Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי כספים מן המועצה מענקים מחקר הונג קונג, בריאות ומחקר רפואי הקרן (הונג קונג), CUHK מענק הערכה, קרן הנאמנות של המכללה המאוחדת ו TUYF נאמנות צדקה.

כל ההליכים שלאחר מכן היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת האתיקה של הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הסינית בהונג קונג.
1. הכנת שוברי כיסוי
<ol><li>מניחים כיסוי סטרילי מעגלי 18 מ"מ לתוך כל טוב של לוחית 12-היטב הרקמה רקמות.</li>
	<li>לחלוק את הסרבל עם 5 μg/mL פולי-D-ליזין פתרון מחולל 37 מעלו...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

כפי שצוין לפני, PC12 ושיבוטים שלה הם מועסקים נרחב ללמוד הארכה neurite כי יש להם יעילותמעולהמעבר 2,3. לעומת זאת, נוירונים ראשוניים יש שיעור מעבר נמוך, שהוא מכשול גדול ללמוד neurite מוצלח הרגולטורים על ידי התפתחות7. כאן, אנו מתארים פרוטוקול נוח לכמת neurite מוצל...

Neurites, כולל אקסונים ו דנדריטים, הם התחזיות מפני נוירונים המעורבים בהקמת רשתות עצביות. הצמיחה הדינמית של neurites היא חיונית עבור פיתוח נוירולוגי. עם זאת, מנגנוני הרגולציה הבסיסיים שמתחת נותרים ברורים. בפרט, נזק neurite הוא נצפה לעתים קרובות במחלות ניווניות שונים ואחרי פציעות המוח1. לכן, חקירת התפקידים של מולקולות neurite מוצלח מסלולים שונים הרגולציה ישפר את הבנתנו את התהליך. יתר על כן, זה עשוי לחשוף מטרות טיפוליות הרומן עבור הפרעות נוירולוגיות שונות. קווי התאים העצביים הם מודלים יקרי ערך עבור לימוד תהליכים עצביים כולל neurite מוצלח כפי שהם קל לתמרן ו transfect2,3. עם זאת, הסחף גנטי דווח להתרחש כמה קווי התאים הנפוצים, אשר יכול להוביל וריאציות התגובות הפיסיולוגיים שלהם4. יתר על כן, ביטוי החלבון הדיפרנציאלי הוכח בין קווי התאים העצביים והנוירונים הראשוניים. למשל, PC12, קו של תא עצבי שנגזר בלוטת יותרת הכליה חולדה המשמשת רבות ללימוד neurite מוצלח2,3, אינו מבטא קולטנים NMDA5. יתר על כן, זה כבר הציע כי התגובה מופחתת של העכבר שורה נוירובלסטומה בקווים עצביים-2a כדי נוירוטוקסינים בהשוואה לנוירונים הראשי הוא בשל חוסר ביטוי של קולטני קרום מסוימים וערוצי יון6. לכן, הנוירונים העיקריים הם מודל רצוי יותר ומייצג לחקירה של neurite outgrowth. עם זאת, השימוש בנוירונים הראשי מפריע היעילות שלהם הזיהום הנמוך7.
כאן, אנו מתארים שיטה המערבת שיתוף הזיהום של חלבון הריבית (פוי) ו-EGFP לנוירונים הראשי הקליפת העור הפנים. ה-EGFP משמש כסמן מורפולוגי לזיהוי נוירונים שעברו בהצלחה ומאפשר את המדידה של neurites. אנו אימות שיטה זו באמצעות תרכובות/מולקולות שדווחו לווסת neurite outgrowth. יתר על כן, FE65, חלבון מתאם עצבי כי הוכח לעורר neurite outgrowth, שימש כדי להמחיש את הגישה הזאת8,9. פרוטוקול זה כולל (1) בידוד של נוירונים בקליפת העור העיקרי מן היום העובריים 18 (E18) עוברי חולדה, (2) את שיתוף הפעולה של נוירונים עם EGFP ואת פוי (FE65 במחקר זה) ו (3) הדמיה וניתוח של הנוירונים באמצעות עיבוד תמונה ImageJ של תוכנה עם תוסף עצבי10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Neurite מוצלח הוא אירוע בסיסי בהקמת מעגלים עצביים במהלך פיתוח מערכת העצבים. נזק neurite חמור ותפקוד סינפטית להתרחש במחלות ניווניות שונות ניוון הקשורות לגיל. חקירת מנגנוני הווסת neurite מוצלח לא רק לשפוך אור יקר על תהליכים התפתחותיים במוח אלא גם על הפרעות נוירולוגיות כאלה. בשל יעילות ההתפתחות הנמוכה, הוא כרגע מאתגר ללמוד את ההשפעה של חלבון מסוים על neurite מוצלח בנוירונים היונקים העיקריים. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לחקירה של neurite מוצלח ידי שיתוף ההתפתחות של נוירונים בקליפת המוח הראשי עם egfp וחלבון של עניין (פוי). שיטה זו מאפשרת זיהוי של הנוירונים מנוכר פוי באמצעות אות egfp, ובכך את ההשפעה של פוי על neurite מוצלח ניתן לקבוע בדיוק. זה מבוסס EGFP מספק גישה נוחה לחקירה של מסלולים ויסות neurite outgrowth.

כדי לבדוק מתודולוגיה זו, השתמשנו cyto D ואת גורם הגדילה העצבי ngf, אשר הוכחו לעכב ולעורר neurite מוצלח בהתאמה14,15,16. אורך neurite של נוירונים מנוכר עם EGFP נמדדו לאחר הטיפול עם Cyto D או NGF. היעילות של התרגום של EGFP לנוירונים הייתה 2.7% (1,068 נוי...

Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור לימוד neurite מוצלח בנוירונים הקליפת המוח העובריים על ידי שיתוף הפעולה עם egfp ואת חלבון הריבית.

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

יעילות transfection נמוכה היא מכשול מרכזי כדי לקבוע כיצד חלבון מחדש נויריט תיעוב בנוירונים ראשוניים. הפרוטוקול שלנו להתגבר על בעיה זו על ידי שיתוף transfection של EGFP כדי לזהות תאים שהועתקו בהצלחה. שיעור השיתוף-transfection הגבוה של EGFP וחלבוני הריבית מבטיחים את דיוק ההתוודאות.וכתוצאה מכך, כתמי שפעת חיסונית נדרשים כעת. כמו גידול neurite מתרחשת במהלך התחדשות עצבית, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זיהוי של מטרות חדשניות לשיקום הרשת העצבית פגום בטראומה מוחית או מחלות ניווניות. לפני תחילת ההליך, מניחים כיסוי עגול סטרילי של 18 מילימטר לתוך כל באר של צלחת תרבות רקמות 12 היטב ומעיל כל מכסה עם חמישה מיקרוגרם למילימטר של פתרון פולי-D-ליזין באינקובטור 37 מעלות צלזיוס לח במשך שעה אחת לפחות.בסוף הדגירה, שאפו את תסנובת הפולי-די-ליסין ושטוף את הכיסויים במים סטריליים. ביום העוברי 18, מניחים את הרחם שנקטף מעכברוש ספראג דאוולי בהריון מתוזמן לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ ולהשתמש מספריים לנתח קטן כדי לפתוח את הרחם ואת שיכר מי האמון. השתמש במספריים כדי להסיר את שליה ולהשתמש ממטרים להעביר עובר שלם אחד לתוך צלחת פטרי חדש 10 ס"מ המכיל גלוקוז PBS צונן.השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך התפר sagittal של הגולגולת ולהשתמש מרית שטוחה קטנה להעביר את המוח העוברי לתוך צלחת פטרי חדש 10 ס"מ המכיל קרח טרי קר PBS גלוקוז. באמצעות שני פינצטה מספר חמש ומיקרוסקופ ניתוח, להפריד את שתי ההמיספרות המוחיות מן המוח הקטן גזע המוח ולהסיר את קרום המוח. לאחר מכן לבודד את קליפת המוח מן ההמיספרות המוחיות ולמקום את קליפת המוח בצינור 15 מיליליטר המכיל גלוקוז PBS קר קרח טרי.לתרבות נוירונים קליפת המוח העיקרית, ב ארון biosafety בכיתה II, לאפשר קליפת המוח להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני החלפת גלוקוז PBS עם 0.05% טריפסין EDTA. מערבבים עם הקשה עדינה לה דגירה הרקמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עם הקשה עדינה נוספת כל שתי דקות. בסוף הדגירה, לעצור את העיכול עם ארבעה מיליליטר של מדיום תחזוקה ולהשתמש פיפטה מיליליטר אחד כדי לנטרל את הרקמה עם טריטורציה עדינה.להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של אמצעי תחזוקה עבור צנטריפוגה שנייה. תן מחדש את גלולה נוצר לאחר הצנטריפוגה השנייה במיליליטר אחד של מדיום תחזוקה טרי לספירה צלחת הנוירונים מבודדים ב 6.5 פעמים 10 לתאים קיימא הרביעית ריכוז בריבוע סנטימטר אחד של אמצעי תחזוקה לאורך 12 צלחת היטב. לאחר יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לדלל EGFP וחלבון היעד פלסמיד DNAs ו reagent transfection בשני צינורות נפרדים 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לערבב אותם יחד.לשנות את התאים עם מבנה EGFP על ידי הוספת תערובת transfection ל בארות. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים עם 37 מעלות צלזיוס PBS ולתקן אותם עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים עם PBS טרי לכל לשטוף ולהוסיף נפח מינימלי של מדיום הרכבה פלואורסצנטי על שקופית אחת זכוכית מיקרוסקופ לכל מדגם.לאחר מכן העבר בזהירות את הכיסויים הצפויים למדיית ההרכבה כאשר הדגימות פונות לשקופיות הזכוכית. כדי לדמיין את צמיחת הנויטריט, בחר את המטרה 40X במיקרוסקופ epifluorescent ולחץ להתחיל ללכוד תמונות של לפחות 40 נוירונים חיוביים EGFP שלמים לכל transfection. כאשר כל neurites כבר בתמונה, לפתוח את התמונות שנתפסו ImageJ עם תוסף NeuronJ ולמדוד את האורך של neurite הארוך ביותר של כל נוירון מגוף התא לקצה חרוט הצמיחה.לאחר מכן לנתח את הנתונים שהושגו עם התוכנה כדי לקבוע את ההשפעה של חלבונים ממוקדים על צמיחת neurite. ציטוכלאסין D מדכא הרחבת neurite באופן תלוי מינון בעוד צמיחת neurite משופרת נוירונים שטופלו עם גורם גדילה עצבי. בנוסף, חלבון מתאם הצמיחה העצבי FE65 מגרה באופן משמעותי גידול של נויריט פי שניים בהשוואה לנוירונים לא פתורים.למרות יעילות transfection נמוכה, ניתוח immunofluorescence מגלה כי מעל 80% של תרבות תאים יומיים ניתן לבצע בהצלחה שיתוף פעולה עם EGFP ו FE65. ביטוי EGFP מזוהה בשש שעות לאחר ההמרה בעוד FE65 מזוהה לראשונה בשעה 12 ושני האותות מזוהים עד שבעה ימים לאחר ההמרה. ההטמנה של נוירונים קליפת המוח עכברוש ראשי עם כמויות שונות של FE65 פלסמיד DNA מגלה עלייה תלוית מינון בהרחבת neurite עם 0 עד 0.5 מיקרוגרם של FE65 פלסמיד.עם זאת, אין הבדל משמעותי בצמיחה נצפתה נוירונים מנוקטים עם 0.5 או מיקרוגרם אחד של פלסמיד. בעת ניסיון הפרוטוקול, חשוב לבודד את האזור המתאים מהמוח העוברי. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על המחקר של צמיחה עצבית בנוירונים אנושיים שמקורם iPSC אשר יש כלים יקרי ערך לרפואה רגנרטיבית.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial תולדת תרבות Assay ו<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הערכה של נדידת תאים שמקורם Epicardial

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

שילוב Pericytes חרוז תא אנדותל הלבלוב Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

שיטת הפקת מולטי-Omics לניתוח מעמיק של תרבויות מסונכרנות של הירוק Alga Chlamydomonas הקשה

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...