Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du Health and Medical Research Fund (Hong Kong), du programme de subventions directes de la CUHK, du fonds de dotation du United College et du TUYF Charitable Trust.

Toutes les procédures suivies étaient conformes aux normes éthiques du comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université chinoise de Hong Kong.
1. Préparation des fiches de couverture
<ol><li>Placez un bordereau circulaire stérile de 18 mm dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire de 12 puits.</li>
	<li>Enrober la couverture d'une solution poly-Lysine de 5 g/mL dans un incubateur humidifié de 37 oC pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Aspirez la solution poly-D-ly...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Comme indiqué précédemment, PC12 et ses sous-clones sont largement utilisés pour étudier l'extension de neurite parce qu'ils ont une excellente efficacité de transfection2,3. En revanche, les neurones primaires ont un faible taux de transfection, qui est un obstacle majeur pour l'étude des régulateurs de croissance neurite par transfection7. Ici, nous décrivons un protocole commode pour quantifier la croissance de neurite dans les...

Les neurites, y compris les axones et les dendrites, sont les projections des neurones impliqués dans l'établissement des réseaux neuronaux. La croissance dynamique des neurites est essentielle au neurodéveloppement. Cependant, les mécanismes de réglementation sous-jacents restent flous. En particulier, des dommages de neurite sont souvent observés dans diverses maladies neurodegenerative et après des dommages de cerveau1. Par conséquent, l'étude des rôles des molécules putatives dans diverses voies réglementaires de croissance neurite améliorerait notre compréhension du processus. En outre, il peut révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour divers désordres neurologiques. Les lignées cellulaires neuronales sont des modèles précieux pour l'étude des processus neuronaux, y compris la croissance neurite car ils sont faciles à manipuler et transfect2,3. Cependant, la dérive génétique a été rapportée pour se produire dans quelques lignées de cellules couramment utilisées, qui pourraient mener aux variations dans leurs réponses physiologiques4. En outre, l'expression différentielle de protéine a été montrée entre des lignes neuronales de cellules et des neurones primaires. Par exemple, PC12, une lignée cellulaire neuronale dérivée de la glande surrénale rat qui est largement utilisé pour étudier la croissance neurite2,3, n'exprime pas les récepteurs NMDA5. En outre, il a été proposé que la réactivité réduite de la ligne de neuroblastome de souris neuro-2a aux neurotoxines par rapport aux neurones primaires est due au manque d'expression de certains récepteurs de membrane et canaux d'ion6. Par conséquent, les neurones primaires sont un modèle plus souhaitable et représentatif pour l'étude de la croissance neurite. Cependant, l'utilisation des neurones primaires est entravée par leur faible efficacité de transfection7.
Ici, nous décrivons une méthode qui implique la co-transfection de la protéine d'intérêt (POI) et de l'EGFP aux neurones corticaux primaires de rat. L'EGFP agit comme un marqueur morphologique pour l'identification des neurones transfectés avec succès et permet de mesurer les neurites. Nous avons validé cette méthode en utilisant des composés/molécules qui ont été rapportés pour moduler la croissance de neurite. En outre, FE65, une protéine adaptatrice neuronale qui a été montrée pour stimuler la croissance neurite, a été employée pour illustrer cette approche8,9. Ce protocole implique (1) l'isolement des neurones corticaux primaires des embryons embryonnaires de rat 18 (E18), (2) la co-transfection des neurones avec EGFP et le POI (FE65 dans cette étude) et (3) l'imagerie et l'analyse des neurones en utilisant le traitement de l'image logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

La croissance neurite est un événement fondamental dans la formation des circuits neuronaux pendant le développement du système nerveux. Les dommages graves de neurite et le dysfonctionnement synaptique se produisent dans diverses maladies neurodegenerative et dégénérescence relative à l'âge. L'étude des mécanismes qui règlent la croissance de neurite jetterait non seulement la lumière valable sur des processus développementals de cerveau mais également sur de tels désordres neurologiques. En raison de la faible efficacité de transfection, il est actuellement difficile d'étudier l'effet d'une protéine spécifique sur la croissance neurite chez les neurones mammifères primaires. Ici, nous décrivons une méthode simple pour l'étude de la croissance de neurite par la co-transfection des neurones corticaux primaires de rat avec EGFP et une protéine d'intérêt (POI). Cette méthode permet d'identifier les neurones transfectés POI par le signal EGFP, et ainsi l'effet de l'IPI sur la croissance neurite peut être déterminé avec précision. Cet exemple d'EGFP fournit une approche pratique pour l'étude des voies régulant la croissance neurite.

Pour tester cette méthodologie, nous avons utilisé Cyto D et facteur de croissance nerveuse NGF, qui ont été montrés pour inhiber et stimuler la croissance neurite respectivement14,15,16. La longueur neurite des neurones transfectés avec EGFP ont été mesurées après traitement avec Cyto D ou NGF. L'efficacité de transfection de l'EGFP aux neurones était de 2,7 % (1 068 neurones compté...

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An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole simple pour étudier la croissance neurite dans les neurones corticaux embryonnaires de rat en co-transfectant avec l'EGFP et la protéine d'intérêt.

Un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Une faible efficacité de transfection est un obstacle majeur à la détermination de la façon dont les protéines réactivent la prolifération des neurites dans les neurones primaires. Notre protocole a surmonté ce problème par co-transfection de l’EGFP pour identifier avec succès les cellules transfected. Le taux élevé de co-transfection de l’EGFP et les protéines d’intérêt assure l’exactitude de l’analyse.Et par conséquent, la coloration d’immunofluorescence est maintenant exigée. Comme l’excroissance neurite se produit pendant la régénération neuronale, cette méthode peut être appliquée à l’identification de nouvelles cibles pour restaurer le réseau neuronal endommagé dans les traumatismes cérébraux ou les maladies neurodégénératives. Avant de commencer l’intervention, placez un couvercle circulaire stérile de 18 millimètres dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits et enduire chaque coverslip de cinq microgrammes par millimètre de solution Poly-D-Lysine dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius pendant au moins une heure.À la fin de l’incubation, aspirer la solution Poly-D-Lysine et rincer les couvercles à l’eau stérile. Le jour embryonnaire 18, placez l’utérus récolté à partir d’un rat Sprague Dawley enceinte dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et utilisez de petits ciseaux disséquants pour ouvrir l’utérus et le sac amniotique. Utilisez les ciseaux pour enlever le placenta et utiliser des forceps pour transférer un embryon entier dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du glucose PBS réfrigéré.Utilisez les ciseaux pour couper le long de la suture sagittale du crâne et utilisez une petite spatule plate pour transférer le cerveau embryonnaire dans une nouvelle boîte petri de 10 centimètres contenant du glucose PBS froid et glacé frais. À l’aide de deux pinces à épiler numéro cinq et d’un microscope à dissection, séparer les deux hémisphères cérébraux du cervelet et du tronc cérébral et enlever les méninges. Puis isoler le cortex des hémisphères cérébraux et placer le cortex dans un tube de 15 millilitres contenant du glucose PBS froid de glace fraîche.Pour la culture corticale primaire de neurone, dans une armoire de biosécurité de classe II, permettent au cortex de s’installer par gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avant de remplacer le glucose de PBS par 0.05%trypsin EDTA. Mélanger avec des taraudages doux et incuber le tissu dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avec des écoutes douces supplémentaires toutes les deux minutes. À la fin de l’incubation, arrêter la digestion avec quatre millilitres de milieu d’entretien et utiliser une pipette d’un millilitre pour dissocier le tissu avec trituration douce.Sédimenter les cellules par centrifugation et resuspendre la pastille dans un millilitre de milieu d’entretien pour une deuxième centrifugation. Resuspendez la pastille formée après la deuxième centrifugation en un millilitre de milieu d’entretien frais pour compter et plaquer les neurones isolés à 6,5 fois 10 à la quatrième cellule viable par centimètre de concentration carrée en un millilitre de milieu d’entretien par puits dans une plaque de puits de 12 puits. Après deux jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, diluer l’EGFP et cibler les ADN plasmides protéiques et le réaccente de transfection dans deux tubes distincts de 1,5 millilitre, puis les mélanger ensemble.Transfect les cellules avec EGFP construire en ajoutant le mélange de transfection aux puits. Après 24 heures, laver les cellules avec 37 degrés Celsius PBS et les fixer avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les cellules fixes trois fois avec du PBS frais par lavage et ajouter un volume minimal de fluorescence moyenne de montage sur une diapositive de verre microscope par échantillon.Ensuite, transférez soigneusement les couvre-toits enduits sur le support de montage avec les échantillons faisant face aux glissières de verre. Pour imager la croissance du neurite, sélectionnez l’objectif 40X sur un microscope épifluorescent et cliquez sur commencer à capturer des images à partir d’au moins 40 neurones positifs EGFP intacts par transfection. Lorsque tous les neurites ont été photographiés, ouvrez les images capturées dans ImageJ avec le plugin NeuronJ et mesurez la longueur du plus long neurite de chaque neurone du corps cellulaire jusqu’à la pointe du cône de croissance.Ensuite, analyser les données obtenues avec le logiciel pour déterminer l’effet des protéines ciblées sur la croissance du neurite. Cytochalasin D supprime l’extension de neurite d’une manière dose-dépendante tandis que l’excroissance de neurite est augmentée dans les neurones traités avec le facteur de croissance de nerf. En outre, la protéine d’adaptateur de croissance neuronale FE65 stimule significativement la croissance neurite double par rapport aux neurones non infectés.En dépit d’une faible efficacité de transfection, l’analyse d’immunofluorescence indique que plus de 80% d’une culture cellulaire de deux jours peut être avec succès co-transfected avec EGFP et FE65. L’expression EGFP est détectée à six heures après transfection tandis que FE65 est détectée pour la première fois à l’heure 12 et que les deux signaux sont détectés jusqu’à sept jours après la transfection. La transfection des neurones corticals primaires de rat avec différentes quantités de l’ADN plasmide fe65 indique une augmentation dose-dépendante de l’extension de neurite avec 0 à 0.5 microgrammes de plasmide FE65.Cependant, aucune différence significative dans la croissance n’est observée dans les neurones transfectés avec 0,5 ou un microgramme du plasmide. Lorsque vous essayez le protocole, il est important d’isoler la région appropriée du cerveau embryonnaire. Cette technique peut également être appliquée à l’étude de la croissance neuronale chez les neurones humains dérivés de l’iPSC qui ont des outils précieux pour la médecine régénérative.

Research

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