Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل بأموال من مجلس المنح البحثية في هونغ كونغ ، وصندوق البحوث الصحية والطبية (هونغ كونغ) ، وخطه المنح المباشرة للمجلس ، وصندوق الهبات التابع للكلية المتحدة ، ومؤسسه تويلاتش الخيرية.

وكانت جميع الإجراءات المتبعة متفقه مع المعايير الاخلاقيه للجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة لجامعه هونغ كونغ الصينية.
1. اعداد الشفاه المختلطة
<ol><li>ضعي الضمادة الدائرية المعقمة بحجم 18 ملم في كل بئر من لوحه ثقافة الانسجه التي تبلغ 12 بئرا.</li>
	<li>معطف كوفيرسليب مع 5 ميكر...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

كما ذكر من قبل ، وتستخدم علي نطاق واسع PC12 والمستنسخات لها لدراسة تمديد نيوريت لان لديهم كفاءه ممتازة ترانسكشن2،3. في المقابل ، الخلايا العصبية الاوليه لديها معدل التحويل منخفضه ، والتي هي عقبه رئيسيه لدراسة المنظمين العصب العصبي من قبل الانتقال7</su...

العصبية ، بما في ذلك كل من محاور و dendrites ، هي الإسقاطات من الخلايا العصبية المشاركة في إنشاء الشبكات العصبية. ان النمو الديناميكي للعصب أمر ضروري لتطوير الأعصاب. ومع ذلك ، تظل أليات التنظيمية الاساسيه في الأسفل غير واضحة. علي وجه الخصوص ، وغالبا ما يلاحظ تلف العصب في مختلف الامراض العصبية وبعد إصابات الدماغ1. ولذلك ، فان التحقيق في ادوار الجزيئات المفترضة في مختلف المسارات التنظيمية لنمو العصب العصبي من شانه ان يحسن فهمنا للعملية. وعلاوة علي ذلك ، فانه قد تكشف عن أهداف علاجيه جديده لمختلف الاضطرابات العصبية. خطوط الخلايا العصبية هي نماذج قيمه لدراسة العمليات العصبية بما في ذلك العصب العصبي لأنها سهله للتلاعب و transfect2,3. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن حدوث انحراف جيني في بعض خطوط الخلايا الشائعة الاستخدام ، مما قد يؤدي إلى اختلافات في الاستجابات الفسيولوجية4. وعلاوة علي ذلك ، تم عرض التعبير البروتين التفاضلي بين خطوط الخلايا العصبية والخلايا العصبية الاوليه. علي سبيل المثال, PC12, خط الخلايا العصبية المستمدة من الغدة الكظرية الفئران التي تستخدم علي نطاق واسع لدراسة العصب العصبي2,3, لا تعبر عن مستقبلات nmda5. وعلاوة علي ذلك ، فقد اقترح ان انخفاض الاستجابة للخط العصبي العصبي الماوس خط عصبيه-2a إلى السموم العصبية بالمقارنة مع الخلايا العصبية الاوليه ويرجع ذلك إلى عدم التعبير عن مستقبلات غشاء معينه وقناات أيون6. لذلك ، الخلايا العصبية الاوليه هي نموذج أكثر من المرغوب فيه وتمثيليه للتحقيق في النمو العصبي. ومع ذلك ، فان استخدام الخلايا العصبية الاوليه يعوقه الكفاءة المنخفضة للتحويل7.
هنا ، ونحن وصف الطريقة التي تنطوي علي الانتقال المشترك للبروتين من الفائدة (POI) و EGFP إلى الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه. وتعمل EGFP كعلامة مورفولوجية لتحديد الخلايا العصبية المتحولة بنجاح وتسمح بقياس العصب. نحن التحقق من صحة هذه الطريقة باستخدام المركبات/الجزيئات التي تم الإبلاغ عنها لتعدل العصب العصبي. وعلاوة علي ذلك ، تم استخدام FE65 ، وهو بروتين محول الخلايا العصبية التي ثبت لتحفيز النمو العصبي ، لتوضيح هذا النهج8،9. هذا البروتوكول ينطوي علي (1) عزل الخلايا العصبية القشرية الاوليه من الجنينية اليوم 18 (E18) أجنه الفئران ، (2) المشترك بين الخلايا العصبية مع EGFP و POI (FE65 في هذه الدراسة) و (3) التصوير وتحليل الخلايا العصبية باستخدام معالجه الصور البرمجيات ImageJ مع البرنامج المساعد نيونونج10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

العصب العصبي هو حدث أساسي في تشكيل الدوائر العصبية اثناء تطوير الجهاز العصبي. تحدث الاضرار العصبية الشديدة والخلل الوظيفي المتشابك في مختلف الامراض العصبية والانحطاط المرتبط بالسن. ان التحقيق في أليات التي تنظم نمو العصب العصبي لن يؤدي فقط إلى إلقاء الضوء القيم علي العمليات التنموية للدماغ ولكن أيضا علي هذه الاضطرابات العصبية. ونظرا لكفاءة التحويل المنخفضة ، فانه من الصعب حاليا دراسة تاثير بروتين محدد علي نمو العصب العصبي في الخلايا العصبونات الاوليه. هنا ، ونحن وصف طريقه بسيطه للتحقيق في النمو العصبي من قبل المشتركة بين الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه مع EGFP والبروتين من الفائدة (POI). هذا الأسلوب يسمح بتحديد الخلايا العصبية المتحولة POI من خلال اشاره EGFP ، التالي يمكن تحديد تاثير البوي علي النمو العصبي بدقه. ويوفر هذا الفحص القائم علي EGFP نهجا ملائما للتحقيق في المسارات التي تنظم نمو العصب العصبي.

لاختبار هذه المنهجية ، استخدمنا cyto وعامل نمو العصب ngf ، والتي تبين ان تمنع وتحفز العصبية النمو علي التوالي14،15،16. تم قياس طول العصب من الخلايا العصبية مع EGFP بعد العلاج مع Cyto أو NGF. وكانت كفاءه التحويل من EGFP إلى الخلايا العص?...

Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

في هذا التقرير ، ونحن وصف بروتوكول بسيط لدراسة النمو العصبي في الخلايا العصبية القشرية الفئران الجنينية عن طريق المشاركة في الانتقال مع EGFP والبروتين من الفائدة.

فحص قائم علي بروتين الفلورية الخضراء المعززة لدراسة نمو العصب في الخلايا العصبية الاوليه

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

انخفاض كفاءة نقل هو عقبة رئيسية في تحديد كيفية تنشيط البروتين نوريت خارج في الخلايا العصبية الأولية. بروتوكولنا التغلب على هذه المسألة عن طريق co-transfection من EGFP لتحديد الخلايا المصابة بنجاح. ارتفاع معدل co-transfection من EGFP والبروتينات ذات الأهمية يضمن دقة المقايسة.وبالتالي، فإن تلطيخ الفلورة المناعية مطلوب الآن. كما يحدث نمو النوري أثناء التجديد العصبي، يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحديد أهداف جديدة لاستعادة شبكة الخلايا العصبية التالفة في صدمة الدماغ أو الأمراض العصبية. قبل البدء في الإجراء، ضع غطاء دائري معقمة 18 ملليمتر في كل بئر من 12 بئراً من لوحة ثقافة الأنسجة ومعطف كل غطاء مع خمسة ميكروغرام لكل ملليمتر من حل Poly-D-Lysine في حاضنة درجة مئوية مرطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل.في نهاية الحضانة، تعرق حل بولي-د-ليسين وشطف الأغطية بالماء العقيم. في اليوم الجنيني 18، ضع الرحم الذي تم حصاده من فأر Sprague Dawley الحامل في الوقت المناسب في طبق بيتري طوله 10 سنتيمترات واستخدم مقصًا صغيرًا للتشريح لفتح الرحم وساك السلوي. استخدم المقص لإزالة المشيمة واستخدام ملقط لنقل جنين كامل واحد إلى طبق بيتري جديد طوله 10 سنتيمترات يحتوي على جلوكوز PBS المبرد.استخدام مقص لقطع على طول خياطة القوس من الجمجمة واستخدام ملعقة صغيرة شقة لنقل الدماغ الجنينية في طبق جديد بيتري 10 سنتيمترا تحتوي على الجليد الطازجة الباردة PBS الجلوكوز. باستخدام اثنين من ملاقط رقم خمسة ومجهر تشريح، وفصل نصفي الدماغين من المخيخ والدماغ الجذعية وإزالة السحايا. ثم عزل القشرة من نصفي الكرة الدماغية ووضع القشرة في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على الجليد الطازجة الباردة PBS الجلوكوز.لثقافة الخلايا العصبية القشرية الأولية، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية، والسماح للقشرة لتسوية الجاذبية لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية قبل استبدال الجلوكوز PBS مع 0.05٪التربسين EDTA. اخلطي مع التنصّت اللطيف وحضن الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع نقرة لطيفة إضافية كل دقيقتين. في نهاية الحضانة ، أوقف الهضم مع أربعة ملليلترات من متوسط الصيانة واستخدم ماصة ملليلتر واحدة لفك الأنسجة مع التثلث اللطيف.رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من وسط الصيانة للطرد المركزي الثاني. Resuspend بيليه شكلت بعد الطرد المركزي الثاني في ملليلتر واحد من متوسطة الصيانة الطازجة للعد وطبقة الخلايا العصبية المعزولة في 6.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة القابلة للحياة لكل سنتيمتر التركيز التربيعي في ملليلتر واحد من الصيانة المتوسطة في بئر في 12 لوحة جيدا. بعد يومين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وتمييع EGFP واستهداف البروتين plasmid DNAs ومعدّر في اثنين من أنابيب منفصلة 1.5 ملليلتر ومن ثم مزجها معا.نقل الخلايا مع بناء EGFP بإضافة مزيج transfection إلى الآبار. بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مع 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني وإصلاحها مع 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد في غسل وإضافة الحد الأدنى من حجم الفلوريسنس تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية المجهر واحد لكل عينة.ثم نقل بعناية الأغطية المغلفة على وسائل الإعلام المتصاعدة مع العينات التي تواجه الشرائح الزجاجية. لتصوير نمو نيوريت، حدد الهدف 40X على مجهر epifluorescent وانقر فوق ابدأ لالتقاط الصور من ما لا يقل عن 40 الخلايا العصبية إيجابية EGFP سليمة لكل transfection. عندما تم تصوير جميع neurites ، افتح الصور الملتقطة في ImageJ مع Plugin NeuronJ وقياس طول أطول نيوريت لكل خلية عصبية من جسم الخلية إلى طرف مخروط النمو.ثم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها مع البرنامج لتحديد تأثير البروتينات المستهدفة على النمو نيوريت. Cytochalasin D يقمع تمديد نيوريت بطريقة تعتمد على الجرعة في حين يتم تعزيز نوريت outgrowth في الخلايا العصبية تعامل مع عامل نمو الأعصاب. وبالإضافة إلى ذلك, بروتين محول النمو العصبي FE65 يحفز بشكل كبير نيوريت خارج نمو مزدوج بالمقارنة مع الخلايا العصبية غير المُصابة.على الرغم من انخفاض كفاءة العدوى، يكشف تحليل الفلور المناعي أن أكثر من 80٪ من ثقافة الخلايا لمدة يومين يمكن أن تكون ناجحة في العدوى مع EGFP و FE65. يتم الكشف عن تعبير EGFP في ست ساعات بعد القذف في حين يتم الكشف عن FE65 لأول مرة في الساعة 12 ويتم اكتشاف كلتا الإشارات لمدة تصل إلى سبعة أيام بعد القذف. إن نقل الخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران بكميات مختلفة من الحمض النووي FE65 plasmid يكشف عن زيادة تعتمد على الجرعة في تمديد نيوريت مع 0 إلى 0.5 ميكروغرام من FE65 plasmid.ومع ذلك، لا يوجد فرق كبير في النمو في الخلايا العصبية التي اُصيبت بـ 0.5 أو ميكروغرام واحد من البلازميد. عند محاولة البروتوكول، من المهم عزل المنطقة المناسبة من الدماغ الجنيني. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لدراسة النمو العصبي في الخلايا العصبية المشتقة من iPSC الإنسان التي لديها أدوات قيمة للطب التجديدي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

النخابية ثمرة ثقافة الفحص و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; تقييم هجرة الخلايا المشتقة النخابية-

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

دمج بيريسيتيس حبة غشائي خلية نبتت الإنزيم

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

طريقة استخراج متعددة Omics للتحليل المتعمق للثقافات المتزامنة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...