Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
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इस काम को अनुसंधान अनुदान परिषद हांगकांग, स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान कोष (हांगकांग), सीयूएचके प्रत्यक्ष अनुदान योजना, यूनाइटेड कॉलेज एंडोमेंट फंड और टीयूवाईएफ चैरिटेबल ट्रस्ट से धन द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी प्रक्रियाओं का पालन हांगकांग के चीनी विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग नैतिकता समिति के नैतिक मानकों के अनुसार थे.
1. कवरलिप्स की तैयारी
<ol><li>एक बाँझ 18 मिमी परिपत्र कवरपर्ची एक 12 अच्छी तरह से ऊतक...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

जैसा कि पहले कहा गया है, पीसी 12 और इसके सबक्लोन को न्यूराइट एक्सटेंशन का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से नियोजित किया जाता है क्योंकि उनके पास उत्कृष्ट ट्रांसफेक्शन दक्षता2,3है । ?...

Neurites, दोनों axons और dendrites सहित, तंत्रिका नेटवर्क की स्थापना में शामिल न्यूरॉन्स से अनुमानों रहे हैं. तंत्रिका विकास के लिए न्यूराइट की गतिशील वृद्धि आवश्यक है। हालांकि, नीचे अंतर्निहित नियामक तंत्र स्पष्ट नहीं है। विशेष रूप से, न्यूराइट क्षति अक्सर विभिन्न neurodegenerative रोगों में और मस्तिष्क की चोटों के बादमनाया जाता है 1. इसलिए, विभिन्न न्यूराइट आउटग्रोथ नियामक रास्ते में putative अणुओं की भूमिका की जांच प्रक्रिया की हमारी समझ में सुधार होगा. इसके अलावा, यह विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य प्रकट कर सकते हैं. तंत्रिका कोशिका रेखाएं तंत्रिका प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान मॉडल हैं जिनमें न्यूराइट आउटग्रोथ भी शामिल है क्योंकि उनमें हेरफेर और ट्रांसफेक्ट2,3में आसानी होती है . तथापि, आनुवंशिक बहाव कुछ सामान्य रूप से प्रयुक्त कोशिका लाइनों में होने की सूचना मिली है, जो उनकी शारीरिक प्रतिक्रियाओं में बदलाव का कारण बन सकतीहै 4. इसके अलावा, अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति न्यूरॉन सेल लाइनों और प्राथमिक न्यूरॉन्स के बीच दिखाया गया है. उदाहरण के लिए, पीसी 12, चूहे अधिवृक्क ग्रंथि से व्युत्पन्न एक न्यूरोनल सेल लाइन जो व्यापक रूप से न्यूराइट आउटग्रोथ2,3, NMDA रिसेप्टर्स5व्यक्त नहीं करता है के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, यह प्रस्ताव किया गया है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स की तुलना में neurotoxins के लिए माउस neuroblastoma लाइन neuro-2a की कम प्रतिक्रिया कुछ झिल्ली रिसेप्टर्स और आयन चैनलों की अभिव्यक्ति की कमी के कारण है6. इसलिए, प्राथमिक न्यूरॉन्स neurite वृद्धि की जांच के लिए एक अधिक वांछनीय और प्रतिनिधि मॉडल हैं. हालांकि, प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग उनके कम transfection दक्षता7द्वारा बाधित है.
यहाँ, हम एक विधि है कि ब्याज के प्रोटीन के सह संक्रमण शामिल का वर्णन (POI) और प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स के लिए EGFP. EGFP सफलतापूर्वक transfected न्यूरॉन्स की पहचान के लिए एक रूपात्मक मार्कर के रूप में कार्य करता है और neurites की माप परमिट. हमने इस विधि को उन यौगिकों/अणुओं का उपयोग करके मान्य किया है जिनकी सूचना न्यूराइट आउटग्रोथ को मॉड्युलेट करने के लिए सूचित की गई है। इसके अलावा, FE65, एक न्यूरॉन एडेप्टर प्रोटीन है कि neurite वृद्धि को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है, इस दृष्टिकोण को समझाने के लिए इस्तेमाल किया गया था8,9. इस प्रोटोकॉल शामिल है (1) भ्रूण दिन से प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के अलगाव 18 (E18) चूहे भ्रूण, (2) EGFP और POI के साथ न्यूरॉन्स के सह-परिवर्तन (इस अध्ययन में FE65) और (3) इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके न्यूरॉन्स के विश्लेषण NeuronJ प्लगइन10,11के साथ सॉफ्टवेयर ImageJ .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

न्यूराइट आउटग्रोथ तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान तंत्रिका सर्किट के गठन में एक मौलिक घटना है। गंभीर न्यूराइट क्षति और synaptic रोग विभिन्न neurodegenerative रोगों और उम्र से संबंधित अध: पतन में होते हैं. तंत्र है कि neurite वृद्धि को विनियमित की जांच न केवल मस्तिष्क विकास प्रक्रियाओं पर मूल्यवान प्रकाश डाला जाएगा, लेकिन यह भी इस तरह के मस्तिष्क संबंधी विकारों पर. कम transfection दक्षता के कारण, यह वर्तमान में प्राथमिक स्तनधारी न्यूरॉन्स में neurite outgrowth पर एक विशिष्ट प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. यहाँ, हम EGFP और ब्याज की एक प्रोटीन (POI) के साथ प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स के सह-परिवर्तन द्वारा neurite वृद्धि की जांच के लिए एक सरल विधि का वर्णन. इस विधि EGFP संकेत के माध्यम से POI transfected न्यूरॉन्स की पहचान की अनुमति देता है, और इस प्रकार neurite outgrowth पर POI के प्रभाव ठीक निर्धारित किया जा सकता है. इस EGFP आधारित परख neurite आउटवृद्धि को विनियमित रास्ते की जांच के लिए एक सुविधाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है.

इस पद्धति का परीक्षण करने के लिए, हमने साइटो डी और तंत्रिका वृद्धि कारक एनजीएफ का उपयोग किया, जो क्रमशः14,15,16को बाधित और प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया ?...

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An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

इस रिपोर्ट में, हम EGFP और ब्याज के प्रोटीन के साथ सह-transfecting द्वारा भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स में neurite वृद्धि का अध्ययन करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन.

प्राथमिक न्यूरॉन्स में Neurite आउटवृद्धि के अध्ययन के लिए एक बढ़ी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित परख

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

कम ट्रांसफैक्शन दक्षता यह निर्धारित करने में एक बड़ी बाधा है कि प्रोटीन प्राथमिक न्यूरॉन्स में न्यूराइट आउटग्रोथ को कैसे फिर से सक्रिय करता है। हमारा प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए ईजीएफपी के सह-ट्रांसफैक्शन द्वारा इस मुद्दे को दूर करता है। ईजीएफपी की उच्च सह-ट्रांसफेक्शन दर और ब्याज के प्रोटीन परख की सटीकता सुनिश्चित करते हैं।और नतीजतन, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला अब आवश्यक है। चूंकि न्यूरल पुनर्जनन के दौरान न्यूराइट आउटग्रोथ होता है, इस विधि को मस्तिष्क आघात या न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में क्षतिग्रस्त न्यूरोनल नेटवर्क को बहाल करने के लिए उपन्यास लक्ष्यों की पहचान के लिए लागू किया जा सकता है। प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक बाँझ 18 मिलीमीटर परिपत्र कवरलिप को 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में रखें और प्रत्येक कवरस्लिप को कम से कम एक घंटे के लिए आर्द्रीकृत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पॉली-डी-Lysine समाधान के पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीमीटर के साथ रखें।इनक्यूबेशन के अंत में, पॉली-डी-Lysine समाधान को एस्पिरेट करें और बाँझ पानी के साथ कवरस्लिप कुल्ला करें। भ्रूणीय दिन 18 पर, गर्भाशय को एक समय पर गर्भवती स्प्राग डावले चूहे से 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में काटा जाता है और गर्भाशय और एमनियोटिक थैली को खोलने के लिए छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। प्लेसेंटा को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें और एक पूरे भ्रूण को ठंडा पीबीएस ग्लूकोज युक्त एक नए 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें।खोपड़ी के sagittal सीवन के साथ कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें और एक छोटे से फ्लैट स्पैटुला का उपयोग करने के लिए एक नया 10 सेंटीमीटर पेट्री ताजा बर्फ ठंड PBS ग्लूकोज युक्त पकवान में भ्रूण मस्तिष्क हस्तांतरण । दो नंबर पांच चिमटी और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, दो मस्तिष्क गोलार्द्धों को सेरिबैलम और मस्तिष्क स्टेम से अलग करें और मेनिंग्स को हटा दें। फिर कॉर्टेक्स को मस्तिष्क गोलार्द्धों से अलग करें और कॉर्टेक्स को 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें जिसमें ताजा बर्फ ठंडी पीबीएस ग्लूकोज हो।प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन संस्कृति के लिए, द्वितीय श्रेणी जैवसेफ्टी कैबिनेट में, कॉर्टेक्स को पीबीएस ग्लूकोज को 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के साथ बदलने से पहले चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने की अनुमति देता है। कोमल दोहन के साथ मिलाएं और हर दो मिनट में अतिरिक्त कोमल दोहन के साथ 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ऊतक को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, पाचन को चार मिलीलीटर रखरखाव माध्यम के साथ रोकें और ऊतक को कोमल त्रिभुज के साथ अलग करने के लिए एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें।अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं तलछट और एक दूसरे अपकेंद्रित्र के लिए रखरखाव माध्यम के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च । गिनती के लिए ताजा रखरखाव माध्यम के एक मिलीलीटर में दूसरे अपकेंद्री के बाद गठित गोली को फिर से खर्च करें और अलग न्यूरॉन्स को 6.5 गुना 10 पर चौथे व्यवहार्य कोशिकाओं को सेंटीमीटर प्रति सेंटीमीटर चुकता एकाग्रता को 12 अच्छी तरह से प्लेट में रखरखाव माध्यम प्रति कुएं के एक मिलीलीटर में चुकता करें। ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो दिनों के बाद, तनु EGFP और लक्ष्य प्रोटीन प्लाज्मिड DNAs और ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक दो अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में और फिर उंहें एक साथ मिश्रण ।ईजीएफपी के साथ कोशिकाओं को कुओं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़कर निर्माण करें। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ धोएं और उन्हें पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए ठीक करें। इनक्यूबेशन के अंत में, प्रति वॉश ताजा पीबीएस के साथ तीन बार निश्चित कोशिकाओं को धोएं और प्रति नमूना एक माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर फ्लोरेसेंस माउंटिंग मीडियम की न्यूनतम मात्रा जोड़ें।फिर ध्यान से कांच स्लाइड का सामना करना पड़ नमूनों के साथ बढ़ते मीडिया पर लेपित कवरस्लिप स्थानांतरित। न्यूराइट ग्रोथ को इमेज करने के लिए, एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर 40X उद्देश्य का चयन करें और कम से कम 40 अक्षुण्ण ईजीएफपी सकारात्मक न्यूरॉन्स प्रति ट्रांसफैक्शन से छवियों को कैप्चर करने के लिए शुरू करें। जब सभी न्यूराइट्स को इमेज किया गया हो, तो इमेजजे में कैप्चर की गई छवियों को न्यूरोन्ज प्लगइन के साथ खोलें और कोशिका शरीर से प्रत्येक न्यूरॉन के सबसे लंबे न्यूराइट की लंबाई को विकास शंकु की नोक तक मापें।फिर न्यूराइट विकास पर लक्षित प्रोटीन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त डेटा का विश्लेषण करें। साइटोचलासिन डी खुराक-निर्भर तरीके से न्यूराइट एक्सटेंशन को दबाता है जबकि तंत्रिका विकास कारक के साथ इलाज किए गए न्यूरॉन्स में न्यूराइट आउटग्रोथ को बढ़ाया जाता है। इसके अलावा, न्यूरोनल ग्रोथ एडाप्टर प्रोटीन FE65 असंक्रमित न्यूरॉन्स की तुलना में दो गुना न्यूराइट आउटग्रोथ को काफी उत्तेजित करता है।कम ट्रांसफैक्शन दक्षता के बावजूद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से पता चलता है कि दो दिन की सेल संस्कृति का 80% से अधिक सफलतापूर्वक ईजीएफपी और FE65 के साथ सह-संक्रमित किया जा सकता है। ईजीएफपी अभिव्यक्ति का पता छह घंटे बाद ट्रांसफैक्शन पर लगाया जाता है जबकि FE65 को पहले 12 घंटे में पता लगाया जाता है और दोनों संकेतों को ट्रांसफैक्शन के बाद सात दिनों तक पता लगाया जाता है । FE65 प्लाज्मिड डीएनए की विभिन्न मात्रा के साथ प्राथमिक चूहा कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के ट्रांसफैक्शन से 0 से 0.5 माइक्रोग्राम FE65 प्लाज्मिड के साथ न्यूराइट एक्सटेंशन में खुराक पर निर्भर वृद्धि का पता चलता है।हालांकि, 0.5 या प्लाज्मिड के एक माइक्रोग्राम से संक्रमित न्यूरॉन्स में विकास में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा जाता है। प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, भ्रूणीय मस्तिष्क से उपयुक्त क्षेत्र को अलग करना महत्वपूर्ण है। इस तकनीक को मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में तंत्रिका विकास के अध्ययन के लिए भी लागू किया जा सकता है जिसमें पुनर्योजी दवा के लिए मूल्यवान उपकरण हैं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

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प्राथमिक सेल संस्कृति अध्ययन के लिए चिकी retinas में कुशल जीन स्थानांतरण: एक<em&gt; पूर्व ओवो</em&gt; Electroporation दृष्टिकोण

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

एपिकार्डियल परिणाम संस्कृति परख और<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; एपिकार्डियल व्युत्पन्न सेल प्रवास का आकलन

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Planarians में नेत्र पुनर्जनन अध्ययन के लिए सर्जिकल एबलेशन परख

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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न्यूरॉन्स में Intracellular परिवहन का विश्लेषण करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस के स्थिरीकरण

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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RNAi और हीट शॉक-प्रेरित प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के आवेदन के लिए सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स के लिए रोगाणु कोशिकाओं reprogram

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

एक Endothelial सेल मनका अंकुरण परख में Pericytes शामिल

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

प्राथमिक मानव कोशिकाओं में सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण और मांयता

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

ग्रीन Alga Chlamydomonas reinhardtii के सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों के इन-डेप्थ विश्लेषण के लिए एक मल्टी-ओमिक्स निष्कर्षण विधि

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...