Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, 건강 및 의료 연구 기금 (홍콩), CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 기부 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금에 의해 지원되었습니다.

이후 모든 절차는 홍콩 중문대학의 동물 실험 윤리 위원회의 윤리 기준에 따라 진행되었습니다.
1. 커버스립준비
<ol><li>멸균 된 18mm 원형 커버 슬립을 12 웰 조직 배양 판의 각 우물에 놓습니다.</li>
	<li>커버슬립을 가습된 37°C 인큐베이터에 5 μg/mL 폴리-D-리신 용액으로 코팅하여 1시간 이상 코팅합니다.</li>
	<li>조직 배양 플레이트로부터 폴리-D-리신 용액을 흡인하고 코팅된 커...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

앞서 언급한 바와 같이, PC12 및 그 서브클론은 형질전환 효율이 우수하기 때문에 뉴라이트 확장을 연구하기 위해 널리 사용된다2,3. 대조적으로, 1 차적인 뉴런은 형질전환7에의하여 neurite 파생 조정자를 공부하기 위한 중요한 장애물인 낮은 형질감염 비율을 가시합니다. 여기서, 우리는 1 차적인 뉴런에 있는 neurite 파생을 정량화하기 ?...

축색과 모수석을 모두 포함한 노이라이트는 신경망 의 확립에 관여하는 뉴런의 돌출부입니다. 신경 신경 발달에 필수적입니다 신경 구이염의 역동적 인 성장. 그러나, 아래 기본 규제 메커니즘 불분명 남아. 특히, 신경성 손상은 다양한 신경 퇴행성 질환과 뇌 손상 후1. 따라서, 다양한 neurite 파생 규제 경로에서 putative 분자의 역할에 대한 조사는 프로세스의 우리의 이해를 향상시킬 것입니다. 더욱이, 다양한 신경 장애에 대한 새로운 치료 표적을 밝혀낼 수 있다. 신경 세포주는 신경세포가 조작하기 쉽고 트랜스펙트2,3으로neurite 의 성장을 포함한 신경 학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델입니다. 그러나, 유전 드리프트는 그들의 생리적인 반응에 있는 변이로 이끌어 낼 수 있던 몇몇 일반적으로 이용되는 세포주에서 생기기 위하여 보고되었습니다4. 더욱이, 차동 단백질 발현은 신경 세포주와 1차 뉴런 사이에 나타났다. 예를 들어, PC12는, 쥐 부신에서 유래된 뉴런 세포주는 뉴라이트자생을연구하는 데 널리 사용되는2, 3,NMDA 수용체5를발현하지 않는다. 더욱이, 1차 뉴런에 비해 신경독소에 대한 마우스 신경아세포종 라인 신경-2a의 반응성이 감소된 것은 특정 막 수용체 및 이온채널(6)의발현 부족으로 인한 것으로 제안되었다. 따라서, 1차 뉴런은 신경외식 의 자생의 조사를 위한 보다 바람직하고 대표적인 모델이다. 그러나, 1 차적인 뉴런의 사용은 그들의 낮은 형질 감염 효율성7에의해 방해된다.
여기서, 우리는 관심 있는 단백질(POI) 및 EGFP를 1차 쥐 피질 뉴런에 대한 공동 형질감염과 수반하는 방법을 기술한다. EGFP는 성공적으로 형질 감염된 뉴런의 식별을 위한 형태학적 마커로서 작용하고 신경염의 측정을 허용한다. 우리는 neurite 의 성장을 조절하기 위해 보고 된 화합물 / 분자를 사용하여이 방법을 검증했습니다. 더욱이, FE65, 신경조절 단백질은 신경질성 자성장을 자극하는 것으로 나타났으며, 이러한접근법을설명하기 위해8,9를사용하였다. 이 프로토콜은 (1) 배아 18일(E18) 래트 배아로부터 1차 피질 뉴런의 분리, (2) EGFP및 POI(본 연구에서 FE65)를 이용한 뉴런의 공동 형질감염 및 (3) 이미지 처리를 이용하여 뉴런의 이미징 및 분석을 포함한다. 소프트웨어 이미지J 와 뉴런J 플러그인10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Neurite 의 성장은 신경계 발달 중에 신경 회로형성에 근본적인 사건입니다. 가혹한 신경염성 손상 및 시냅스 역기능은 각종 신경 퇴행성 질병 및 나이 관련 변성에서 생깁니다. neurite 파생을 조절 하는 메커니즘의 조사 뿐만 아니라 뇌 발달 과정뿐만 아니라 이러한 신경 장애에 귀중 한 빛을 발산 것 이다. 낮은 형질 감염 효율로 인해, 현재 1 차 포유류 뉴런에서 신경 구이 성 성장에 특정 단백질의 효과 연구 하는 도전. 여기서, 우리는 EGFP및 관심 단백질(POI)을 이용한 1차 쥐 피질 뉴런의 공동 형질전환에 의한 뉴라이트 자생의 조사를 위한 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 EGFP 신호를 통해 POI 형질감염된 뉴런의 식별을 허용하고, 따라서 NEUrite 자성장에 대한 POI의 효과를 정확하게 결정할 수 있다. 이 EGFP 기반 분석법은 신경과성 자성장을 조절하는 경로의 조사를 위한 편리한 접근법을 제공한다.

이 방법론을 시험하기 위하여는, 우리는 각각14,15,16의신경 성 자성장을 억제하고 자극하기 위하여 보인 Cyto D 및 신경 성장 인자NGF를이용했습니다. EGFP로 형질감염된 뉴런의 뉴라이트 길이는 Cyto D 또는 NGF로 치료한 후 측정되었다. 뉴런에 대한 EGFP의 형질감염 효율은 2.7%(1,068개의 뉴런 카운트)였다. <stro...

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An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.

1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

낮은 경질 효율은 단백질이 1 차적인 뉴런에서 neurite 성장을 재활성화하는 방법을 결정하는 주요 장애물입니다. 우리의 프로토콜은 성공적으로 감염된 세포를 확인하기 위해 EGFP의 공동 변환에 의해이 문제를 극복. EGFP의 높은 배분률과 관심 있는 단백질은 분석의 정확성을 보장합니다.그리고 결과적으로 면역 형광 얼룩이 필요합니다. 신경 재생 중에 중성염 자가 성장이 발생하면, 이 방법은 뇌 외상 또는 신경 퇴행성 질환에서 손상된 신경 망을 복원하기위한 새로운 표적의 식별에 적용 될 수있다. 시술을 시작하기 전에 멸균 18mm 원형 커버슬립을 12개의 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물에 넣고 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 폴리-D-Lysine 용액의 밀리미터당 5마이크로그램으로 각 커버슬립을 코팅합니다.인큐베이션이 끝나면 폴리-D-Lysine 용액을 흡인하고 커버립을 멸균물로 헹구세요. 배아 의 날에 18, 10 센티미터 페트리 접시에 시간 임신 Sprague Dawley 쥐에서 수확 자궁을 배치하고 자궁과 양수 낭을 열기 위해 작은 해부 가위를 사용합니다. 가위를 사용하여 태반을 제거하고 집게를 사용하여 전체 배아를 차가운 PBS 포도당을 포함하는 새로운 10센티미터 페트리 접시로 옮춥니다.가위를 사용하여 두개골의 처진 봉합사를 따라 자르고 작은 평평한 주걱을 사용하여 배아 뇌를 신선한 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 새로운 10 센티미터 페트리 접시로 옮춥니까. 2번 5번 핀셋과 해부 현미경을 사용하여 두 대뇌 반구를 소뇌와 뇌줄기에서 분리하고 수막을 제거합니다. 그런 다음 대뇌 반구에서 피질을 분리하고 신선한 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 15 밀리리터 튜브에 피질을 놓습니다.1 차적인 피질 신경 문화의 경우, 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서, 피질은 0.05 %의 트립신 EDTA로 PBS 포도당을 대체하기 전에 섭씨 4도에서 5 분 동안 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 부드러운 태핑과 섞어서 37도의 수조에 10분간 배양하고 2분마다 부드러운 도청을 추가로 해보시면 됩니다. 인큐베이션의 끝에서, 유지 보수 매체의 네 밀리리터와 소화를 중지하고 부드러운 트리튜레이션으로 조직을 해리1 밀리리터 파이펫을 사용합니다.원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 두 번째 원심분리를 위해 유지 보수 배지의 1밀리리터로 펠릿을 재중단한다. 12웰 플레이트에서 웰당 유지 보수 배지의 1 밀리리터에서 6.5배 10에서 4번째 생존 셀수퍼레이션으로 격리된 뉴런을 계산하고 플레이트에 대한 신선한 유지 보수 매체의 1밀리리터에서 제2 원심분리 후 형성된 펠릿을 재중단한다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 이틀 간 후 EGFP와 표적 단백질 플라스미드 DN및 2개의 별도 1.5 밀리리터 튜브에서 트랜스펙트 시약을 희석한 다음 함께 섞는다.우물에 형질 혼합물을 추가하여 EGFP 구조를 사용하여 세포를 트랜스펙트합니다. 24 시간 후, 37섭씨 PBS로 세포를 씻고 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 인큐베이션이 끝나면 세척당 신선한 PBS로 고정 된 세포를 세 번 세척하고 샘플 당 하나의 현미경 유리 슬라이드에 최소한의 형광 장착 매체를 추가하십시오.그런 다음 코팅된 커버립을 유리 슬라이드를 향하는 샘플로 마운팅 미디어에 조심스럽게 전달합니다. 중성성 성장을 이미지하기 위해, 상피 형광 현미경에 40X 목표를 선택하고 전환 당 적어도 40 그대로 EGFP 양성 뉴런에서 이미지를 캡처하기 시작 클릭합니다. 모든 중성염이 이미지되었을 때, NeuronJ 플러그인으로 ImageJ에서 캡처 된 이미지를 열고 세포 본체에서 성장 콘의 끝까지 각 뉴런의 가장 긴 중성염의 길이를 측정합니다.그런 다음 소프트웨어와 함께 얻은 데이터를 분석하여 표적 단백질이 중성자 성장에 미치는 영향을 결정합니다. Cytochalasin D는 신경 성장 인자로 취급된 뉴런에서 향상된 다중염 자성장 동안 복용량 의존적인 방식으로 neurite 확장을 억제합니다. 또한, 뉴런 성장 어댑터 단백질 FE65는 비감염 뉴런에 비해 뉴라이트 아웃성장을 2배 크게 자극한다.낮은 경질 효율에도 불구하고, 면역 형광 분석은 2 일 세포 배양의 80 % 이상이 EGFP 및 FE65와 성공적으로 공동 형과 감염 될 수 있음을 보여줍니다. EGFP 발현은 FE65가 12시간 에서 처음 검출되고 두 신호모두 최대 7일 동안 검출되는 동안 형질 전환 후 6시간 후에 검출된다. FE65 플라스미드 DNA의 다른 양을 가진 1 차적인 쥐 피질 신경의 transfection는 FE65 plasmid의 0에서 0.5 마이크로그램으로 neurite 확장에 있는 복용량 의존적인 증가를 제시합니다.그러나, 성장에 있는 유의한 다름은 plasmid의 0.5 또는 1마이크로그램으로 전염된 뉴런에서 관찰되지 않습니다. 프로토콜을 시도할 때 배아 뇌에서 적절한 영역을 분리하는 것이 중요합니다. 이 기술은 또한 재생 의학을 위한 귀중한 공구가 있는 인간 iPSC 유래 뉴런에 있는 신경 성장의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

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차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

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심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...