Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, health and Medical Research Fund (Hong Kong), CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt.

Alle verfahren entsprachen den ethischen Standards der Ethikkommission für Tierversuche der Chinesischen Universität Hongkong.
1. Herstellung von Coverlips
<ol><li>Legen Sie einen sterilen 18 mm runden Abdeckungsslip in jeden Brunnen einer 12-Well-Gewebekulturplatte.</li>
	<li>Beschichten Sie den Deckelschlupf mit 5 g/ml Poly-D-Lysin-Lösung in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator für mindestens 1 h.</li>
	<li>Die Poly-D-Lysin-Lösung von der Gewebekulturplatte absaugen und die beschichtet...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Wie bereits erwähnt, PC12 und seine Subklonen sind weit verbreitet für das Studium der Neuritenerweiterung verwendet, weil sie ausgezeichnete Transfektionseffizienz2,3haben. Im Gegensatz dazu haben primäre Neuronen eine niedrige Transfektionsrate, was ein großes Hindernis für die Untersuchung von Neuriten-Auswuchsregulatoren durch Transfektion7darstellt. Hier beschreiben wir ein praktisches Protokoll zur Quantifizierung des Neuritenwa...

Neurite, einschließlich Axone und Dendriten, sind die Projektionen von Neuronen, die an der Etablierung der neuronalen Netze beteiligt sind. Das dynamische Wachstum von Neuriten ist für die Neuroentwicklung unerlässlich. Die zugrunde liegenden Regulierungsmechanismen bleiben jedoch unklar. Insbesondere neuritäre Schäden werden oft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und nach Hirnverletzungen beobachtet1. Daher würde die Untersuchung der Rolle vermeintlicher Moleküle in verschiedenen neuriteren Auswuchs-Regulierungswegen unser Verständnis des Prozesses verbessern. Darüber hinaus kann es neue therapeutische Ziele für verschiedene neurologische Störungen offenbaren. Neuronale Zelllinien sind wertvolle Modelle für die Untersuchung neuronaler Prozesse einschließlich Neuritenwachstum, da sie leicht zu manipulieren und transfektsind 2,3. Es wurde jedoch berichtet, dass genetische Drift in einigen häufig verwendeten Zelllinien auftritt, was zu Variationen ihrer physiologischen Reaktionen führen könnte4. Darüber hinaus wurde eine differenzielle Proteinexpression zwischen neuronalen Zelllinien und primären Neuronen gezeigt. Zum Beispiel, PC12, eine neuronale Zelllinie aus Derbe rinder Nebennieren, die weit verbreitet für die Untersuchung von Neuritenauswachsen verwendet wird2,3, nicht ausdrücken NMDA-Rezeptoren5. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die reduzierte Reaktionsfähigkeit der Maus Neuroblastom Linie Neuro-2a zu Neurotoxinen im Vergleich zu primären Neuronen ist aufgrund der mangelnden Expression bestimmter Membranrezeptoren und Ionenkanäle6. Daher sind primäre Neuronen ein wünschenswerteres und repräsentativeres Modell für die Untersuchung des Neuritenwachstums. Jedoch, die Verwendung von primären Neuronen wird durch ihre geringe Transfektion Effizienz behindert7.
Hier beschreiben wir eine Methode, die die Kotransfektion des Proteins von Interesse (POI) und EGFP in primäre kortikale Neuronen der Ratte beinhaltet. Das EGFP dient als morphologischer Marker zur Identifizierung erfolgreich transfizierter Neuronen und ermöglicht die Messung von Neuriten. Wir validierten diese Methode, indem wir Verbindungen/Moleküle verwendet haben, von denen berichtet wurde, dass sie das Neuritenwachstum modulieren. Darüber hinaus wurde FE65, ein neuronales Adapterprotein, das nachweislich das Neuritenwachstum stimuliert, verwendet, um diesen Ansatz zu veranschaulichen8,9. Dieses Protokoll beinhaltet (1) die Isolierung von primären kortikalen Neuronen von embryonalen Tag 18 (E18) Rattenembryonen, (2) die Kotransfektion von Neuronen mit EGFP und dem POI (FE65 in dieser Studie) und (3) die Bildgebung und Analyse der Neuronen mit Hilfe der Bildverarbeitung Software ImageJ mit dem NeuronJ Plugin10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Neuritenwachstum ist ein grundlegendes Ereignis bei der Bildung der neuronalen Schaltkreise während der Entwicklung des Nervensystems. Schwere Neuritenschäden und synaptische Dysfunktion treten bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und altersbedingten Degeneration nen auf. Die Untersuchung der Mechanismen, die das Neuritenwachstum regulieren, würde nicht nur wertvolles Licht auf die Entwicklungsprozesse des Gehirns werfen, sondern auch auf solche neurologischen Störungen. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz ist es derzeit schwierig, die Wirkung eines bestimmten Proteins auf das Neuritenwachstum in primären Säugetierneuronen zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Untersuchung des Neuritenauswuchses durch die Kotransfektion von primären kortikalen Neuronen der Ersten Ratte mit EGFP und einem Protein von Interesse (POI). Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von POI transfizierten Neuronen über das EGFP-Signal, und so kann die Wirkung des POI auf das Neuritenwachstum genau bestimmt werden. Dieser EGFP-basierte Assay bietet einen bequemen Ansatz für die Untersuchung von Wegen zur Regulierung des Neuritenwachstums.

Um diese Methode zu testen, verwendeten wir Cyto D und den Nervenwachstumsfaktor NGF, die nachweislich das Neuritenwachstum bzw.14,15,16hemmen und stimulieren. Die Neuritenlänge der mit EGFP transfizierten Neuronen wurde nach der Behandlung mit Cyto D oder NGF gemessen. Die Transfektionseffizienz von EGFP auf die Neuronen betrug 2,7% (1.068 Neuronen gezählt). Wie in Abbildu...

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An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

In diesem Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Untersuchung des Neuritenauswüchss in embryonalen kortikalen Neuronen von Ratten durch Co-Transfecting mit EGFP und dem Protein von Interesse.

Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Niedrige Transfektionseffizienz ist ein großes Hindernis für die Bestimmung, wie Protein reaktiviert Neuritenwachstum in primären Neuronen. Unser Protokoll behebt dieses Problem durch die Co-Transfektion von EGFP, um erfolgreich transfizierte Zellen zu identifizieren. Die hohe Co-Transfektionsrate von EGFP und den Proteinen von Interesse gewährleistet die Genauigkeit des Assays.Und folglich ist jetzt eine Immunfluoreszenzfärbung erforderlich. Da das Neuritenwachstum während der neuronalen Regeneration auftritt, kann diese Methode zur Identifizierung neuartiger Ziele zur Wiederherstellung des beschädigten neuronalen Netzwerks bei Hirntraumata oder neurodegenerativen Erkrankungen angewendet werden. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, legen Sie einen sterilen 18-Millimeter-Runddeckel in jeden Brunnen einer 12 Brunnen-Gewebekulturplatte und beschichten Sie jeden Coverslip mit fünf Mikrogramm pro Millimeter Poly-D-Lysin-Lösung mindestens eine Stunde lang in einem befeuchteten 37-Grad-Grad-Zirkationszentrum.Am Ende der Inkubation die Poly-D-Lysin-Lösung ansaugen und die Deckellipsen mit sterilem Wasser abspülen. Legen Sie am 18. Tag der Embryonal die Gebärmutter, die von einer schwangeren Sprague Dawley Ratte geerntet wurde, in eine 10 Zentimeter lange Petrischale und öffnen Sie mit einer kleinen Sezierschere die Gebärmutter und den Fruchtwassersack. Verwenden Sie die Schere, um die Plazenta zu entfernen und verwenden Sie Zangen, um einen ganzen Embryo in eine neue 10-Zentimeter-Petrischale mit gekühlter PBS-Glukose zu übertragen.Verwenden Sie die Schere, um entlang der sagittalen Naht des Schädels zu schneiden und verwenden Sie einen kleinen flachen Spachtel, um das embryonale Gehirn in eine neue 10 Zentimeter Petrischale mit frischer eiskalter PBS-Glukose zu übertragen. Trennen Sie mit zwei Pinzetten nummer iert er und einem Zerlegungsmikroskop die beiden Hirnhalbkugeln vom Kleinhirn und Hirnstamm und entfernen Sie die Hirnhirne. Isolieren Sie dann den Kortex von den Großhirnhälften und legen Sie den Kortex in eine 15-Milliliter-Röhre, die frische eiskalte PBS-Glukose enthält.Für primäre kortikale Neuronenkultur, in einem Klasse II Biosicherheitskabinett, erlauben Sie dem Kortex, durch Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zu begleichen, bevor die PBS-Glukose durch 0,05% Trypsin EDTA ersetzt wird. Mischen Sie das Gewebe mit sanftem Klopfen und bebrüten Sie das Gewebe in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten mit zusätzlichem sanften Klopfen alle zwei Minuten. Am Ende der Inkubation, stoppen Sie die Verdauung mit vier Milliliter Wartungsmedium und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Gewebe mit sanfter Trituration zu dissoziieren.Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Pflegemedium für eine zweite Zentrifugation wieder auf. Setzen Sie das pellet, das nach der zweiten Zentrifugation gebildet wurde, in einem Milliliter frischem Pflegemedium zum Zählen und Verblechen der isolierten Neuronen bei einer 6,5-mal 10-zu-die-vierten lebensfähigen Zelle pro Zentimeter quadratische randalierte Konzentration in einem Milliliter Pflegemedium pro Brunnen in einer 12-Well-Platte wieder auf. Nach zwei Tagen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid EGFP und Zielproteinplasmid DNAs und Transfektionsreagenz in zwei separaten 1,5 Milliliter-Röhren verdünnen und dann vermischen.Transfezieren Sie die Zellen mit EGFP-Konstrukt, indem Sie den Transfektionsmix zu den Brunnen hinzufügen. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden mit 37 Grad Celsius PBS und fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die festen Zellen dreimal mit frischem PBS pro Waschgang waschen und ein minimales Volumen an Fluoreszenz-Montagemedium auf einem Mikroskopglasschlitten pro Probe hinzufügen.Dann die beschichteten Abdeckungen vorsichtig auf das Montagemedium mit den Proben zu den Glasgbessern übertragen. Um das Neuritenwachstum abzubilden, wählen Sie das 40-fache Objektiv auf einem Epifluoreszenzmikroskop aus und klicken Sie auf Start, um Bilder von mindestens 40 intakten EGFP-positiven Neuronen pro Transfektion zu erfassen. Wenn alle Neuriten abgebildet sind, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in ImageJ mit dem NeuronJ-Plugin und messen Sie die Länge des längsten Neuritus jedes Neurons vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels.Analysieren Sie dann die mit der Software erhaltenen Daten, um die Wirkung der gezielten Proteine auf das Neuritenwachstum zu bestimmen. Cytochalasin D unterdrückt die Neuritenverlängerung in einer dosisabhängigen Weise, während das Neuritenwachstum in Neuronen verstärkt wird, die mit dem Nervenwachstumsfaktor behandelt werden. Darüber hinaus stimuliert das neuronale Wachstumsadapterprotein FE65 das Neuritenwachstum im Vergleich zu untransfizierten Neuronen signifikant.Trotz einer geringen Transfektionseffizienz zeigt die Immunfluoreszenzanalyse, dass über 80 % einer zweitägigen Zellkultur erfolgreich mit EGFP und FE65 kotransfiziert werden können. Die EGFP-Expression wird nach der Transfektion nach sechs Stunden erkannt, während FE65 zum ersten Mal in Stunde 12 erkannt wird und beide Signale für bis zu sieben Tage nach der Transfektion erkannt werden. Die Transfektion von primären kortikalen Neuronen der Ersten Ratte mit unterschiedlichen Mengen an FE65-Plasmid-DNA zeigt eine dosisabhängige Zunahme der Neuritenerweiterung mit 0 bis 0,5 Mikrogramm FE65-Plasmid.Jedoch, kein signifikanter Unterschied im Wachstum wird bei Neuronen transfiziert mit 0,5 oder einem Mikrogramm des Plasmids beobachtet. Beim Versuch des Protokolls ist es wichtig, die entsprechende Region vom embryonalen Gehirn zu isolieren. Diese Technik kann auch auf die Untersuchung des neuronalen Wachstums in menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen angewendet werden, die wertvolle Werkzeuge für die regenerative Medizin haben.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Eine Multi-Omics Extraktionsmethode für die In-Depth-Analyse synchronisierter Kulturen der Grünen Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...