Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), del CUHK direct grant scheme, del Fondo di dotazione dello United College e del TUYF Charitable Trust.

Tutte le procedure seguite erano conformi agli standard etici del comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università Cinese di Hong Kong.
1. Preparazione di Coverslips
<ol><li>Collocare uno scivolo circolare sterile da 18 mm in ogni pozzetto di una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozze.</li>
	<li>In un'incubatrice umidizzata da 37 gradi centigradi per almeno 1 h, rivestire la coverslip con una soluzione poli-D-lisina a 5 g/mL/mL.</li>
	<li>Aspirare la soluzione poli-D-lysina ...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Come detto prima, PC12 e i suoi subclone sono ampiamente impiegati per studiare l'estensione neurite perché hanno un'eccellente efficienza di trasfezione2,3. Al contrario, i neuroni primari hanno un basso tasso di trasfezione, che è un grande ostacolo per studiare i regolatori di escrescenza neurite per trasfezione7. Qui, descriviamo un protocollo conveniente per quantificare la crescita dei neuriti nei neuroni primari. Nonostante la bas...

Neuriti, compresi sia assoni che dendriti, sono le proiezioni dei neuroni coinvolti nella creazione delle reti neurali. La crescita dinamica dei neuriti è essenziale per il neurosviluppo. Tuttavia, i meccanismi normativi sottostanti rimangono poco chiari. In particolare, il danno neurite è spesso osservato in varie malattie neurodegenerative e dopo lesioni cerebrali1. Pertanto, lo studio dei ruoli delle molecole putative in vari percorsi normativi di escrescenza neurite migliorerebbe la nostra comprensione del processo. Inoltre, può rivelare nuovi bersagli terapeutici per vari disturbi neurologici. Le linee cellulari neuronali sono modelli preziosi per studiare i processi neuronali tra cui l'escrescenza di neurite in quanto sono facili da manipolare e trasfect2,3. Tuttavia, deriva genetica è stata segnalata per verificarsi in alcune linee cellulari comunemente utilizzate, che potrebbero portare a variazioni nelle loro risposte fisiologiche4. Inoltre, è stata mostrata un'espressione differenziale di proteina tra le linee cellulari neuronali e i neuroni primari. Per esempio, PC12, una linea cellulare neuronale derivata dalla ghiandola surrenale del ratto che è ampiamente utilizzata per studiare la crescita neurite2,3, non esprime i recettori NMDA5. Inoltre, è stato proposto che la ridotta reattività della linea neuroblastoma del topo neuro-2a alle neurotossine rispetto ai neuroni primari è dovuta alla mancanza di espressione di alcuni recettori della membrana e canali ionici6. Pertanto, i neuroni primari sono un modello più desiderabile e rappresentativo per lo studio della escrescenza di neurite. Tuttavia, l'uso di neuroni primari è ostacolato dalla loro bassa efficienza di trasfezione7.
Qui, descriviamo un metodo che comporta la co-trasfezione della proteina di interesse (POI) e EGFP ai neuroni corticali del ratto primario. L'EGFP agisce come marcatore morfologico per l'identificazione di neuroni trasfettati con successo e permette la misurazione dei neuriti. Abbiamo convalidato questo metodo utilizzando composti/molecole che sono stati segnalati per modulare la crescita dei neurite. Inoltre, FE65, una proteina adattatrice neuronale che ha dimostrato di stimolare la crescita neurite, è stata utilizzata per illustrare questo approccio8,9. Questo protocollo prevede (1) l'isolamento dei neuroni corticali primari dagli embrioni del giorno embrionale 18 (E18) sugli embrioni di ratto, (2) la co-trasfezione dei neuroni con EGFP e poi (FE65 in questo studio) e (3) l'imaging e l'analisi dei neuroni utilizzando l'elaborazione delle immagini software ImageJ con il plugin NeuronJ10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

L'escrescenza di Neurite è un evento fondamentale nella formazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del sistema nervoso. Gravi danni ai neuriti e disfunzioni sinaptiche si verificano in varie malattie neurodegenerative e degenerazione legata all'età. Lo studio dei meccanismi che regolano l'escrescenza neurite non solo getterebbe luce preziosa sui processi di sviluppo cerebrale, ma anche su tali disturbi neurologici. A causa della bassa efficienza di trasfezione, è attualmente difficile studiare l'effetto di una proteina specifica sulla escrescenza di neurite nei neuroni dei mammiferi primari. Qui, descriviamo un metodo semplice per lo studio dell'escrescenza neurite dalla co-trasfezione dei neuroni corticali del ratto primario con EGFP e una proteina di interesse (POI). Questo metodo consente l'identificazione dei neuroni trafettati POI attraverso il segnale EGFP, e quindi l'effetto del POI sulla crescita di neurite può essere determinato con precisione. Questo saggio basato su EGFP fornisce un approccio conveniente per lo studio dei percorsi che regolano la crescita neurite.

Per testare questa metodologia, abbiamo usato Cyto D e il fattore di crescita del nervo NGF, che hanno dimostrato di inibire e stimolare rispettivamente la crescita di neurite14,15,16. La lunghezza neurite dei neuroni trasincati con EGFP è stata misurata dopo il trattamento con Cyto D o NGF. L'efficienza di trasfezione di EGFP ai neuroni è stata del 2,7% (1.068 neuroni contati). Come mostrato n...

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An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.

Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

La bassa efficienza di trasfezione è un grosso ostacolo per determinare come le proteine riattivono la crescita della neurite nei neuroni primari. Il nostro protocollo supera questo problema co-trasfezione di EGFP per identificare con successo le cellule trasfette. L'alto tasso di co-trasfezione di EGFP e le proteine di interesse garantiscono l'accuratezza del saggio.E di conseguenza, ora è necessaria la colorazione dell'immunofluorescenza. Poiché la crescita della neurite si verifica durante la rigenerazione neurale, questo metodo può essere applicato all'identificazione di nuovi obiettivi per ripristinare la rete neuronale danneggiata in traumi cerebrali o malattie neurodegenerative. Prima di iniziare la procedura, posizionare una coverlip circolare sterile di 18 millimetri in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale di 12 polietilene e rivestire ogni coverlip con cinque microgrammi per millimetro di soluzione di Poli-D-Lysine in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius per almeno un'ora.Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di poli-D-lisina e sciacquare i copriparsi con acqua sterile. Il giorno 18 embrionale, posizionare l'utero raccolto da un ratto Sprague Dawley incinta a tempo in una piastra di Petri di 10 centimetri e utilizzare piccole forbici sezionanti per aprire l'utero e il sacco amniotico. Utilizzare le forbici per rimuovere la placenta e utilizzare le forcep per trasferire un intero embrione in una nuova piastra di Petri di 10 centimetri contenente glucosio PBS refrigerato.Usa le forbici per tagliare lungo la sutura sagittale del cranio e usa una piccola spatola piatta per trasferire il cervello embrionale in una nuova piastra di Petri di 10 centimetri contenente glucosio PBS fresco ghiacciato. Usando due pinzette numero cinque e un microscopio a dissezione, separare i due emisferi cerebrali dal cervelletto e dal tronco encefalico e rimuovere le meningi. Quindi isolare la corteccia dagli emisferi cerebrali e posizionare la corteccia in un tubo da 15 millilitri contenente glucosio PBS freddo come ghiaccio fresco.Per la coltura primaria dei neuroni corticali, in un armadio di biosicurezza di classe II, lasciare che la corteccia si stabilisca per gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius prima di sostituire il glucosio PBS con l'EDTA allo 0,05% di tripside. Mescolare con maschiatura delicata e incubare il tessuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 10 minuti con ulteriori maschiature delicate ogni due minuti. Alla fine dell'incubazione, interrompere la digestione con quattro millilitri di mezzo di manutenzione e utilizzare una pipetta da un millilitro per dissociare il tessuto con una delicata triturazione.Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in un millilitro di mezzo di manutenzione per una seconda centrifugazione. Rimostrare il pellet formato dopo la seconda centrifugazione in un millilitro di mezzo di manutenzione fresco per il conteggio e placcare i neuroni isolati a una piastra di 6,5 per 10 alla quarta forzatura vitale per centimetro di concentrazione quadrata in un millilitro di mezzo di manutenzione per pozzo in una piastra di 12 pozzetti. Dopo due giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, diluire L'EGFP e le DNA plasmidiche proteiche bersaglio e reagente di trasfezione in due tubi separati da 1,5 millilitri e quindi mescolarli insieme.Trasfezionare le celle con il costrutto EGFP aggiungendo la miscela di trasfezione ai pozzi. Dopo 24 ore, lavare le celle con 37 gradi Celsius PBS e fissarle con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le celle fisse tre volte con PBS fresco per lavaggio e aggiungere un volume minimo di mezzo di montaggio a fluorescenza su un vetrino al microscopio per campione.Quindi trasferire con cura i copripasci rivestiti sul supporto di montaggio con i campioni rivolti verso le diapositive di vetro. Per immaginere la crescita della neurite, selezionare l'obiettivo 40X su un microscopio epifluorescente e fare clic per iniziare a catturare immagini da almeno 40 neuroni positivi EGFP intatti per trasfezione. Quando tutte le neurite sono state immagini, apri le immagini catturate in ImageJ con il plugin NeuronJ e misura la lunghezza della neurite più lunga di ogni neurone dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita.Quindi analizzare i dati ottenuti con il software per determinare l'effetto delle proteine mirate sulla crescita della neurite. La citocalcasina D sopprime l'estensione della neurite in modo dose-dipendente mentre la crescita della neurite è migliorata nei neuroni trattati con fattore di crescita nervosa. Inoltre, la proteina dell'adattatore per la crescita neuronale FE65 stimola significativamente la crescita della neurite di due volte rispetto ai neuroni non trasfettati.Nonostante una bassa efficienza di trasfezione, l'analisi dell'immunofluorescenza rivela che oltre l'80% di una coltura cellulare di due giorni può essere co-trasfettata con successo con EGFP e FE65. L'espressione EGFP viene rilevata a sei ore dopo la trasfezione, mentre FE65 viene rilevato per la prima volta all'ora 12 ed entrambi i segnali vengono rilevati per un massimo di sette giorni dopo la trasfezione. La trasfezione dei neuroni corticali del ratto primario con diverse quantità di DNA plasmide FE65 rivela un aumento dose-dipendente dell'estensione della neurite con da 0 a 0,5 microgrammi di FE65 plasmide.Tuttavia, non si osserva alcuna differenza significativa nella crescita nei neuroni trasfettato con 0,5 o un microgrammi del plasmide. Quando si tenta il protocollo, è importante isolare la regione appropriata dal cervello embrionale. Questa tecnica può anche essere applicata allo studio della crescita neurale nei neuroni derivati dall'iPSC umano che hanno strumenti preziosi per la medicina rigenerativa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

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