>
		<li>כדי לעכל את הקשרים הדוקים הצומת ולשבור את ileal בידור לתוך תאים בודדים, להשעות את הגלולה ב 500 μL של טמפרטורת החדר טריפסין לכל 5 בארות שנאספו בשלב 1.3.3. באמצעות P1000, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשלול את הגושים ואת המדגירה את הצינורות באמבט מים 37 ° c עבור 5 דקות או פחות. הערה: אופטימיזציה יש צורך לקבוע את כמות הזמן המתאים הנדרש כדי לאתר את הצינורות כך התאים הם שבורים אבל לא מעל טריסיזציה לנקודה שהם מתים. השתמש ב1.3.9 הכחול בשלב הפעולה כדי להבטיח שהתאים הם מעשי לאחר הטיפול בטריפסין.</li>
		<li>הוסף 1 מ ל של DMEM מתקדם/F12 עם 10% סרום שור עוברי (FBS) לכל 500 μL של טריפסין כדי להשבית את טריפסין.</li>
		<li>פיפטה למעלה ולמטה עם P1000 להגדיר ב 500 μL לפחות 50 פעמים נגד הצד של צינור החרוט כדי להפוך את הגושים הנותרים לתאים בודדים.</li>
		<li>מניחים מסננת תא 40 יקרומטר על גבי 50 mL ו להוסיף 1 mL של dmem תקדם/F12 עם 10% fbs להרטיב את מסננת התא. פיפטה תא הבולם היחיד מ 15 מ ל חרוט על המסננת. שטוף את המסננת עם 1 מ ל של DMEM תקדם/F12 עם 10% FBS.</li>
		<li>העבר את התאים שעברו את מסננת התא מן 50 mL חרוט לתוך צינור חדש 15 mL חרוט. במהלך 1.3.10 שלב צנטריפוגה, הגלולה הסלולרית יהיה בקלות יותר לראות בתוך 15 מ"ל צינור חרוט. לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר. השתמש בכחול טרי, כדי לוודא. שהתאים עדיין בחיים בדרך כלל, הכדאיות של > 95% נצפתה.</li>
		<li>בזמן ספירת התאים, צנטריפוגה את התאים בצינור החדש של 15 מ ל ב-400 x g וטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. גלולה תא צריך להיות גלוי. הסירו בזהירות את הסופרנטנט עם הפיפטה, והצלתי שוב את הסופרנטאנט במקרה שהגלולה הופכת להיות מחוצה.</li>
		<li>ההכנה שונה מדיה צמיחה מלאה25 (mcmgf + מדיה) שיושלם עם 10 Μm Y-27632. השהה מחדש את התאים הפלתד ב-2.5 x 10 תאים/200 μL בתוך MCMGF +. ראה הערות בדיון אודות אופטימיזציה של מספר זריעת תאים. הערה: MCMGF + מדיה היא DMEM תקדם/F12 עם 75% L-Wnt3a התקשורת הממוזגת, 10% R-לחתן מדיה ממוזג, 5% המדיה ממוזג, 1x B27 תוספת, 1x N2 תוספת, 1 מ"מ N-acetylcysteine, 50 ng/mL העכבר רקומביננטי EGF, 500 nM-8301, 10 ננומטר [Leu15]-גסטרין 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ גלוטמקס, ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי).</li>
		<li>ודא כי ממברנות ECM מצופה הכין בשלב 1.2 התייבשו לחלוטין, כפי שמוערך על ידי העין. לשטוף את התא העליון עם 200 μL של MCMGF +. הוסף 200 μL של פתרון התא לתוך כל תא עליון.</li>
		<li>הוסף 700 μL של MCMGF + עם 10 μM Y-27632 לכל תא תחתון. מניחים את הצלחת ב 37 באינקובטור התרבות בשנת צלסיוס עם 5% CO2.</li>
		<li>לאחר יום אחד של צמיחה, להסיר את המדיה מהתא העליון ולהחליף עם 200 μL של טרי MCMGF +, כדי למנוע צמיחה של שכבות תא מרובות.</li>
	</ol></li>
	<li>החלפת אמצעי בינוני
	<ol>
<li>לאחר monolayers הם ~ 80% confluent, בדרך כלל בין ימים 1-3 לאחר זריעה, להחליף מדיה basolateral עם בידול מדיה (DM) עבור בארות בקרה (ראה שלב 1.4.2 לפרטים נוספים) או עם מדיית התא M עבור M האינדוקציה תא בארות (ראה שלב 1.4.3 לפרטים נוספים). החלף את המדיה בחדר העליון עם DM עבור שני התנאים. הערה: מיט הוא מתקדם DMEM/F12 עם 5% מדיה ממוזג, 1x B27 תוספת, 1x N2 תוספת, 1 מ"מ N-acetylcysteine, 50 ng/mL רקומביננטי EGF, 500 nM-8301, 10 ננומטר [Leu15]-גסטרין I, 10 מ"מ מאגר HEPES, 2 מ"מ גלוטמקס, ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי ). M מדיה תא הוא DM בתוספת עם 200 ng/mL RANKL ו 50 ng/mL TNFα.</li>
		<li>עבור בארות שליטה כי לא צריך להכיל M תאים, להוסיף 200 μL של מיט אל החדר העליון ו 700 μL DM לחדר התחתון.</li>
		<li>כדי לגרום לתאי M, להוסיף 200 μL של מיט אל החדר העליון ו 700 μL של מדיית תא M לחדר התחתון.</li>
		<li>החליפו את המדיה כל יומיים. עבור בארות בקרה, להחליף מיט בחדרי העליון והתחתון. עבור בארות תא M, להחליף מיט בחדר העליון ומדיה תא M בחדר התחתון. הערה: ביום 7 הודעה לאחר זריעת תאים, תאי M הם המושרה באופן מלא ב monolayers.</li>
	</ol></li>
</ol>2. אימות מידול התא באמצעות רביעיית-PCR
הערה: בצע את העבודה הבאה בשטח ספסל סטרילי מבית RNAse. ראה טבלת חומרים לרשימת חומרים מועדפים לרביעיית ה-PCR.
<ol><li>להסיר את המדיה מתאי העליון והתחתון ולשטוף את התא העליון 2x בעדינות עם 300 μL של טמפרטורת החדר PBS.</li>
	<li>הוסף 300 μL של Trizol לכל תא עליון. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. התראה: לבשו כפפות והגנה על העין בעת שימוש Trizol כדי למנוע מגע עם העור כפי שמצוין הוראות היצרן.</li>
	<li>בינתיים, תוויות מיקרוצנטריפוגה התווית עבור כל טוב ולהוסיף 700 μL של Trizol לכל צינור.</li>
	<li>לאסוף תא המגון לאכול על ידי pipetting למעלה ולמטה 3x בעדינות עם P1000 ולהעביר את התוכן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המקביל. מערבולת עבור 5 s לערבב.</li>
	<li>שמרו את הדגימות בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות נוספות. ואז לאחסן ב-80 ° צ' עד חודש אחד.</li>
	<li>בצע את מתודולוגיית רביעיית ה-PCR הסטנדרטית לבידוד RNA, טיפול DNase, תמלול הפוכה ותגובות לרביעיית ה-PCR. יש לעיין ברשימת החומרים התחל.</li>
</ol>3. אימות תא בידול על ידי Immunofluorescence
הערה: שמרו תמיד על החדר התחתון של הלוחית המלאה ב-PBS, כך שקרום הקרומים יישאר רטוב. הליך זה מבוצע על הספסל. ראה טבלת חומרים לקבלת רשימה של חומרים מועדפים לאימונולואורסנס.
<ol><li>להסיר את המדיה מהתא העליון ולשטוף 2x בעדינות עם 300 μL של טמפרטורת החדר PBS. הוסף 100 μL של טמפרטורת החדר 4% כיתה בערוץ PBS לחדר העליון. מכסים את הצלחת בנייר כסף ומאפשרים לעמוד 25 דקות בטמפרטורת החדר. . הסירו 4% לכיוון הבמה התראה: 4% כלפי התחתית צריך להיות מושלך כראוי כפסולת כימית מסוכנת.</li>
	<li>לשטוף את החדר העליון 3x עם 300 μL של טמפרטורת החדר PBS. בשלב זה, הדגימות יכולות להישאר ב -4 ° c עד חודש לפני הצביעת. לאחר מוכתם, דגימות צריך להיות דמיינו בתוך שבוע לתמונות באיכות הטובה ביותר.</li>
	<li>מודטה the monolayers עם 100 μL של 5% בסרום בקון (BSA) הומס PBS עבור 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר כדי לחסום את monolayers.</li>
	<li>הכינו פתרון נוגדן ראשוני GP2 בשנת 1% BSA ב-PBS בדילול של 1:100. הוסף 100 μL לכל היותר. . כתם ל -1 בטמפרטורת החדר בחושך הסר את הפתרון. הערה: אין לחדור את monolayers לפני הכתם העיקרי עבור GP2 מתרחשת מכיוון אופטימלית הראשי GP2 פני השטח של תאי M מושגת ללא חדירות.</li>
	<li>לשטוף את התא העליון 3x פעמים עם 300 μL של טמפרטורת החדר PBS.</li>
	<li>להכין את הפתרון כתם משני של מתויג בקצב עז נגד עכבר IgG ב 1:200, phalloidin ב 1:100 ו DAPI ב 1% BSA + 0.1% טריטון ב-PBS. הוסף 100 μL לכל היותר. כתם 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הערה: טריטון מתווסף לפתרון כתם משני כדי לחלחל את התאים במהלך שלב זה עבור הכתם phalloidin הנכון.</li>
	<li>שטוף 3x עם 300 μL PBS.</li>
	<li>מניחים 5 שטיפת μL של פתרון ההרכבה (טבלת חומרים) על מגלשת זכוכית. להסיר את הבאר מ 24 צלחת ולהפוך. חותכים בזהירות את הקרום מתוך הבאר באמצעות אזמל. הצב את הקרום עם התאים הפונים כלפי מעלה אל ה-droplet של הפתרון הגובר על שקופית הזכוכית. הוסף 10 μL של פתרון ההרכבה על החלק העליון והמרכז של הקרום ומניחים שמיכות על גבי כדי לאטום את הקרום בין שקופית הזכוכית לבין coverslip.</li>
	<li>יבש את השקופיות בטמפרטורת החדר בחשכה עבור 24 שעות. שקופיות ויטראז צריך להיות מדמיינו על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בתוך שבוע 1 לאחר כתמים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kraehenbuhl, J. P., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+M+cells:+differentiation+and+function.">Epithelial M cells: differentiation and function.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 301-332 (2000).</li><li>Neutra, M. R., Frey, A., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+M+cells:+gateways+for+mucosal+infection+and+immunization.">Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization.</a> Cell. 86 (3), 345-348 (1996).</li><li>Nakamura, Y., Kimura, S., Hase, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cell-dependent+antigen+uptake+on+follicle-associated+epithelium+for+mucosal+immune+surveillance.">cell-dependent antigen uptake on follicle-associated epithelium for mucosal immune surveillance.</a> Inflammation and Regeneration. 38, 15 (2018).</li><li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer's+patch+M+cells.">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infection and Immunity. 66 (3), 1237-1243 (1998).</li><li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium,+Listeria+monocytogenes,+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer's+patches.">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infection and Immunity. 66 (8), 3758-3766 (1998).</li><li>Jones, B. D., Ghori, N., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+initiates+murine+infection+by+penetrating+and+destroying+the+specialized+epithelial+M+cells+of+the+Peyer's+patches.">Salmonella typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the specialized epithelial M cells of the Peyer's patches.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (1), 15-23 (1994).</li><li>Marra, A., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasin-dependent+and+invasin-independent+pathways+for+translocation+of+Yersinia+pseudotuberculosis+across+the+Peyer's+patch+intestinal+epithelium.">Invasin-dependent and invasin-independent pathways for translocation of Yersinia pseudotuberculosis across the Peyer's patch intestinal epithelium.</a> Infection and Immunity. 65 (8), 3412-3421 (1997).</li><li>Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+M+cells.">Intestinal M cells.</a> Journal of Biochemistry. 159 (2), 151-160 (2016).</li><li>Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+by+Peyer's+patch+lymphocytes+of+human+enterocytes+into+M+cells+that+transport+bacteria.">Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria.</a> Science. 277 (5328), 949-952 (1997).</li><li>Gullberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+specific+markers+and+particle+transport+in+a+new+human+intestinal+M-cell+model.">Expression of specific markers and particle transport in a new human intestinal M-cell model.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 279 (3), 808-813 (2000).</li><li>Giannasca, P. J., Giannasca, K. T., Leichtner, A. M., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+M+cells+display+the+sialyl+Lewis+A+antigen.">Human intestinal M cells display the sialyl Lewis A antigen.</a> Infection and Immunity. 67 (2), 946-953 (1999).</li><li>Jang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+villous+M+cells:+an+antigen+entry+site+in+the+mucosal+epithelium.">Intestinal villous M cells: an antigen entry site in the mucosal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6110-6115 (2004).</li><li>Beloqui, A., Brayden, D. J., Artursson, P., Preat, V., des Rieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+intestinal+M-cell-like+model+for+investigating+particle,+antigen+and+microorganism+translocation.">A human intestinal M-cell-like model for investigating particle, antigen and microorganism translocation.</a> Nature Protocols. 12 (7), 1387-1399 (2017).</li><li>Martinez-Argudo, I., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+translocates+across+an+in+vitro+M+cell+model+independently+of+SPI-1+and+SPI-2.">Salmonella translocates across an in vitro M cell model independently of SPI-1 and SPI-2.</a> Microbiology. 154 (Pt 12), 3887-3894 (2008).</li><li>Lee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lab-to-lab+variability+in+Caco-2+permeability+assays.">Quantitative analysis of lab-to-lab variability in Caco-2 permeability assays.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 114, 38-42 (2017).</li><li>Mabbott, N. A., Donaldson, D. S., Ohno, H., Williams, I. R., Mahajan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfold+(M)+cells:+important+immunosurveillance+posts+in+the+intestinal+epithelium.">Microfold (M) cells: important immunosurveillance posts in the intestinal epithelium.</a> Mucosal Immunology. 6 (4), 666-677 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+is+necessary+and+sufficient+to+initiate+development+of+antigen-sampling+M+cells+in+the+intestinal+epithelium.">RANKL is necessary and sufficient to initiate development of antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium.</a> Journal of Immunology. 183 (9), 5738-5747 (2009).</li><li>Taylor, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin-independent+expression+of+TNF-related+activation-induced+cytokine+by+stromal+cells+in+cryptopatches,+isolated+lymphoid+follicles,+and+Peyer's+patches.">Lymphotoxin-independent expression of TNF-related activation-induced cytokine by stromal cells in cryptopatches, isolated lymphoid follicles, and Peyer's patches.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5659-5667 (2007).</li><li>de Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+patch+M+cells+derived+from+Lgr5(+)+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+&amp;#34;miniguts&amp;#34;.">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured &amp;#34;miniguts&amp;#34;.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li><li>Rouch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Functional+Microfold+(M)+Cells+from+Intestinal+Stem+Cells+in+Primary+Human+Enteroids.">Development of Functional Microfold (M) Cells from Intestinal Stem Cells in Primary Human Enteroids.</a> PloS One. 11 (1), e0148216 (2016).</li><li>Wood, M. B., Rios, D., Williams, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+augments+RANKL-dependent+intestinal+M+cell+differentiation+in+enteroid+cultures.">TNF-alpha augments RANKL-dependent intestinal M cell differentiation in enteroid cultures.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 311 (3), C498-C507 (2016).</li><li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+New+Models+to+Study+Gastrointestinal+Virus+Infections.">Human Intestinal Enteroids: New Models to Study Gastrointestinal Virus Infections.</a> Methods in Molecular Biology. , (2017).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+a+Human+and+Mouse+Intestinal+Epithelial+Cell+Monolayer+Platform.">Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>Mantis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adherence+of+IgA+to+murine+Peyer's+patch+M+cells:+evidence+for+a+novel+IgA+receptor.">Selective adherence of IgA to murine Peyer's patch M cells: evidence for a novel IgA receptor.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 1844-1851 (2002).</li><li>Rios, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+sampling+by+intestinal+M+cells+is+the+principal+pathway+initiating+mucosal+IgA+production+to+commensal+enteric+bacteria.">Antigen sampling by intestinal M cells is the principal pathway initiating mucosal IgA production to commensal enteric bacteria.</a> Mucosal Immunology. 9 (4), 907-916 (2016).</li><li>Miller, H., Zhang, J., Kuolee, R., Patel, G. B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+M+cells:+the+fallible+sentinels?.">Intestinal M cells: the fallible sentinels?.</a> World Journal of Gastroenterology. 13 (10), 1477-1486 (2007).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

כדי לפתח monolayers כי להבדיל כראוי לתוך סוגי תא המעיים העיקריים תאים M, זה קריטי להיות מודע מספר גורמים. בידור הללו יש לקצור מתרבויות ECM כי הם מובחן ויש להם שיעור גבוה של Lgr5 + תאי גזע. באופן חזותי, רוב הבקומנואידים בתרבויות ECM לא צריך להיות כהים ומרובה, וביטוי LGR5 יש לזהות בתרבויות אלה על ידי ניתוח ה-PCR. בקרת איכות של המדיה הממוזגת חיונית להפצת תרבויות מובחן לאורך זמן ויש להשלימה עבור כל אצווה של מדיה ממוזג המיוצר. בקרת איכות ניתן להשלים על ידי בדיקת אצווה חדשה של מדיה על כמה תרבויות ECM והשוואת המבנה של ileal בידור לקבוצה קודמת של מדיה במהלך שבוע. LGR5 ביטוי צריך להישאר דומה יחסית בתרבויות ileal בידור גדל בקבוצה חדשה של מדיה לעומת האצווה הקודמת.
במהלך ההכנות של ileal בידור עבור זריעה כמו monolayers, חשוב הצינורות במרץ את הפתרון התא לאחר דגירה עם טריפסין לשבור את בידור ileal לתוך תאים בודדים. גושי תאים יכולים להוביל ליצירת שכבות מרובות בעת זריעה עבור monolayers. בנוסף, זה חיוני כדי מדעית לקבוע את מספר התאים הנדרשים כדי ליצור מונאולייר עבור כל קו בידור בודדים ileal המתקבל. בדרך כלל, ערך זה יכול לנוע בין 2.5 x 105 – 5.0 x 105 תאים/גם אבל תלוי במידת של סיסטיק-בידור לא פיברוזיס בתרבויות ומשתנה עבור כל קו בודד ileal בידור. מניסיון, בידור המעי הגדול ב-ECM שנראים פחות פיברוזיס דורשים צפיפות תאים גבוהה יותר כדי להשיג monolayers. מומלץ לשטוף את התא העליון לאחר יום אחד של צמיחה על ידי ליטוף בעדינות את התקשורת למעלה ולמטה 2-3 פעמים והחלפה עם מדיית גדילה טרייה. תהליך זה פירוק תאים שנחתו על גבי תאים אחרים הפחתת הסבירות של היווצרות ריבוי שכבות. מיתוג את התקשורת בתא העליון ממדיית הצמיחה למדיית תא M כאשר monolayers הם ~ 80% confluent, אשר בדרך כלל מתרחשת ביום 2 לאחר זריעה, עוזר להשיג טוב בידול תא M. תוספת RANKL/TNFα אל החדר העליון במהלך אינדוקציה תא M אינו מוביל לפיתוח של מספר גדול יותר של תאים למונאולייר ולכן ניתן להשאיר מחוץ לתקשורת קאמרית העליון. טרנסולס של מידות נקבוביות משתנות ניתן להשתמש בפרוטוקול זה מבלי להשפיע על פיתוח תא M; עם זאת, צפיפות הזריעה של התא חייבת להיות ממוטבת עבור אלה עם גדלי נקבובית גדולים יותר. קולגן הרביעי יכול להיות מוחלף ECM כציפוי חלבון במרתף הממברנה עבור transwells או צלחות היטב אשר עשוי להיות מתאים יותר עבור יישומים מסוימים.
Ileal בידור הנגזר monolayers על transwells לספק מערכת דו-קאמרית המאפשרת יצירת הגדרה של משטחים פסגה מוגדר באסולצלעות כגון 4-5 סוגים שונים של תאי מעיים אפיתל יכול להקטז כדי לבטא סמנים פני השטח על כל בצד שנמצא במעי. ניתן להוסיף גורמים נוספים לשני הצדדים, כגון חלקיקים, חומרים מדבקים או סוגי תאים אחרים. עם זאת, עד לתאריך מספר מגבלות יישארו. כפי שמתואר, מערכת זו היא מערכת סטטית חסר זרימה פיזיולוגית, התכווצויות מעיים, ותוכן מעיים. בנוסף, הארכיטקטורה של villus-קריפטה אבודה על ידי היווצרות של מונאולייר שטוח. מערכות אלה חסרות אזורי טלאי של Peyer, תאים חיסוניים, ותאים סטרומה. בין אם העדר תאים חיסוניים וסטרומה המתגוררים באופן מקרוב מתחת לתאי M משפיע על הפולשים אשר לא נצפתה במערכת זו ותפקוד פיזיולוגי אחרים הוא אזור עתידי חשוב של חקירה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לצלחת 96-באר או תבנית מרובת הצלחות. ההליך לציפוי 96-ובכן צלחת עם ECM ו זריעה עם תאים בודדים מתוך בידור המאידים נשאר זהה עבור transwells. טיטור של צפיפות התא זריעת הנדרש כדי להשיג monolayers חייב להיעשות, אבל בדרך כלל נע בין 1.0 x 105 – 3.0 x 105 תאים/גם בפורמט 96-באר. תאי m הם המושרה על ידי החלפת מדיית הצמיחה עם מדיית תא M כאשר monolayers הם 80% confluent בדרך כלל על ידי ימים 1-3 בהתאם לצפיפות הראשונית הזרע מזריעה.
שיטה זו של הבחנה תאים M מתוך המעי החדש של מדיום מספק שיפורים משמעותיים על השיטה Caco-2. בידור מסוג ileal הם התאים העיקריים ולפחות 4-5 סוגי תאים אפיתל קיימים במערכת. בנוסף, שורות ileal בידור נגזר מאנשים שונים ניתן ללמוד לחקור כיצד גנטיקה או מחלות השפעה המדינה פיתוח תא M והתנהגות. מניפולציה נוספת של בידור ileal במהלך בידול תא M יאפשר הבנה טובה יותר של פיתוח תא M כולל אפיון תא מקודמי תאים. בסופו של דבר, מאז המנגנונים המולקולריים של תא M phagocyציטוזה ו הטרנססקיטוזה עדיין לא הבינו לחלוטין3,29, מודל זה מספק את ההזדמנות ללמוד ולהמחיש אנטיגן וספיגת חלקיקים על ידי תאי M.

M (microfold) תאים הם מיוחדים תאים אפיתל המעי נמצא בעיקר האפיתל הקשורים זקיק (מיסטים) של המעי ואזורים הלימפה קטנים כינה טלאים של Peyer1. תאי M יש קצר מיקרוical מיקרו-הרשמי והוא הפכפך עמוקות על הצד הבאסולולי שלהם, אשר מאפשר לתאי החיסון לשכון באופן צמוד לגוף התאים שלהם2. זו מורפולוגיה ייחודית מאפשרת לתאי M לדגום אנטיגן מן לומן פסגה של המעי ולספק אותו ישירות לתאים החיסוניים הבסיסיים2. בדרך זו, תאי M חשובים עבור מעקב החיסונית במעי, אבל יכול להיות גם ניצל על ידי פתוגנים עבור כניסה לתוך לאמנה קינא1,2,3,4,5, 6,7.
המחקר של תאים M הפריע מספר גורמים. ראשון, תאי M נמצאים בתדר נמוך בעכבר המעי האנושי8. במערכות התאים המתורבתות, תאי התאים של M-תאים המושרה להבדיל על ידי co-culturing קו מקוטב אדנוקרצינומה התא, caco-2, עם לימפוציטים או b מתוך הטלאים של peyer של העכבר או התא B לימפומה התא, ראג'י B9,10 . זה התוצאות בקבוצת משנה של caco-2 תאים אשר לבטא את סמני תא M sialyl לואיס אנטיגן ו uea-1 ב אפיתל מקוטב9,10. (סמנים אלה מבוטאים גם על תאי גביע ברקמות המעיים, אז כיום הם משמשים לעתים קרובות פחות כסמני תא M הסופי11,12.) זה caco-2-M תא מערכת שימש לחקר ספיגת חלקיקים וחיידקים טרנסלוקציה13,14. עם זאת, תאים Caco-2 הם קו התא הוקמה מתוך אדנוקרצינומה מעיים גדול עם גורם מייסד כי מקורות שונים של Caco-2 תאים להציג פנוטיפים שונים בין מעבדות15. יתר על כן, הם לא יכולים לחלוטין לכידה של רמות שעתוק של תאים M אמיתי, כפי שהם חוסר הבעה של הידוע כיום GP2 סמנים תא ו-SpiB16. לכן, מודלים נוספים מבחינה פיזיולוגית התרבות הרלוונטית נדרשים כדי להיות מסוגל ללמוד פיתוח תא של M פונקציות.
בתוך עשר השנים האחרונות, השדה של מערכות מודל בידור הנגזרות של המעי התקדם במהירות קדימה מן התגלית הראשונית כי תאי גזע מעיים נגזר ביופסיה של המעי האנושי יכול להפיץ עצמית ולחדש בתרבות מיכל בן 17 , 18. חשוב, הסרת תא גזע קידום גורמים מן התקשורת הצמיחה מאפשר אלה תאי גזע התרבויות להבדיל לתוך סוגי תאים רבים שנמצאו המעי18. יתר על כן, העבודה האחרונה מציעה את החשיבות של האיתות rankl-דרגה בפיתוח תא M במעי19,20. הקולטן דירוג הוא חבר של משפחת TNF של קולטנים כי הוא מתבטא על התאים מקודפי האפיתל במעי19 בעוד rankl (לגאת הקולטן דירוג) הוא שוחרר על ידי תאים סטרומה של הטלאים של peyer20. מאז סוגי תאים אפיתל להציג ileal בידור לא לייצר rankl, M תא בידול בתרבויות ileal בידור יכול להיגרם על ידי תוספת rankl לתקשורת התרבות21,22. הכללת TNFα במדיית התרבות מסייעת לתמוך פיתוח תא M ב-בידור מדיום23. כאן, אנו מתארים את השיטות לגרימת הבידול של תאי M ב מעיים monolayers נגזר מתוך בידור אנושי. השיטות שלנו מבוססות בחלקו על שינויים מתוך הפרוטוקולים הבאים21,22,23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 10 &#181;M 
			Final Concentration: 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>For breaking up ECM 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 0.5 M 
			Final Concentration: 0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>For excluding clumps from single cells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-8301</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: DMSO 
			Stock Concentration: 500 &#181;M 
			Final Concentration: 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td>MCMGF+ and DM Basal medium 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>For secondary stain 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>Optional secondary stain for F-actin 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 50x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00535</td>
			<td>5% for blocking solution 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 0.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle coverslips</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1157B50</td>
			<td>For mounting membrane on glass slide 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62247</td>
			<td>For secondary stain 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 100x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Treated RNAse free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP561-1</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Removal Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1906</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 proof</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EX0276-4</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-580</td>
			<td>For cutting membrane from transwells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For inactivating trypsin 
			Solvent: Advanced DMEM/F12 
			Stock Concentration: 1 
			Final Concentration: 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Mercedes Scientific</td>
			<td>MER 7200/90/WH</td>
			<td>For mounting membrane on glass slide 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 200 mM 
			Final Concentration: 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2 Antibody</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>D277-3</td>
			<td>Surface stain for M cells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 1 M 
			Final Concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum IgA</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>340-12-1</td>
			<td>For functional analysis of M cells 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 1 mg/mL 
			Final Concentration: 10 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt3a conditioned media</td>
			<td>Cell line from ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td>Refer to ATCC Product Sheet for L Wnt&#173;3A (ATCC CRL2647) for conditioned media protocol; MCMGF+ ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 75% in MCMGF+ 
			0% in DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular Matrix (ECM) 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 50 &#181;g/mL 
			Final Concentration: 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 100x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 500 mM 
			Final Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned media</td>
			<td>Cell line gift from Dr. Gijs van den Brink (University of Amsterdam)</td>
			<td></td>
			<td>Ref 30 for conditioned media protocol; MCMGF+ and DM Ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 5% in MCMGF+ 
			5% in DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2199983</td>
			<td>For fixing monolayers 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 0.16 
			Final Concentration: 0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, -Mg, -Ca</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td>Solvent for 0.5 mM EDTA 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Optional ingredient of MCMGF+ and DM 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 100x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Antifade mounting solution 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNeasy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human RANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Used to induce M cells 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 0.1 mg/mL 
			Final Concentration: 200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine TNFa</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td>Used to induce M cells 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 5 mg/mL 
			Final Concentration: 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin conditioned media</td>
			<td>Cell line from Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Refer to Trevigen Cultrex Rspo1 Cells product manual (HA-R-Spondin1 293T cell line) for conditioned media protocol; MCMGF+ Ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 10% in MCMGF+ 
			0% in DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary anti-human IgA antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>109-545-011</td>
			<td>For secondary stain 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Script IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18091200</td>
			<td>For conversion of RNA to DNA 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts, 24 well-sized</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662641</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Not required during GP2 primary stain 
			Solvent: 1% BSA 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Trypsin for breaking up enteroids into single cells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y-0503</td>
			<td>MCMGF+ ingredient on day 0 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 5 mM 
			Final Concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CATGAGAAGTATGACAACAGCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTTTCCCGCAAGACGTAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAATGTGCCTACCCACTGGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATGGCACCCACATACAGCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYZ forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGCTACTGGTGTAATGATGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYZ reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TTTGCACAAGCTACAGCATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATGCCCTTGCGTCCATAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AGGAGCAGTGTCCGTCAAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCCAGCTACTACTCGTGTGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCCTCTGTTGGGAATTGTTCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPIB forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAGCAGCCGCTTTTAGCCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPIB reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCATATGCCGGGGGAACC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induced differentiation of m cell-like cells in human stem cell-derived ileal enteroid monolayers

M (microfold) תאים של תפקוד המעי כדי להעביר את האנטיגן מן פסגה לומן לתוך טלאים של peyer בבסיס ולאמה קיננה שבו תאים חיסוניים מתגוררים ולכן לתרום חסינות רירית במעי. הבנה מלאה של איך תאים M להבדיל במעי, כמו גם מנגנונים מולקולריים של ספיגת אנטיגן על ידי תאי M חסר. הסיבה לכך היא שתאי M הם אוכלוסיה נדירה של תאים במעי ומשום שבמודלים של מבחנה עבור תאים M אינם חזקים. התגלית של מערכת לחידוש עצמי התרבות תא גזע של המעי, כינה enteroids, סיפקה אפשרויות חדשות עבור תאי culturing M. בידור הם יתרון על פני קווי התאים הסטנדרטיים תרבותי כי הם יכולים להיות מובחנים לכמה סוגי תאים עיקריים נמצא המעי, כולל בתאי גביע, Paneth תאים, בידור תאים האנדוקריניים ו-enteroids. הציטוקין RANKL חיוני בפיתוח תא M, והוספה של RANKL ו-TNF-α לתקשורת התרבות מקדמת תת מערכת של תאים מתוך הenteroids להבדיל לתאי M. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה עבור בידול של תאי M במערכת האפיתל הטרנסג transwell של המעי באמצעות האדם בידור. ניתן להחיל שיטה זו על חקר הפיתוח והתפקוד של תא M.

בידור האילנואידים גדל ECM הם נותחו ויזואלית על ידי רביעיית ה-PCR עבור מצב הבריאות היחסי שלהם מדינות בידול כאמצעי איכות בקרת התרבויות ileal בידור ו לשימוש monolayers. מובחן בידור ileal גדל ב-ECM מופיעים ברורים פיברוזיס במבנה מורפולוגיה, המציין נוכחות של תאי גזע רבים (איור 1A). במשך הזמן, מובחן בידור ileal גדל במדיה הצמיחה עשוי לקחת על פנוטיפ ביניים שבו כמה יופיעו פיברוזיס וחלקם מופיעים אטום (איור 1B). לעתים קרובות, הדוגמאות שלנו מובחן דומות לאלה המוצגות באיור 1B ולא באיור 1b. אלה תרבויות ביניים מכילים יותר מבדיל סופני מובחנים כאשר נמדד על ידי ביטוי של סמן בידור, sucrase איזואלבורסה (SI), וכנראה הבלטת בידור מת בתאי לומן לתרום המראה הצפוף שלהם. בידור ileal יכול לשמש במצב ביניים זה לפיתוח מונאולייר, אך יש לזכור כי כמות תאי גזע המעיים המצויים בתרבויות עשויה להיות נמוכה, וחלק מסוגי התאים המבודקיים עשויים להופיע (לדוגמה, ראה רביעיית-PCR רמות בדגימות מובחן גדל ECM דמוי דמות 1B באיור 2. לעומת זאת, ileal בידור תרבותי עם מדיה בידול ב ECM עבור 5 + ימים יופיעו בצורה אחידה הכהה ולאוולי ותרבויות עם המבנה הזה הם לא מועמדים טובים לזריעת monolayers (איור 1C).
ביטוי של הגנים גזע תאים וגנים של בידול תא מעיים ניתן לנתח על ידי רביעיית PCR כאמצעי אחר כדי להעריך את מצב הבריאות של ileal בידור גדל ECM ואת יכולות הבידול שלהם פעם הופרה כמו monolayers על טרנסבארות. הביטוי של הגן תא גזע, LGR5, גן בידור, SI, גן של תא של גביע, MUC2, ו Paneth תא גן, lyz, מושווה בין תרבויות מובחן ileal בידור גדל ecm ו ileal הבדיל enteroid monolayers בנוכחות או העדר של RANKL/TNFα (איור 2). בעוד הערכים עשויים להיות שונים בין ניסויים, ביטוי של LGR5 צריך להקטין לאחר הבידול של monolayers18,26. LGR5 ביטוי הוא בדרך כלל לא מזוהה ileal הבדיל מבלי rankl ו-TNFα ביום 7. לעומת זאת, ביטוי של סמנים של בידול של סוגי תאים ספציפיים, כגון SI ו MUC2, להגדיל לאחר בידול18. ביטוי של Lyz יורדת בדרך כלל לאחר בידול בתרבויות שלנו. אם התרבויות ileal המשמש לעשיית monolayers להיראות כמו איור 1B מאשר איור 1b, עליות סמנים בידול מעיים עשוי להיות צנוע לאחר בידול כי התרבויות הראשוניות האלה הם הטרוגנית תאי מעיים ובעלי רמת בסיס גבוהה יותר של SI ו- MUC2. עם זאת, הבידול במונאולאיירס עדיין מתרחשת כאומדן על ידי אובדן של LGR5 ביטוי מיקרוסקופ (ראה להלן). יתר על כן, תוספת RANKL ו-TNFα לתקשורת בידול מפחית את אובדן הביטוי LGR5 (איור 2). במקביל, הביטוי של SI ו MUC2 הם מעט נמוך יותר מאשר במצב הבדיל חסר Rankl ו tnfα למרות רמות שלהם להגדיל מעל המצב מובחן.
M בידול התא monolayers נקבע הן על ידי רביעיית-PCR ו immunofluorescence באמצעות שני סמנים מסוימים תא M כולל משטח תא גליקופרוטאין 2 (GP2) ושעתוק פקטור SpiB21. ביטוי של GP2 ו- spib הוא upregulated ב בידור ileal בתוך מונו הנגזר בנוכחות Rankl ו tnfα והוא לא זוהה ב-Rankl ו tnfα התייחסו דגימות (איור 3). ביטוי של סמנים אלה יכול גם להיות מנורמל לחתיכת רקמת המעי הקטנה22, אם זמין. זה מתיר את שינוי הקיפול של אלה סמנים תא M להיות מושווה לרקמות כי יש תאים M במקום לשלוט monolayers כי אין להם ביטוי של סמנים אלה ומאפשר סטנדרטיזציה בין ניסויים במעבדה אחת. תאי M מזוהים גם על ידי הביטוי פני השטח של GP2 על ידי מאימונולואואורוסנס (איור 4). בדרך כלל, במונאולייר שוטפת, 1 עד 5 תאים שנצפו בשדה מיקרוסקופ נתון בהגדלה של 40X על ידי ימים 6 עד 8 לאחר זריעה בדגימות שטופלו RANKL ו-TNFα (איור 4א-ד). אין GP2 ביטוי בדגימות שאינן מטופלות (איור 4E). התצוגה אורתוגונלית של מטוס xz מצופה בדיקה phalloidin מראה אקטין מבנים סביב כל תא ו GP2 ביטוי על פני השטח הרשמי של M תאים (איור 4F-G). מודל זה מסכם את התדירות הנמוכה של תאי M המצויים במעי האנושי1,2,8. כדי לטהר ולבודד תאי M למחקר נוסף, תאי M יכול להיות מוכתם באמצעות GP2 ביטוי פני השטח מיון באמצעות FACS עבור GP2 + תאים.
תאים M לאגד אנטיגן הובלה מן המעיים לומן אל התאים החיסוניים המתגוררים מתחת האפיתל2. הפרשה IgA המיוצר במעי נקשר חיידקים והוא יכול לאגד את פני השטח פסגה של התאים M כדי להקל על התחבורה של חיידקים27,28. כדי לקבוע אם התאים M שפותחו במודל זה הם מסוגלים לאגד IgA, נסיוב האדם IgA מתווסף לחדר העליון, מותר לאגד עבור 1 h, ולאחר מכן monolayers מוכנים ניתוח מimmunofluorescence. הנוכחות של IgA על התאים של M הוא דמיינו באמצעות משני fluor-מעלה נוגדנים המכיר את השרשרת הכבדה של הנסיוב האנושי IgA. תאי m מטופלים עם IgA עבור 1 h יש IgA כרוך לפני השטח הרשמי (איור 5A), ואילו תאים M בבארות שליטה שטופלו רק עם הנוגדן המשני כדי IgA אין אות לזיהוי (איור 5a). עוד, IgA מאגד במיוחד לפני השטח הרשמי של M תאים ולא נמצא מאוגד לתאים כלשהם חסר GP2 פני השטח. בנוסף, תאי M יש כאופייני אקטין צפוף צפופה על פני השטח הרשמי שלהם2. כדי לנתח את המבנה התאי של M במודל זה, מונאולאן הנגזר של ileal מגודלים במשך 7 ימים וקוצרים עבור ניתוח מimmunofluorescence של F-actin באמצעות phalloidin. מדידות של עוצמת פיקסלים אקטין מחושבים עבור תאים m ועבור תאים שאינם מתוצרת M הסמוכים ישירות לכל תא M באמצעות תוכנת imagej (איור 6a). עוצמת actin מופחתת על GP2 + M תאים במודל זה ותמונה ייצוגית מוצג באיור 6B. באופן כללי, התאים M שפותחו במודל זה ileal הנגזר מודל מונאולאר יש ביטוי גנטי אופייני, מורפולוגיה וכמה פונקציות תא M של תאי המעי האנושי, כגון קשירה ל-IgA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig01.jpg"> איור 1: המבנה הייצוגי של בידור המעי האנושי ב-ECM בשבוע שלאחר הפיצול. (A) ברור ו פיברוזיס מובחן בידור. (ב) פנוטיפ ביניים עם מספר בידור סיסטיק-פיברוזיס וכמה מחלות אטימות מסוג lobular. (ג) הכהה ולוייתי הבדיל בידור המעי העקום. תמונות שנלקחו דרך העדשה של מיקרוסקופ אור אופטי בהגדלה 4x באמצעות מצלמת iPhone7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig02.jpg"> איור 2: הביטוי היחסי של תא גזע ו בידול של האדם בידור החיים גדל ECM או הבדיל כמו monolayers. Ileal בידור גדלו במשך 7 ימים ב ECM (מובחן) או גדל והבדיל כמו monolayers ללא (הבדיל) או עם RANKL ו TNFα (הבדיל + R/T). תרבויות ileal בידור או monolayers נקצרו Trizol להפקת RNA. הביטוי הגנטי נקבע על ידי רביעיית ה-PCR והוא מבוטא ביחס למנד- dh. נתונים הוא ממוצע של 3 בארות עצמאיות של מוננואידים או monolayers לכל תנאי. קווי שגיאה מציינים כי SEM. ND אינו מזוהה. מובהקות סטטיסטית נקבע על ערכים השתנה ביומן באמצעות ANOVA חד כיוון עם השוואות מרובות של דאננט מבחן השוואת מובחן. * * p < 0.01, * * * p < 0.001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig02large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig03.jpg"> איור 3: ביטוי יחסי של תא M סמנים ספציפיים GP2 ו spib מן האדם ileal בידור הנגזר monolayers. Rankl/TNFα טיפל לא מטופלים האנושית ileal בידור הנגזר monolayers נקצרו Trizol להפקת RNA לאחר 7 ימים שלאחר זריעה. הביטוי הגנטי נקבע על ידי רביעיית ה-PCR והוא מבוטא ביחס למנד- dh. הנתונים ממוצעים ב -6 מונאולאיירס עצמאיים לכל תנאי. קווי שגיאה מציינים כי SEM. ND אינו מזוהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig04.jpg"> איור 4: Immunofluorescence הבעה של פני השטח GP2 ביטוי על התאים M של האדם בידור מונאיד הנגזר monolayers לאורך זמן. RANKL/TNFα מטופל ובלתי מטופלים האנושית ileal בידור הנגזר מונאולאיירס שהיו קבועים ב 4% כדור הדור הלבן ומוכתם עבור immunofluorescence על ימים שונים המצוין לאחר זריעה. התמונות נותחו באמצעות תוכנת ImageJ. DAPI = כחול; גליקופרוטאין 2 (GP2) = אדום. (A-D) RANKL/TNFα טיפל monolayers בימים שונים לאחר זריעה. (ה) מונאולייר לא מטופל שנקטפו ביום 7 לאחר זריעה. (F-G) מטוס XZ אורתוגונני של monolayers ביום 7 לאחר זריעה מצופה עם phalloidin בדיקה עבור F-actin. פלאלודין = ציאן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig05.jpg"> איור 5: IgA נקשר במיוחד על פני השטח הרשמי של M תאים. RANKL/TNFα-מטופלים האדם ileal בידור-הנגזר monolayers גדלו במשך 7 ימים ולאחר מכן (א) מטופלים עם 10 μg של סרום האדם IgA עבור 1 h או (ב) מטופל מבוים עם PBS בלבד (ללא שליטה IgA). לאחר 1 h, monolayers נשטפו 2x ב PBS, היו קבועים 4% בלשית, החדיר עם 0.1% TritonX-100, ו ויטראז עבור immunofluorescence. התמונות נותחו באמצעות תוכנת ImageJ ומייצגות 3 ניסויים עצמאיים. DAPI = כחול; גליקופרוטאין 2 (GP2) = אדום; נוגדן לנסיוב האנושי IgA = ירוק; פלאלודין = ציאן. חיצים שחורים לציין IgA מאוגד לפני השטח הרשמי של M תא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig06.jpg"> איור 6: תאים M הפחיתו אינטנסיביות אקטין לעומת תאים שאינם M סמוכים. RANKL/TNFα-מטופלים האדם ileal בידור הנגזר מונאולז הנגזרים גדלו במשך 7 ימים ולאחר מכן תוקן ב 4% הלדור והיה מוכתם עבור immunofluorescence. (א) באמצעות imagej, תאים GP2 + M היו מתוארים באמצעות הכלי בחירה ביד חופשית ומדידות שטח ודחיסות משולבת נלקחו בערוץ Phalloidin. אותו ניתוח הושלם לאחר מכן עבור כל תא non-M סמוכים ששכנים תא M. הדחיסות המשולבת הגולמית חולקה על-ידי השטח של כל תא בודד לנורמליזציה. הצפיפות/האזור המשולבת הממוצעת חושבה עבור כל תא שאינו מתוצרת M הסמוכה לתאי M. התמונות נותחו מ 3 ניסויים עצמאיים; כל נקודה היא תא M או ממוצע של תאים שכנים. קווי שגיאה מציינים SD. משמעות סטטיסטית נקבעה בערכים הופכים ליומני רישום באמצעות בדיקה משויכת. p = 0.0001 (ב) הדמות המייצגת של Xz מטוס מתוך העלילה A. תמונות נותחו באמצעות תוכנת imagej. DAPI = כחול; גליקופרוטאין 2 (GP2) = אדום; פלאלודין = ציאן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers at JoVE.com

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום את הבידול של תאים M בתאי גזע האדם הנגזר ileal monolayers ושיטות כדי להעריך את התפתחותם.

המושרה בידול של תאים כמו תא בתאי גזע האדם-הנגזר הנגזרת מונאואיד Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

הבנה מלאה של התפקיד שתאי M ממלאים בהומלוסטזיס במעיים ובהגנה החיסונית חסרה, בשל נדירותם של תאי M במעי. ההידול המושרה של תאי M בתאי גזע מעיים אנושיים נגזר תרבויות יאפשרו את המחקר של התפתחות תאי M ותפקודים. כדי לצפות את קרום טרנסוול, למקם את המספר הרצוי של Transwells בצלחת 24 באר, יצירת מערכת שני תאים.מדללים את המטריצה החוץ-תאית, או ECM, פי 25 בתמיסת מלח סטרילית קרה. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון מדולל קר לתוך כל תא עליון על הממברנה. מכסים את צלחת 24 היטב עם מכסה, וממקמים את הצלחת לתוך אינקובטור תרבות רקמות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי לאפשר את התמצקת ECM על הממברנה.לאחר שעתיים, מוציאים את הצלחת מהחמה, ומ מניחים במכסה המנוע של תרבות הרקמות. באמצעות פינצטה סטרילית, הפוך כל טרנסוול כדי להסיר בעדינות את הפתרון שנותר. אפשר את הממברנות לאוויר יבש במכסה המנוע עם המכסה פתוח בזמן התאים נאספים.מוציאים את צלחת האינטרואידים האיליאליים מהאינקובטור, ומסירים בעדינות את מדיית התרבות מכל באר על ידי שאיפת ואקום או עם פיפטה. כדי לשבור את ECM, להוסיף 500 microliters של קרח קר 0.5 מילימולר EDTA לכל באר המכילה enteroids ileal מושעה ECM. פיפטה למעלה ולמטה במרץ עם צינור P1000 להגדיר ב 500 microliters כדי לשבור את ECM, ובכך לשחרר enteroids ileal לתוך הפתרון.לאסוף את הפתרון מכל גם לתוך 15 צינורות חרוט מיליליטר. גלולה את התאים בצנטריפוגה ב 140G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. גלולה צריך להיות גלוי, אבל יכול להיות נקע בקלות, כל כך לאט להסיר את העל טבעי על ידי שאיפה ואקום או עם פיפטה.כדי לעכל קשרים צומת הדוק ולשבור את enteroids ileal לתוך תאים בודדים, להשתמש שוב את גלולה ב 500 microliters של טריפסין טמפרטורת החדר לכל חמש בארות שנאספו. באמצעות צינור P1000, פיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק את הגושים. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות או פחות.הוסף מיליליטר אחד של DMEM מתקדם F-12 עם 10%FPS לכל 500 מיקרוליטר של טריפסין כדי להשבית את טריפסין. פיפטה למעלה ולמטה עם P1000 להגדיר ב 500 microliters לפחות 50 פעמים נגד הצד של הצינור חרוט עוד יותר לרוקן גושים שנותרו לתאים בודדים. מניחים מסננת תא 40 מיקרון מעל צינור חרוט 50 מיליליטר, ומוסיפים מיליליטר אחד של מתקדם DMEM F-12 עם 10% FPS כדי להרטיב את מסננת התא.פיפטה ההשעיה תא יחיד מן חרוט 15 מיליליטר על מסננת. לשטוף את מסננת עם מיליליטר אחד של מתקדם DMEM F-12 עם 10%FPS. העבר את התאים שעברו מסננת התא מצינור חרוט 50 מיליליטר לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר חדש.לספור את התאים באמצעות מד חמוציט. צנטריפוגה התאים בצינור החדש 15 מיליליטר ב 400G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. גלולת התא צריכה להיות גלויה.בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה, שוב שמירת supernatant במקרה גלולה הופך נקע. תן שימוש חוזר לכדור התא ב MCMGF פלוס עם 10 micromolar Y27632. ודא כי הממברנות מקודד ECM התייבשו באופן מלא כפי שהוערך על ידי העין.לשטוף את התא העליון עם 200 microliters של MCMGF פלוס. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של פתרון התא לתוך כל תא עליון. הוסיפו 700 מיקרוליטרים של MCMGF פלוס עם 10 מיקרומולרים Y27632 לכל תא תחתון.מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר יום אחד של צמיחה, להסיר את המדיה מהתא העליון, ולהחליף עם 200 microliters של MCMGF טרי פלוס כדי למנוע צמיחה של שכבות תאים מרובים. לאחר monolayers הם כ 80%confluent, בדרך כלל בין ימים אחד עד שלושה זריעת פוסט, להחליף מדיה basilateral עם מדיה בידול עבור בארות שליטה, או עם מדיה תא M עבור בארות אינדוקציה תא M.החלף את המדיה בתא העליון במדיה של התברואה עבור שני התנאים. כדי לאמת התמדיר תא M על-ידי QRTPCR, הסר תחילה את המדיה מהתא העליון והתחתון. לשטוף בעדינות את התא העליון פעמיים עם 300 microliters של PPS טמפרטורת החדר.מוסיפים 300 מיקרוליטרים של TRIzol לכל תא עליון, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. בינתיים, תווית צינורות מיקרו צנטריפוגה עבור כל באר, ולהוסיף 700 microliters של TRIzol לכל צינור. לאסוף הומוגניט תאים על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה שלוש פעמים עם P1000, ולהעביר את התוכן לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגה המתאימים.וורטקס לחמש שניות לערבב. שמור את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות נוספות ולאחר מכן המשך עם פרוטוקולי QRTPCR סטנדרטיים, או אחסן דגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי לאמת את התמדימות תאי M על-ידי שפעת חיסונית, הסר תחילה את המדיה מהתא העליון.יש לשטוף בעדינות פעמיים עם 300 מיקרוליטרים של PBS בטמפרטורת החדר. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של טמפרטורת החדר 4%PFA ב-PBS לתא העליון. מכסים את הצלחת בנייר כסף ולתת לעמוד במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הסרת PFA, לשטוף את התא העליון שלוש פעמים עם 300 microliters של PBS טמפרטורת החדר. הדגירה monolayers עם 100 microliters של 5% BSA מומס PBS במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר כדי לחסום את monolayers לפני הסרת הפתרון. הכינו את פתרון הנוגדנים העיקרי של GP2 באחוז אחד של BSA ב-PBS בדילול של 1 עד 100, והוסיפו 100 מיקרוליטרים ל הבאר.מכתימים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך, לפני הסרת הפתרון. לשטוף את התא העליון שלוש פעמים עם 300 microliters של PBS טמפרטורת החדר. הכן פתרון כתם משני של IgG פאלודין ו-DAPI מתויגים פלואורסצנטיים, והוסף 100 מיקרוליטרים ל באר.כתם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את בארות שלוש פעמים עם 300 microliters של PBS. לאחר מכן, מניחים טיפת חמישה מיקרוליטר של פתרון הרכבה על מגלשת זכוכית.הסר את באר מן צלחת 24 היטב להפוך. במהלך הסרת הממברנה מהטרנסוול, הממברנה חייבת להישאר שטוחה לחלוטין. בליטות בממברנה מונעות אטם מוצק לשקופית הזכוכית, והן יכולות להשפיע מאוד על איכות התמונה.כדי להבטיח הצלחה, בזהירות לחתוך את הממברנה מן הבאר באמצעות אזמל חד. מניחים את הממברנה עם התאים הפונים כלפי מעלה על טיפת פתרון ההרכבה על מגלשת הזכוכית. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של תותב הרכבה על החלק העליון והמרכזי של הממברנה, ומציבים תלוש כיסוי על גבי כדי לאטום את הממברנה בין מגלשת הזכוכית להחליק כיסוי.יבש את המגלשות בטמפרטורת החדר בחושך במשך 24 שעות. תאי M מזוהים על ידי ביטוי פני השטח של GP2 על ידי immunofluorescents. בדרך כלל, ב monolayer confluent, אחד עד חמישה תאים M נצפו בשדה מיקרוסקופ נתון בהגדלה 40X על ידי ימים שישה עד שמונה זריעת פוסט בדגימות שטופלו RANKL ו TNF אלפא.לא נראה ביטוי GP2 בדגימות שאינן מטופלות. התצוגה האורגזמית של מישור ה-XZ מכוסה בגשוש פאלואין מראה מבני אקטין המקיפים כל תא, וביטוי GP2 על פני השטח האפטיים של תאי M. מודל זה מסכם את התדירות הנמוכה של תאי M שנמצאו במעי האנושי.כדי לקבוע אם תאי M שפותחו במודל זה מסוגלים להיקשר ל- IgA, נוכחותו של IgA בתאי M מתדמית באמצעות נוגדן משני נדוש פלואור המזהה את השרשרת הכבדה של סרום אנושי IgA. תאי M שטופלו ב- IgA במשך שעה אחת קשורים IgA לפני השטח של האפים, ואילו לתאי M בארות בקרה שטופלו רק בנוגדן המשני ל- IgA, אין אות ניתן לגילוי. יתר על כן, IgA במיוחד נקשר לפני השטח apical של תאי M, והוא לא נמצא קשור לכל התאים חסר כתם משטח GP2.בנוסף, לתאי M יש פעולה צפופה קצרה יותר באופן אופייני על פני השטח שלהם. מעבר למדיית ההתברמות של RANKL TNF בתוספת דיפרציה כאשר המונו-שכבות הן בסביבות 80%confluent, הוא המפתח להשגת התדליות טובה של תאי M. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לחקור שאלות הקשורות להתפתחות תאי M, כמו גם אינטראקציות פתוגן מארחות ומחקרי הובלת סמים המערבים תאי M.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...