Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Research Grants Council Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), CUHK direkte stipend ordningen, United College legat fondet og TUYF veldedige Trust.

Alle prosedyrer fulgte var i samsvar med etiske standarder for dyret eksperimentering etikk komiteen av det kinesiske Universitetet i Hong Kong.
1. utarbeidelse av Coverslips
<ol><li>Plasser en steril 18 mm sirkulær dekkglass i hver brønn på en 12-brønn vev kultur plate.</li>
	<li>Coat dekkglass med 5 μg/mL Poly-D-lysin løsning i en fuktet 37 ° c inkubator i minst 1 time.</li>
	<li>Aspirer den Poly-D-lysin løsning fra vevet kulturen plate og skyll belagt coverslips gang med sterilt v...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Som nevnt tidligere, PC12 og dens subclones er mye brukt for å studere neurite forlengelse fordi de har utmerket transfeksjoner effektivitet2,3. I kontrast primære neurons har en lav transfeksjoner rate, som er et stort hinder for å studere neurite utvekst regulatorer ved transfeksjoner7. Her beskriver vi en praktisk protokoll for kvantifisere neurite utvekst i primære neurons. Til tross for den lave generelle transfeksjoner effektivit...

Neurites, inkludert både axons og dendrites, er anslagene fra neurons involvert i etableringen av nevrale nettverk. Den dynamiske utvekst av neurites er avgjørende for neurodevelopment. Imidlertid er de underliggende regulatoriske mekanismene under fortsatt uklare. Spesielt neurite Kader er ofte observert i ulike nevrodegenerative sykdommer og etter hjerne skader1. Derfor vil gransking av rollene til antatte molekyler i ulike neurite utvekst regulatoriske trasé forbedre vår forståelse av prosessen. Videre kan det avsløre romanen terapeutiske mål for ulike nevrologiske lidelser. Neuronal cellelinjer er verdifulle modeller for å studere neuronal prosesser inkludert neurite utvekst som de er enkle å manipulere og transfect2,3. Imidlertid har genetisk drift blitt rapportert å forekomme i noen brukte cellelinjer, noe som kan føre til variasjoner i deres fysiologiske svar4. Videre har differensial protein uttrykk blitt vist mellom neuronal cellelinjer og primære neurons. For eksempel, PC12, en neuronal cellelinje avledet fra rotte binyrene som er mye brukt for å studere neurite utvekst2,3, ikke uttrykke NMDA reseptorer5. Videre har det vært foreslått at den reduserte responsen på musen neuroblastom linje Nevro-2a til nervegifter i forhold til primære neurons skyldes mangel på uttrykk for visse membran reseptorer og Ion-kanaler6. Derfor primære neurons er en mer ønskelig og representativ modell for etterforskningen av neurite utvekst. Imidlertid er bruken av primære neurons hindret av deres lave transfeksjoner effektivitet7.
Her beskriver vi en metode som involverer co-transfeksjoner av protein av interesse (POI) og EGFP til primære rotte kortikale neurons. Den EGFP fungerer som en morfologiske markør for identifisering av vellykket transfekterte neurons og tillater måling av neurites. Vi validerte denne metoden ved hjelp av forbindelser/molekyler som er rapportert til modulere neurite utvekst. Dess, FE65, en neuronal adapter protein som har vist seg å stimulere neurite utvekst, ble brukt for å illustrere denne tilnærmingen8,9. Denne protokollen innebærer (1) isolering av primære kortikale neurons fra embryonale dag 18 (E18) rotte embryo, (2) transfeksjoner av neurons med EGFP og POI (FE65 i denne studien) og (3) Imaging og analyse av neurons ved hjelp av bildebehandling programvare ImageJ med NeuronJ plugin10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Neurite utvekst er en fundamental hendelse i dannelsen av nevrale kretser under nervesystemet utvikling. Alvorlig neurite Kader og Synaptic dysfunksjon forekommer i ulike nevrodegenerative sykdommer og alder-relaterte degenerasjon. Gransking av mekanismene som regulerer neurite utvekst ville ikke bare kaste verdifullt lys på hjernens utviklingsmessige prosesser, men også på slike nevrologiske lidelser. På grunn av den lave transfeksjoner effektivitet, er det for tiden utfordrende å studere effekten av et bestemt protein på neurite utvekst i primære pattedyr neurons. Her beskriver vi en enkel metode for undersøkelse av neurite utvekst av transfeksjoner av primære rotte kortikale neurons med EGFP og et protein av interesse (POI). Denne metoden tillater identifisering av POI transfekterte neurons gjennom EGFP signalet, og dermed effekten av POI på neurite utvekst kan bestemmes presist. Dette EGFP-baserte analysen gir en praktisk tilnærming for etterforskning av trasé regulere neurite utvekst.

For å teste denne metodikken, brukte vi cyto D og nerve vekstfaktor NGF, som har vist å hemme og stimulere neurite utvekst henholdsvis14,15,16. Den neurite lengden av neurons transfekterte med EGFP ble målt etter behandling med cyto D eller NGF. Den transfeksjoner effektiviteten av EGFP til neurons var 2,7% (1 068 neurons telles). Som vist i figur 1A</stro...

Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

I denne rapporten beskriver vi en enkel protokoll for å studere neurite utvekst i embryonale rotte kortikale neurons av co-transfecting med EGFP og protein av interesse.

En forbedret Green fluorescens protein-basert analyse for å studere Neurite utvekst i primær neurons

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Lav transfection effektivitet er et stort hinder for å bestemme hvordan protein reaktiverer neurite utvekst i primære nevroner. Vår protokoll overvinne dette problemet ved co-transfection av EGFP å identifisere vellykket trans infiserte celler. Den høye samtidige transfiseringsraten til EGFP og proteinene sikrer nøyaktigheten av analysen.Og følgelig er immunofluorescence farging nå nødvendig. Som neuritt utvekst oppstår under neural regenerering, kan denne metoden brukes til identifisering av nye mål for å gjenopprette det skadede nevronale nettverket i hjernetraumer eller nevrodegenerative sykdommer. Før du begynner prosedyren, plasser en steril 18 millimeter sirkulær coverlip i hver brønn av en 12 brønnvevskulturplate og belegg hver dekkslips med fem mikrogram per millimeter Poly-D-Lysine-løsning i en fuktet 37 grader Celsius inkubator i minst en time.På slutten av inkubasjonen aspirerer poly-D-lysinoppløsningen og skyll dekkslipsene med sterilt vann. På embryonisk dag 18, plasser livmoren høstet fra en tidssolid gravid Sprague Dawley rotte i en 10 centimeter Petriskål og bruk små dissekering saks for å åpne livmoren og fostersekken. Bruk saksen til å fjerne morkaken og bruke tang til å overføre ett helt embryo til en ny 10 centimeter petriskål som inneholder kjølt PBS glukose.Bruk saksen til å kutte langs sagittal suturen av skallen og bruke en liten flat slikkepott for å overføre den embryonale hjernen til en ny 10 centimeter petriskål som inneholder fersk iskald PBS glukose. Ved hjelp av to nummer fem pinsett og et disseksjonsmikroskop, skill de to cerebrale halvkulene fra lillehjernen og hjernestammen og fjern meningene. Deretter isolerer cortex fra hjernehalvkulene og plasserer cortex i et 15 milliliter rør som inneholder fersk iskald PBS glukose.For primær kortikale nevron kultur, i en klasse II biosikkerhet kabinett, la cortex å bosette seg ved tyngdekraften i fem minutter ved fire grader Celsius før du erstatter PBS glukose med 0,05% trypsin EDTA. Bland med skånsom tapping og inkuber vevet i et 37 graders Celsius vannbad i 10 minutter med ekstra mild tapping annethvert minutt. På slutten av inkubasjonen, stopp fordøyelsen med fire milliliter vedlikeholdsmedium og bruk en en milliliter pipette for å dissosiere vevet med mild triturasjon.Sediment cellene ved sentrifugering og resuspend pellet i ett milliliter vedlikeholdsmedium for en andre sentrifugering. Resuspend pellet dannet etter den andre sentrifugering i en milliliter ferskt vedlikeholdsmedium for telling og plate de isolerte nevronene på en 6,5 ganger 10 til fjerde levedyktige celler per centimeter kvadrert konsentrasjon i en milliliter vedlikeholdsmedium per brønn i en 12 brønnplate. Etter to dager ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, fortynne EGFP og mål protein plasmid DNAs og transfection reagens i to separate 1,5 milliliter rør og deretter blande dem sammen.Transfect cellene med EGFP konstruere ved å legge transfection blanding til brønnene. Etter 24 timer, vask cellene med 37 grader Celsius PBS og fest dem med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter i mørket ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vasker du de faste cellene tre ganger med fersk PBS per vask og legger til et minimalt volum fluorescensmonteringsmedium på ett mikroskopglasssklie per prøve.Overfør deretter de belagte dekkglassene forsiktig til monteringsmediet med prøvene vendt mot glassskliene. Hvis du vil se for deg neurittveksten, velger du 40X-målet på et epifluorescerende mikroskop og klikker på start for å ta bilder fra minst 40 intakte EGFP-positive nevroner per transfeksjon. Når alle neurites har blitt avbildet, åpne de fangede bildene i ImageJ med NeuronJ plugin og måle lengden på den lengste neurite av hver nevron fra cellekroppen til spissen av vekstkjeglen.Analyser deretter dataene som er oppnådd med programvaren for å bestemme effekten av de målrettede proteinene på neurittvekst. Cytochalasin D undertrykker neuritt forlengelse på en doseavhengig måte mens neuritt utvekst er forbedret i nevroner behandlet med nerve vekstfaktor. I tillegg stimulerer det nevronale vekstadapterproteinet FE65 betydelig neurittvekst to ganger sammenlignet med uover infiserte nevroner.Til tross for en lav transfection effektivitet, immunofluorescence analyse viser at over 80% av en to-dagers cellekultur kan lykkes samvirket med EGFP og FE65. EGFP-uttrykk oppdages ved seks timer etter transfeksjon, mens FE65 først oppdages i time 12, og begge signalene oppdages i opptil syv dager etter transfection. Transfection av primære rotte kortikale nevroner med ulike mengder FE65 plasmid DNA avslører en doseavhengig økning i neuritt forlengelse med 0 til 0,5 mikrogram FE65 plasmid.Imidlertid observeres ingen signifikant forskjell i vekst i nevroner transfisert med 0,5 eller en mikrogram plasmid. Når du prøver protokollen, er det viktig å isolere riktig region fra den embryonale hjernen. Denne teknikken kan også brukes på studiet av nevrale vekst i menneskelige iPSC-avledede nevroner som har verdifulle verktøy for regenerativ medisin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiell utvekst Kultur-analysen og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Vurdering av Epikardial-avledet celle migrasjon

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Kirurgisk ablasjon analyse for å studere Eye Regeneration i Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Bruk av RNAi og varme-sjokk-indusert transkripsjon faktor uttrykk å omprogrammere bakterie celler til nerveceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Bygge inn Pericytes i en Endothelial celle perle spirende analysen

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induksjon og validering av mobilnettet Senescence i primære menneskeceller

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

En multi-omics utvinning metode for grundig analyse av synkroniserte kulturer av Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...