Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra forsknings stipendierne i Hongkong, sundheds-og medicinal forskningsfonden (Hongkong), CUHK Direct Grant-ordningen, United College-fonden og TUYF-velgørenheds Trust.

Alle de fulgte procedurer var i overensstemmelse med de etiske standarder i dyreforsøg etiske komité for det kinesiske universitet i Hong Kong.
1. klargøring af Dæksedler
<ol><li>Placer en steril 18 mm cirkulær dækseddel i hver brønd af en 12-brønd vævskultur plade.</li>
	<li>Coveret med 5 μg/mL poly-D-lysin opløsning i en befugret 37 °C inkubator i mindst 1 time.</li>
	<li>Aspirer poly-D-lysin opløsning fra vævskultur pladen og skyl de coatede dæksedler én gang med sterilt v...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Som nævnt før, PC12 og dens subkloner er almindeligt ansat til at studere neurite udvidelse, fordi de har fremragende transfektering effektivitet2,3. I modsætning hertil, primære neuroner har en lav transfektering sats, som er en stor hindring for at studere neurite udvækst regulatorer ved transfektering7. Her beskriver vi en bekvem protokol til kvantificering af neurite-udvækst i primære neuroner. På trods af den lave samlede tran...

Neurites, herunder både axoner og dendritter, er fremskrivninger fra neuroner, der er involveret i etableringen af neurale netværk. Den dynamiske udvækst af neuritter er afgørende for Neuro udvikling. De underliggende reguleringsmekanismer er dog stadig uklare. Især neurite skader er ofte observeret i forskellige neurodegenerative sygdomme og efter hjerneskader1. Derfor, undersøgelse af rollerne af formodede molekyler i forskellige neurite udvækst regulerings veje ville forbedre vores forståelse af processen. Desuden, det kan afsløre nye terapeutiske mål for forskellige neurologiske lidelser. Neuronal cellelinjer er værdifulde modeller for at studere neuronal processer, herunder neurite udvækst, da de er nemme at manipulere og transficere2,3. Imidlertid er genetisk afdrift blevet rapporteret at forekomme i nogle almindeligt anvendte cellelinjer, hvilket kan føre til variationer i deres fysiologiske respons4. Desuden er differential protein ekspression blevet vist mellem neuronal cellelinjer og primære neuroner. For eksempel, PC12, en neuronal cellelinje afledt af rotte binyrerne, der er almindeligt anvendt til at studere neurite udvækst2,3, ikke udtrykker NMDA-receptorer5. Desuden er det blevet foreslået, at den reducerede reaktionsevne af muse neuroblastom linje Neuro-2A til neurotoksiner i forhold til primære neuroner skyldes den manglende ekspression af visse membranreceptorer og Ionkanaler6. Derfor, primære neuroner er en mere ønskelig og repræsentativ model for undersøgelse af neurite outgrowth. Men, brugen af primære neuroner hæmmes af deres lave transfektering effektivitet7.
Her beskriver vi en metode, der involverer Co-transfection af det protein af interesse (POI) og EGFP til primære rotte kortikale neuroner. Den egfp fungerer som en morfologiske markør for identifikation af vellykkede transficeret neuroner og tillader måling af neurites. Vi validerede denne metode ved hjælp af forbindelser/molekyler, der er blevet rapporteret at moduere neurite outgrowth. Desuden, FE65, et neuronal adapter protein, der har vist sig at stimulere neurite udvækst, blev brugt til at illustrere denne fremgangsmåde8,9. Denne protokol indebærer (1) isolering af primære kortikale neuroner fra embryonale dag 18 (E18) rotte embryoner, (2) Co-transfection af neuroner med EGFP og POI (FE65 i dette studie) og (3) billeddannelse og analyse af neuroner ved hjælp af billedbehandling software ImageJ med NeuronJ plugin10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Neurite udvækst er en fundamental begivenhed i dannelsen af neurale kredsløb under nervesystemet udvikling. Svær neurit skade og synaptisk dysfunktion forekommer i forskellige neurodegenerative sygdomme og aldersrelaterede degeneration. Undersøgelse af de mekanismer, der regulerer neurite udvækst ville ikke kun kaste værdifuldt lys på hjernens udviklingsmæssige processer, men også på sådanne neurologiske lidelser. På grund af den lave transfektering effektivitet, er det i øjeblikket udfordrende at studere virkningen af et specifikt protein på neurite udvækst i primære pattedyr neuroner. Her beskriver vi en simpel metode til undersøgelse af neurite udvækst ved co-transfection af primære rotte kortikale neuroner med EGFP og et protein af interesse (POI). Denne metode gør det muligt at identificere POI transficeret neuroner gennem egfp signal, og dermed virkningen af POI på neurite udvækst kan bestemmes præcist. Denne EGFP-baserede analyse giver en bekvem tilgang til undersøgelse af veje, der regulerer neurite outgrowth.

For at teste denne metode, vi brugte cyto D og nerve vækstfaktor ngf, som har vist sig at hæmme og stimulere neurite udvækst henholdsvis14,15,16. Neurite-længden af neuroner, der blev transficeret med EGFP, blev målt efter behandling med cyto D eller NGF. Den transfektering effektivitet af egfp til neuroner var 2,7% (1.068 neuroner tælles). Som vist i figur 1<s...

Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

I denne rapport beskriver vi en simpel protokol til undersøgelse af neurit-vækst i embryonale rotte kortikale neuroner ved co-transftering med EGFP og det protein af interesse.

En forbedret grøn fluorescens protein-baseret assay til at studere Neurite udvækst i primære neuroner

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Lav transfektionseffektivitet er en væsentlig hindring for at bestemme, hvordan protein genaktiverer neurite udvækst i primære neuroner. Vores protokol overvinde dette problem ved co-transfection af EGFP at identificere held transfekterede celler. Egfp's høje co-transfektionsrate og de interesseproteiner sikrer nøjagtigheden af analysen.Og derfor, immunfluorescens farvning er nu påkrævet. Som neurite udvækst opstår under neural regenerering, denne metode kan anvendes til identifikation af nye mål for at genoprette den beskadigede neuronale netværk i hjernen traumer eller neurodegenerative sygdomme. Før du begynder proceduren, placere en steril 18 millimeter cirkulær coverslip i hver brønd af en 12 godt væv kultur plade og pels hver coverslip med fem mikrogram pr millimeter poly-D-lysin opløsning i en befugtet 37 grader Celsius inkubator i mindst en time.Ved inkubationens afslutning aspirere poly-D-lysinopløsningen og dæk dækslerne med sterilt vand. På embryonale dag 18, placere livmoderen høstet fra en timet gravid Sprague Dawley rotte i en 10 centimeter petriskål og bruge små dissekere saks til at åbne livmoderen og fostervandssækken. Brug saksen til at fjerne moderkagen og bruge vices til at overføre et helt embryon til en ny 10 centimeter petriskål indeholdende kølet PBS-glukose.Brug saksen til at skære langs kraniets sagittale sutur og bruge en lille flad spatel til at overføre fosterhjernen til en ny 10 centimeter petriskål indeholdende frisk iskold PBS-glukose. Ved hjælp af to nummer fem pincet og en dissektion mikroskop, adskille de to cerebrale halvkugler fra lillehjernen og hjernestammen og fjerne meninges. Derefter isolere cortex fra hjernehalvdel og placere cortex i en 15 milliliter rør, der indeholder frisk iskold PBS glukose.For primær kortikal neuron kultur, i en klasse II biosikkerhed kabinet, tillade cortex at bosætte sig ved tyngdekraften i fem minutter ved fire grader Celsius før udskiftning af PBS glukose med 0,05% trypsin EDTA. Bland med blid aflytning og inkubere vævet i en 37 grader Celsius vandbad i 10 minutter med yderligere blid aflytning hvert andet minut. Ved slutningen af inkubationen skal fordøjelsen stoppes med fire milliliter vedligeholdelsesmedium, og der anvendes en pipette med en milliliter til at adskille vævet med skånsom trituration.Cellerne sedimenteres ved centrifugering og resuspenderede pellet i en milliliter vedligeholdelsesmedium til endnu en centrifugering. Opsplit pellet dannet efter den anden centrifugering i en milliliter frisk vedligeholdelse medium til optælling og plade de isolerede neuroner på en 6,5 gange 10 til den fjerde levedygtige celler per centimeter kvadreret koncentration i en milliliter vedligeholdelse medium per brønd i en 12 brønd plade. Efter to dage ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid fortyndes EGFP og mål protein plasmid DNAs og transfektion reagens i to separate 1,5 milliliter rør og derefter blande dem sammen.Transfect cellerne med EGFP konstruere ved at tilføje transfektion mix til brøndene. Efter 24 timer vaskes cellerne med 37 grader Celsius PBS, og de repareres med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes de faste celler tre gange med frisk PBS pr. vask, og der tilsættes et minimalt fluorescensmonteringsmedium på et mikroskopglas pr. prøve.Overfør derefter forsigtigt de overtrerede dækslæber på monteringsmediet med prøverne mod glasdiasene. For at afbilde neurite vækst, skal du vælge 40X mål på en epifluorescerende mikroskop og klik begynde at tage billeder fra mindst 40 intakt EGFP positive neuroner pr transfektion. Når alle neuritterne er afbildet, skal du åbne de optagne billeder i ImageJ med NeuronJ-plugin'en og måle længden af den længste neurite af hver neuron fra cellekroppen til spidsen af vækstkeden.Derefter analysere de data, der opnås med softwaren til at bestemme effekten af de målrettede proteiner på neurite vækst. Cytochalasin D undertrykker neurite forlængelse i en dosis-afhængig måde, mens neurite udvækst er forbedret i neuroner behandlet med nerve vækstfaktor. Desuden stimulerer det neuronale vækstadapterprotein FE65 betydeligt neurite udvækst to gange sammenlignet med ikke-transmittede neuroner.På trods af en lav transfektionseffektivitet viser immunfluorescensanalyse, at over 80 % af en to-dages cellekultur med succes kan co-transsideres med EGFP og FE65. EGFP-udtryk registreres seks timer efter transinfektion, mens FE65 først registreres ved time 12, og begge signaler registreres i op til syv dage efter transfektion. Transinfektionen af primære rottekortikaneroner med forskellige mængder FE65 plasmid DNA afslører en dosisafhængig stigning i neuriteks extension med 0 til 0,5 mikrogram FE65 plasmid.Der observeres dog ingen signifikant vækstforskel hos neuroner, der transficeres med 0,5 eller et mikrogram af plasmid. Når du forsøger protokollen, er det vigtigt at isolere den relevante region fra embryonale hjernen. Denne teknik kan også anvendes til undersøgelse af neural vækst i humane iPSC-afledte neuroner, som har værdifulde værktøjer til regenerativ medicin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardial Udvækst Kultur Assay og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Vurdering af Epikardial-afledt cellemigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Kirurgisk Ablation Assay for studere Eye Regeneration i planarier

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Indarbejde Pericytes i en endotel celle perle spiring Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion og validering af cellulære gulne i primære humane celler

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

En multi-omics ekstraktionsmetode til dybtgående analyse af synkroniserede kulturer af den grønne Alga chlamydomonas Calabaria

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...