Name: induced differentiation of m cell-like cells in human stem cell-derived ileal enteroid monolayers
Uploaded: 2019-07-26T14:00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers at JoVE.com

Эта работа была поддержана НИАИД U19AI131126 д-ру Исбергу (Медицинская школа Туфтского университета) и д-ром Капланом (Университет Тафтса); (JM является лидером проекта 2) и NIAID R21AI128093 в JM. ACF была частично поддержана NIAID T32AI007077. SEB и MKE были поддержаны NIAID U19AI116497-05. Мы благодарим сотрудников лаборатории Mecsas, лаборатории Ng и доктора Исберга из Медицинской школы Университета Тафтса за полезные обсуждения. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Конфокальная визуализация была выполнена в Центре неврологии Тафтса, P30 NS047243.

<ol>
	<li>Kraehenbuhl, J. P., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+M+cells:+differentiation+and+function.">Epithelial M cells: differentiation and function.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 301-332 (2000).</li><li>Neutra, M. R., Frey, A., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+M+cells:+gateways+for+mucosal+infection+and+immunization.">Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization.</a> Cell. 86 (3), 345-348 (1996).</li><li>Nakamura, Y., Kimura, S., Hase, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cell-dependent+antigen+uptake+on+follicle-associated+epithelium+for+mucosal+immune+surveillance.">cell-dependent antigen uptake on follicle-associated epithelium for mucosal immune surveillance.</a> Inflammation and Regeneration. 38, 15 (2018).</li><li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer's+patch+M+cells.">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infection and Immunity. 66 (3), 1237-1243 (1998).</li><li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium,+Listeria+monocytogenes,+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer's+patches.">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infection and Immunity. 66 (8), 3758-3766 (1998).</li><li>Jones, B. D., Ghori, N., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+initiates+murine+infection+by+penetrating+and+destroying+the+specialized+epithelial+M+cells+of+the+Peyer's+patches.">Salmonella typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the specialized epithelial M cells of the Peyer's patches.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (1), 15-23 (1994).</li><li>Marra, A., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasin-dependent+and+invasin-independent+pathways+for+translocation+of+Yersinia+pseudotuberculosis+across+the+Peyer's+patch+intestinal+epithelium.">Invasin-dependent and invasin-independent pathways for translocation of Yersinia pseudotuberculosis across the Peyer's patch intestinal epithelium.</a> Infection and Immunity. 65 (8), 3412-3421 (1997).</li><li>Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+M+cells.">Intestinal M cells.</a> Journal of Biochemistry. 159 (2), 151-160 (2016).</li><li>Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+by+Peyer's+patch+lymphocytes+of+human+enterocytes+into+M+cells+that+transport+bacteria.">Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria.</a> Science. 277 (5328), 949-952 (1997).</li><li>Gullberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+specific+markers+and+particle+transport+in+a+new+human+intestinal+M-cell+model.">Expression of specific markers and particle transport in a new human intestinal M-cell model.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 279 (3), 808-813 (2000).</li><li>Giannasca, P. J., Giannasca, K. T., Leichtner, A. M., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+M+cells+display+the+sialyl+Lewis+A+antigen.">Human intestinal M cells display the sialyl Lewis A antigen.</a> Infection and Immunity. 67 (2), 946-953 (1999).</li><li>Jang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+villous+M+cells:+an+antigen+entry+site+in+the+mucosal+epithelium.">Intestinal villous M cells: an antigen entry site in the mucosal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6110-6115 (2004).</li><li>Beloqui, A., Brayden, D. J., Artursson, P., Preat, V., des Rieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+intestinal+M-cell-like+model+for+investigating+particle,+antigen+and+microorganism+translocation.">A human intestinal M-cell-like model for investigating particle, antigen and microorganism translocation.</a> Nature Protocols. 12 (7), 1387-1399 (2017).</li><li>Martinez-Argudo, I., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+translocates+across+an+in+vitro+M+cell+model+independently+of+SPI-1+and+SPI-2.">Salmonella translocates across an in vitro M cell model independently of SPI-1 and SPI-2.</a> Microbiology. 154 (Pt 12), 3887-3894 (2008).</li><li>Lee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lab-to-lab+variability+in+Caco-2+permeability+assays.">Quantitative analysis of lab-to-lab variability in Caco-2 permeability assays.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 114, 38-42 (2017).</li><li>Mabbott, N. A., Donaldson, D. S., Ohno, H., Williams, I. R., Mahajan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfold+(M)+cells:+important+immunosurveillance+posts+in+the+intestinal+epithelium.">Microfold (M) cells: important immunosurveillance posts in the intestinal epithelium.</a> Mucosal Immunology. 6 (4), 666-677 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+is+necessary+and+sufficient+to+initiate+development+of+antigen-sampling+M+cells+in+the+intestinal+epithelium.">RANKL is necessary and sufficient to initiate development of antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium.</a> Journal of Immunology. 183 (9), 5738-5747 (2009).</li><li>Taylor, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphotoxin-independent+expression+of+TNF-related+activation-induced+cytokine+by+stromal+cells+in+cryptopatches,+isolated+lymphoid+follicles,+and+Peyer's+patches.">Lymphotoxin-independent expression of TNF-related activation-induced cytokine by stromal cells in cryptopatches, isolated lymphoid follicles, and Peyer's patches.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5659-5667 (2007).</li><li>de Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+patch+M+cells+derived+from+Lgr5(+)+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+&amp;#34;miniguts&amp;#34;.">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured &amp;#34;miniguts&amp;#34;.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li><li>Rouch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Functional+Microfold+(M)+Cells+from+Intestinal+Stem+Cells+in+Primary+Human+Enteroids.">Development of Functional Microfold (M) Cells from Intestinal Stem Cells in Primary Human Enteroids.</a> PloS One. 11 (1), e0148216 (2016).</li><li>Wood, M. B., Rios, D., Williams, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+augments+RANKL-dependent+intestinal+M+cell+differentiation+in+enteroid+cultures.">TNF-alpha augments RANKL-dependent intestinal M cell differentiation in enteroid cultures.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 311 (3), C498-C507 (2016).</li><li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+New+Models+to+Study+Gastrointestinal+Virus+Infections.">Human Intestinal Enteroids: New Models to Study Gastrointestinal Virus Infections.</a> Methods in Molecular Biology. , (2017).</li><li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+a+Human+and+Mouse+Intestinal+Epithelial+Cell+Monolayer+Platform.">Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li><li>Mantis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adherence+of+IgA+to+murine+Peyer's+patch+M+cells:+evidence+for+a+novel+IgA+receptor.">Selective adherence of IgA to murine Peyer's patch M cells: evidence for a novel IgA receptor.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 1844-1851 (2002).</li><li>Rios, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+sampling+by+intestinal+M+cells+is+the+principal+pathway+initiating+mucosal+IgA+production+to+commensal+enteric+bacteria.">Antigen sampling by intestinal M cells is the principal pathway initiating mucosal IgA production to commensal enteric bacteria.</a> Mucosal Immunology. 9 (4), 907-916 (2016).</li><li>Miller, H., Zhang, J., Kuolee, R., Patel, G. B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+M+cells:+the+fallible+sentinels?.">Intestinal M cells: the fallible sentinels?.</a> World Journal of Gastroenterology. 13 (10), 1477-1486 (2007).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Для разработки монослойных, которые правильно дифференцируются в основные типы клеток кишечника и M-клеток, очень важно быть в курсе нескольких факторов. Ileal enteroids должны быть собраны из ECM культур, которые являются недифференцированными и имеют высокую долю lgr5 "стволовых клеток. Визуально, большинство ileal enteroids в культурах ECM не должны быть затемнены и многолобулярны, и выражение LGR5 должно быть обнаружено в этих культурах с помощью анализа qRT-PCR. Контроль качества условных носителей имеет важное значение для распространения недифференцированных культур с течением времени и должен быть завершен для каждой партии условных носителей, которые производятся. Контроль качества может быть завершен путем тестирования новой партии носителей на некоторых культурах ECM и сравнения морфологии илеал-энтероидов с предыдущей партией носителей в течение недели. Выражение LGR5 должно оставаться относительно похожим в илеалэнтерных культур, выращенных в новой партии носителей по сравнению с предыдущей партии.
При подготовке илеальных энтероидов для посева в качестве монослойных, важно энергично пипетку клеточного раствора после инкубации с трипсином, чтобы разбить ileal enteroids на одиночные клетки. Клеточные комки могут привести к многослойной образованию при посеве для монослойных. Кроме того, важно эмпирически определить количество клеток, необходимых для формирования монослой для каждого отдельного ileal enteroid линии, которая получена. Как правило, это значение может варьироваться от 2,5 х 105 - 5,0 х 105 клеток / хорошо, но зависит от степени кистозных до некистовых илеаловых enteroids в культурах и варьируется для каждого отдельного ileal enteroid линии. Из опыта, ileal enteroids, выращенных в ECM, которые появляются менее кистозные требуют более высокой плотности посева клеток для достижения монослойных. Целесообразно помыть верхнюю камеру после 1 дня роста, аккуратно пайпетируя средства массовой информации вверх и вниз в 2-3 раза и заменив свежими средствами роста. Этот процесс вытесняет клетки, которые приземлились на другие клетки, уменьшая вероятность многослойного образования. Переключение средств массовой информации в верхней палате от роста средств массовой информации для M-клеток средств массовой информации, когда монослой в 80% сливов, которые обычно происходят в день 2 после посева, помогает достичь хорошей дифференциации M ячейки. Добавление RANKL/TNF в верхнюю камеру во время индукции M-клеток не приводит к развитию большего числа M-клеток на монослой и, следовательно, может быть исключено из среды верхней камеры. Трансвеллы различных размеров пор могут быть использованы в этом протоколе, не влияя на развитие M ячейки; однако, плотность посева клеток должна быть оптимизирована для тех, кто с большими размерами пор. Коллаген IV может быть заменен на ECM в качестве подвального мембранного протеинового покрытия для трансвелл или хорошо пластин, которые могут быть лучше подходят для некоторых приложений.
Илеал-энтероид-производные монослой на трансуэллах обеспечивают двухкамерную систему, которая позволяет создавать определенные апикальные и базолатеральные поверхности таким образом, что 4-5 различных типов эпителиальных клеток кишечника могут поляризовать, чтобы выразить поверхностные маркеры на каждом стороны по отношению к тому, что находится в кишечнике. К любой стороне могут быть добавлены дополнительные факторы, такие как частицы, инфекционные агенты или другие типы клеток. Однако на сегодняшний день некоторые ограничения остаются. Как описано, эта система является статическая система, которая не хватает физиологического потока, кишечных сокращений, и содержимое кишечника. Кроме того, архитектура виллуса-крипта теряется в результате образования плоского монослойа. Эти системы не имеют патч регионов Пейер, иммунные клетки, и стромальные клетки. Ли отсутствие иммунных и стромальных клеток, проживающих тесно под M клеток влияет на вагинации, которые не наблюдаются в этой системе и других физиологических функционирования является важной будущей области исследования. Этот протокол может быть адаптирован к 96-ну хорошо пластины или многоколодцв формат пластины. Процедура покрытия 96-ну хорошей пластины ECM и посева с одиночными клетками из илеальных энтероидов остается такой же, как и для трансвелл. Титрация плотности посева клетки, необходимых для получения монослойных должно быть сделано, но, как правило, колеблется от 1,0 х 105 - 3,0 х 105 клеток / хорошо в 96-колодец формата пластины. M клетки индуцируются путем замены роста средств массовой информации с М ячейки средств массовой информации, когда монослой 80% слияния, как правило, в дни 1-3 в зависимости от первоначальной плотности посева клеток.
Этот метод дифференциирования M-клеток от илеальных энтеридов in vitro обеспечивает значительные улучшения по сравнению с методом Caco-2. Ileal enteroids являются первичными клетками и по крайней мере 4-5 типов эпителиальных клеток присутствуют в системе. Кроме того, ileal enteroid линий, полученных от разных людей могут быть изучены, чтобы исследовать, как генетика или состояние болезни влияние Развития и поведения Клеток M. Дополнительные манипуляции илеал-энтероидов во время дифференциации M ячейки позволит лучше понять развитие M ячейки в том числе характеристики M клеток-прекурсоров. Наконец, поскольку молекулярные механизмы фagoцитоза ИКТитозаИ. до сих пор не до конца поняты 3,29,эта модель дает возможность изучить и визуализировать поглощение антигена и частиц M-клетками.

M (микросклад) клетки специализированные кишечные эпителиальные клетки, найденные в основном в фолликуле связанных эпителия (FAE) кишечника над тонкими лимфоидными регионами называется Peyer патчи1. M клетки имеют короткие нерегулярные атикальные микровилли и глубоко invaginated на их базолутеральной стороне, которая позволяет иммунные клетки, чтобы проживать близко к их клеточному телу2. Эта уникальная морфология позволяет M-клеткам образец антигена из аптического просвета кишечника и доставить его непосредственно в основные иммунные клетки2. Таким образом, M клетки важны для иммунного наблюдения в кишечнике, но также могут быть использованы патогенами для входа в ламины propria1,2,3,4,5, 6,7.
Изучение M-клеток было затруднено несколькими факторами. Во-первых, M клетки находятся на низкой частоте в мыши и кишечнике человека8. В культурных клеточных системах, M-клеточные клетки были индуцированы, чтобы дифференцировать путем совместного культивирования поляризованной линии клеток аденокарциномы, Caco-2, либо с лимфоцитами B из патчей мыши Пейер или линии клеток В-клеток, Raji B9,10 . Это приводит к подмножество клеток Caco-2, которые выражают маркеры M-клеток Sialyl Lewis Антиген и UEA-1 в поляризованном эпителии9,10. (Эти маркеры также выражены на клетках кубок в кишечных тканях, поэтому в настоящее время реже используются в качестве окончательных маркеров M-клеток11,12.) Эта клеточная система Caco-2-M была использована для изучения поглощения частиц и транслокации бактерий13,14. Тем не менее, клетки Како-2 являются установленной клеточной линии от большой кишечной аденокарциномы с смешанным фактором, что различные источники клеток Caco-2 отображают различные фенотипы среди лабораторий15. Кроме того, они не могут полностью резюмировать уровни транскрипции истинных клеток M, так как им не хватает выражения известных в настоящее время маркеров M-клеток GP2 и SpiB16. Поэтому для изучения развития и функций клеток М необходимы дополнительные и более физиологически значимые модели культуры.
В течение последних десяти лет, поле enteroid полученных типовых систем кишечника быстро продвигается вперед от первоначального открытия, что кишечные стволовые клетки, полученные из кишечной биопсии человека может самопропагандировать и самообновления в культуре 17 Лет , 18. Важно, удаление факторов содействия стволовых клеток из средств роста позволяет этим культурам стволовых клеток дифференцироваться во многих типах клеток, найденных в кишечнике18. Кроме того, последние работы свидетельствуют о важности RANKL-RANK сигнализации в развитии M клеток в кишечнике19,20. Рецептор RANK является членом семейства Рецепторов TNF, который выражается на эпителиальных клетках-предшественниках в кишечнике19, в то время как RANKL (лиганд рецепторов RANK) высвобождается стромальными клетками патчей Пейера20. Так как эпителиальные типы клеток, присутствующие в ileal enteroids не производят RANKL, M-клеточная дифференциация в илеальных энтероидных культурах может быть вызвана добавлением RANKL в культуру сми21,22. Включение TNF в культурные медиа-медиа помогает поддерживать развитие M клеток в ileal enteroids23. Здесь мы описываем методы индуцирования дифференциации M-клеток в кишечных монослойах, полученных из человеческих илеальных энтероидов. Наши методы частично основаны на модификациях из следующих протоколов21,22,23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 10 &#181;M 
			Final Concentration: 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td>For breaking up ECM 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 0.5 M 
			Final Concentration: 0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>For excluding clumps from single cells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-8301</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: DMSO 
			Stock Concentration: 500 &#181;M 
			Final Concentration: 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td>MCMGF+ and DM Basal medium 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>For secondary stain 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>Optional secondary stain for F-actin 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 50x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00535</td>
			<td>5% for blocking solution 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 0.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle coverslips</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1157B50</td>
			<td>For mounting membrane on glass slide 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62247</td>
			<td>For secondary stain 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 100x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Treated RNAse free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP561-1</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Removal Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1906</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 proof</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EX0276-4</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-580</td>
			<td>For cutting membrane from transwells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For inactivating trypsin 
			Solvent: Advanced DMEM/F12 
			Stock Concentration: 1 
			Final Concentration: 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Mercedes Scientific</td>
			<td>MER 7200/90/WH</td>
			<td>For mounting membrane on glass slide 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 200 mM 
			Final Concentration: 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2 Antibody</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>D277-3</td>
			<td>Surface stain for M cells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 1 M 
			Final Concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum IgA</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>340-12-1</td>
			<td>For functional analysis of M cells 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 1 mg/mL 
			Final Concentration: 10 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt3a conditioned media</td>
			<td>Cell line from ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td>Refer to ATCC Product Sheet for L Wnt&#173;3A (ATCC CRL2647) for conditioned media protocol; MCMGF+ ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 75% in MCMGF+ 
			0% in DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular Matrix (ECM) 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 50 &#181;g/mL 
			Final Concentration: 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 100x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>MCMGF+ and DM ingredient 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 500 mM 
			Final Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned media</td>
			<td>Cell line gift from Dr. Gijs van den Brink (University of Amsterdam)</td>
			<td></td>
			<td>Ref 30 for conditioned media protocol; MCMGF+ and DM Ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 5% in MCMGF+ 
			5% in DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2199983</td>
			<td>For fixing monolayers 
			Solvent: PBS 
			Stock Concentration: 0.16 
			Final Concentration: 0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, -Mg, -Ca</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td>Solvent for 0.5 mM EDTA 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Optional ingredient of MCMGF+ and DM 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 100x 
			Final Concentration: 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Antifade mounting solution 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNeasy Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human RANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Used to induce M cells 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 0.1 mg/mL 
			Final Concentration: 200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine TNFa</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td>Used to induce M cells 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 5 mg/mL 
			Final Concentration: 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin conditioned media</td>
			<td>Cell line from Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Refer to Trevigen Cultrex Rspo1 Cells product manual (HA-R-Spondin1 293T cell line) for conditioned media protocol; MCMGF+ Ingredient 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 10% in MCMGF+ 
			0% in DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary anti-human IgA antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>109-545-011</td>
			<td>For secondary stain 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Script IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18091200</td>
			<td>For conversion of RNA to DNA 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts, 24 well-sized</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662641</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Not required during GP2 primary stain 
			Solvent: 1% BSA 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration: 0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>For RNA isolation 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12605010</td>
			<td>Trypsin for breaking up enteroids into single cells 
			Solvent: 
			Stock Concentration: 
			Final Concentration:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y-0503</td>
			<td>MCMGF+ ingredient on day 0 
			Solvent: H2O 
			Stock Concentration: 5 mM 
			Final Concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CATGAGAAGTATGACAACAGCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTTTCCCGCAAGACGTAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAATGTGCCTACCCACTGGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATGGCACCCACATACAGCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYZ forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGCTACTGGTGTAATGATGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYZ reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TTTGCACAAGCTACAGCATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATGCCCTTGCGTCCATAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUC2 reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AGGAGCAGTGTCCGTCAAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCCAGCTACTACTCGTGTGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CCCTCTGTTGGGAATTGTTCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPIB forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAGCAGCCGCTTTTAGCCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPIB reverse primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCATATGCCGGGGGAACC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induced differentiation of m cell-like cells in human stem cell-derived ileal enteroid monolayers

M (микросклад) клетки кишечника функционируют для транспортировки антигена из апикального проема в основные патчи Пейера и ламинальные проприии, где находятся иммунные клетки, и, следовательно, способствуют слизистой оболочке иммунитета в кишечнике. Полное понимание того, как M клетки дифференцировать в кишечнике, а также молекулярные механизмы поглощения антигена M клеток не хватает. Это потому, что M клетки являются редкой популяции клеток в кишечнике и потому, что в пробирке модели для M клеток не являются надежными. Открытие самообновляющейся системы культуры стволовых клеток кишечника, называемой энтероидами, дало новые возможности для культивирования Клеток М. Энтероиды являются выгодными по сравнению со стандартными культивированными клеточными линиями, потому что они могут быть дифференцированы на несколько основных типов клеток, найденных в кишечнике, включая клетки кубок, клетки Панета, энтероэндокринные клетки и энтероциты. Цитокин RANKL имеет важное значение в развитии M клеток, и добавление RANKL и TNF-я в культурные носители способствует подмножество клеток из илеальных энтероидов дифференцироваться в M-клетки. Следующий протокол описывает метод дифференциации M-клеток в трансвелле эпителиальной поляризованной монослойной системы кишечника с использованием человеческих илеаловых энтероидов. Этот метод может быть применен к изучению развития и функции M-клеток.

Watch this Scientific Journal Video about Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers at JoVE.com

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Этот протокол описывает, как вызвать дифференциацию M-клеток в стволовых клетках человека полученных илеальных монослойных и методов для оценки их развития.

Индуцированная дифференциация M-клеточных клеток в стволовой клетке человека производные Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Полное понимание роли M-клеток в кишечном гомеостазе и иммунной защите отсутствует из-за редкости клеток М в кишечнике. Индуцированная дифференциация клеток M в человеческих кишечных стволовых клетках, полученных культур позволит для изучения развития M клеток и функций. Чтобы покрыть мембраны Transwell, поместите нужное количество Трансвеллс в пластину 24 хорошо, создавая двухкамерную систему.Разбавить внеклеточной матрицы, или ECM, 25 раз в холодной стерильной фосфат буферной солевой раствор. Затем добавьте 100 микролитров холодного разбавленного раствора в каждую верхнюю камеру на мембрану. Обложка 24 хорошо пластины с крышкой, и поместите пластину в инкубатор культуры тканей при 37 градусов по Цельсию в течение двух часов, чтобы ECM затвердевание на мембране.Через два часа снимите пластину с инкубатора и поместите в ткань культуры капюшона. Используя стерильные пинцеты, инвертировать каждый Transwell, чтобы аккуратно удалить оставшийся раствор. Позвольте мембранам высохнуть в капюшоне с открытой крышкой во время сбора клеток.Удалите пластину иловые энтероиды из инкубатора, и осторожно удалить культуру средств массовой информации из каждого хорошо вакуумной аспирации или с пипеткой. Чтобы разбить ECM, добавьте 500 микролитров ледяной 0,5 миллимолярной ЭДТА к каждой хорошо содержащей илоидные энтероиды, приостановленные в ECM. Pipette вверх и вниз энергично с P1000 pipetter установлен на 500 микролитров, чтобы разбить ECM, тем самым выпустив ил enteroids в раствор.Соберите раствор из каждой хорошо в 15 миллилитров конических труб. Пеллет клетки в центрифуге при 140G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Пеллеты должны быть видны, но могут быть легко выбиты, так что медленно удалить supernatant вакуумной аспирации или с пипеткой.Чтобы переварить тесные связи соединения и разбить иловых энтероидов на одиночные клетки, повторно гранулы в 500 микролитров трипсина комнатной температуры на каждые пять собранных скважин. Используя P1000 pipetter, пипетка вверх и вниз, чтобы дезагрегить сгустки. Инкубировать трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение пяти минут или меньше.Добавьте один миллилитр передового DMEM F-12 с 10%FPS на 500 микролитров трипсина для инактивации трипсина. Pipette вверх и вниз с P1000 набор на 500 микролитров по крайней мере 50 раз против стороны конической трубки для дальнейшей дезагрегации оставшихся сгустков в одиночные клетки. Поместите 40 микрон-клеточный ситечко над 50 миллилитровой конической трубки, и добавить один миллилитр передовых DMEM F-12 с 10%FPS, чтобы мокрые клетки ситечко.Pipette одноклеточной подвески от 15 миллилитров conical на ситечко. Вымойте ситечко с одним миллилитров передовых DMEM F-12 с 10%FPS. Перенесите клетки, которые прошли через клеточный ситечко из 50 миллилитров конической трубки в новую 15 миллилитровую коническую трубку.Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифуга клетки в новой 15 миллилитровой трубки при 400G в течение пяти минут при комнатной температуре. Клеточные гранулы должны быть видны.Аккуратно удалите супернатант пипеткой, снова сохранив супернатант в случае, если гранулы выбиты. Повторное производство клеточных гранул в MCMGF плюс с 10 микромоляной Y27632. Убедитесь, что ecM закодированные мембраны полностью высохли, как оценивается глазом.Вымойте верхнюю камеру 200 микролитров MCMGF плюс. Затем добавьте 200 микролитров клеточного раствора в каждую верхнюю камеру. Добавьте 700 микролитров MCMGF плюс по 10 микромоляров Y27632 к каждой нижней палате.Поместите пластину в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию с 5%CO2. После одного дня роста, удалить средства массовой информации из верхней палаты, и заменить 200 микролитров свежих MCMGF плюс для предотвращения роста нескольких слоев клеток. После того, как монослойные примерно 80%confluent, как правило, между днями от одного до трех пост посева, заменить базилатеральных средств массовой информации с дифференциацией средств массовой информации для управления скважин, или с M сотовых средств массовой информации для индукционных скважин M клеток.Замените средства массовой информации в верхней палате на средства дифференциации для обоих условий. Чтобы проверить дифференциацию ячеек M с помощью QRTPCR, сначала удалите мультимедиа из верхней и нижней камер. Аккуратно промойте верхнюю камеру дважды 300 микролитров комнатной температуры PPS.Добавьте 300 микролитров TRIzol в каждую верхнюю камеру и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Между тем, этикетка микро центрифуги трубки для каждой хорошо, и добавить 700 микролитров TRIzol к каждой трубке. Соберите однородат клеток, аккуратно трубя вверх и вниз три раза с P1000, и передать содержимое в соответствующие микро центрифуги труб.Vortex в течение пяти секунд, чтобы смешать. Храните образцы при комнатной температуре в течение еще трех минут, а затем продолжайте со стандартными протоколами RTPCR, или храните образцы при отрицательных 80 градусах по Цельсию. Для проверки дифференциации клеток M по иммунофлюоресценции, во-первых, удалить средства массовой информации из верхней палаты.Аккуратно мыть два раза с 300 микролитров комнатной температуры PBS. Добавьте 100 микролитров комнатной температуры 4%PFA в PBS в верхнюю палату. Накройте тарелку фольгой и дайте постоять 25 минут при комнатной температуре.После удаления PFA, мыть верхнюю камеру три раза с 300 микролитров комнатной температуры PBS. Инкубировать монослой с 100 микролитров 5%BSA растворяется в PBS в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре, чтобы заблокировать монослой перед удалением раствора. Подготовка GP2 первичного антитела решение в один процент BSA в PBS при разбавлении от одного до 100, и добавить 100 микролитров на колодец.Пятно в течение одного часа при комнатной температуре в темноте, прежде чем удалить раствор. Вымойте верхнюю камеру три раза с 300 микролитров комнатной температуры PBS. Подготовь вторичное пятно раствор флуоресцентно помечены козы анти-мышь IgG фаллоидин и DAPI, и добавить 100 микролитров на колодец.Пятно в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Вымойте скважины три раза с 300 микролитров PBS. Затем поместите на стеклянную горку пятилитровую каплю монтажного раствора.Удалить хорошо из 24 хорошо пластины и инвертировать. Во время удаления мембраны из Трансвелла мембрана должна оставаться полностью плоской. Удары в мембране предотвращают твердое уплотнение стеклянной горки и могут сильно повлиять на качество изображения.Чтобы обеспечить успех, осторожно вырежьте мембрану из колодец с помощью острого скальпеля. Поместите мембрану с клетками, обращенным вверх, на капельку монтажного раствора на стеклянной горке. Добавьте 10 микролитров монтажного раствора на верхнюю и центральную часть мембраны, а сверху поместите крышку, чтобы запечатать мембрану между стеклянной горкой и крышкой.Высушите горки при комнатной температуре в темноте в течение 24 часов. М-клетки обнаруживаются поверхностным выражением GP2 иммунофлуоресцентными лампами. Как правило, в слиянии однослойных, от одного до пяти M клетки наблюдаются в данном поле микроскопа на 40X увеличение на дни от шести до восьми пост посева в образцах, обработанных RANKL и TNF альфа.Выражение GP2 не видно в необработанных образцах. Ортогональный вид плоскости СЗ, наложенной фаллоидин-зондом, показывает актиновые структуры, окружающие каждую клетку, и выражение GP2 на апической поверхности клеток М. Эта модель резюмирует низкую частоту M-клеток, найденных в кишечнике человека.Чтобы определить, если M клетки, разработанные в этой модели способны связываться с IgA, наличие IgA на клетках M визуализируется с помощью фтора конъюгированных вторичных антител, который распознает тяжелую цепь человеческой сыворотки IgA. M клетки, обработанные IgA в течение одного часа имеют IgA связаны с апической поверхности, в то время как M-клеток в контрольных скважин, которые были обработаны только вторичные антитела к IgA, не имеют обнаруживаемого сигнала. Кроме того, IgA специально связывается с апической поверхностью клеток M, и не найден связанным с любыми клетками, не имеющими пятна поверхности GP2.Кроме того, M-клетки имеют характерно более короткий плотный актин на их апической поверхности. Переход на RANKL TNF альфа дополнены дифференциации средств массовой информации, когда монослойные около 80%confluent, является ключом к достижению хорошей дифференциации клеток M. Этот метод позволит исследователям исследовать вопросы, связанные с развитием клеток M, а также взаимодействия патогенов-хозяина и исследования транспортировки наркотиков с участием M-клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In Vitro Дифференциация человеческого CD4 + FOXP3 + Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Роман человеческого эпителиального Enteroid модель развития некротизирующего энтероколита

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Человеческого Colonoid монослои для изучения взаимодействия между патогенов, Комменсалами и принимающих кишечного эпителия

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток-производные кишечные органоиды для изучения и изменения эпителиальной защиты клеток против сальмонеллы и других патогенов

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Изоляция слюнных эпителиальных клеток от слюнных желез человека для роста провитроки как салисферы или монослои

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Стволовые клетки- производные вирусные Ag-специфические T Лимфоциты подавить HBV репликации у мышей

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Производство и характеристика макрофагов человека из плюрипотентных стволовых клеток

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...