Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

Эта работа была поддержана за счет средств Из Научно-исследовательского совета Гонконга, Фонда медицинских и медицинских исследований (Гонконг), схемы прямых грантов CUHK, Фонда пожертвований Объединенного колледжа и Благотворительного фонда TUYF.

Все последующие процедуры соответствовали этическим стандартам комитета по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга.
1. Подготовка заедок
<ol><li>Поместите стерильный 18-мм круговой покрывало в каждый колодец 12-хорошей пластины культуры тканей.</li>...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Как указывалось ранее, PC12 и его подклоны широко используются для изучения расширения неврита, потому что они имеют отличную эффективность трансфекции2,3. В отличие от этого, первичные нейроны имеют низкий уровень трансфекции, который является основным пр...

Нейриты, включая аксоны и дендриты, являются проекциями нейронов, участвующих в создании нейронных сетей. Динамический рост невритов необходим для нейроразвития. Однако основные механизмы регулирования, лежащие в основе, остаются неясными. В частности, повреждение неврита часто наблюдается при различных нейродегенеративных заболеваниях и после травм головного мозга1. Таким образом, исследование роли индикативных молекул в различных невритовых путях роста улучшило бы наше понимание процесса. Кроме того, он может выявить новые терапевтические цели для различных неврологических расстройств. Нейронные клеточные линии являются ценными моделями для изучения нейронных процессов, включая невритовый рост, поскольку они легко манипулировать и трансфекта2,3. Тем не менее, генетический дрейф, как сообщается, происходит в некоторых широко используемых клеточных линий, которые могут привести к изменениям в их физиологических реакций4. Кроме того, дифференциальная экспрессия белка была показана между нейрональными клеточными линиями и первичными нейронами. Например, PC12, нейрональной линии клеток, полученных из крыс надпочечников, которая широко используется для изучения неврит овых2,3, не выражает NMDA рецепторов5. Кроме того, было предложено, что снижение отзывчивости линии нейробластомы мыши нейробластомы нейро-2а к нейротоксинам по сравнению с первичными нейронами связано с отсутствием экспрессии определенных мембранных рецепторов и ионных каналов6. Таким образом, первичные нейроны являются более желательной и репрезентативной моделью для исследования невритовых наростов. Тем не менее, использование первичных нейронов препятствует их низкой эффективностью трансфекции7.
Здесь мы описываем метод, который включает в себя совместное трансфекцию белка, представляющих интерес (POI) и EGFP для первичных крыс корковых нейронов. EGFP действует как морфологический маркер для идентификации успешно трансинфицированных нейронов и позволяет измерять невриты. Мы подтвердили этот метод с помощью соединений / молекул, которые, как сообщается, модулировать неврит нарастания. Кроме того, FE65, нейрональный адаптер белка, который, как было показано, стимулировать неврит нарост, был использован, чтобы проиллюстрировать этот подход8,9. Этот протокол включает в себя (1) изоляцию первичных корковых нейронов от эмбриональных эмбрионов 18 (E18) крысиных эмбрионов, (2) совместное трансфекцию нейронов с EGFP и POI (FE65 в данном исследовании) и (3) визуализацию и анализ нейронов с помощью обработки изображений программное обеспечение ImageJ с плагином NeuronJ10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Невритный рост является фундаментальным событием в формировании нейронных цепей при развитии нервной системы. Тяжелые повреждения неврита и синаптической дисфункции происходят при различных нейродегенеративных заболеваниях и возрастной дегенерации. Исследование механизмов, которые регулируют невритный рост будет не только пролить ценный свет на процессы развития мозга, но и на такие неврологические расстройства. Из-за низкой эффективности трансфекции, в настоящее время сложно изучить влияние конкретного белка на нейрит нарост в первичных нейронов млекопитающих. Здесь мы описываем простой метод исследования невритовых наростов путем со-трансфекции первичных крысиных корковых нейронов с EGFP и белка, представляющих интерес (POI). Этот метод позволяет идентифицировать POI трансинфицированных нейронов через сигнал EGFP, и, таким образом, влияние POI на неврит рост может быть определена точно. Этот результат на основе EGFP обеспечивает удобный подход для исследования путей, регулирующих неврит.

Чтобы проверить эту методологию, мы использовали Cyto D и фактор роста нерва NGF, которые, как было показано, ингибируют и стимулируют невритный рост соответственно14,15,16. Длина неврита нейронов, трансфицированных EGFP, измер...

Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

В этом отчете мы описываем простой протокол для изучения невритовых наростов эмбриональных крысиных корковых нейронов путем совместного перевода с EGFP и белка, интересующего.

Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Низкая эффективность трансфекции является основным препятствием для определения того, как белок активирует neurite рост в первичных нейронов. Наш протокол преодолеть эту проблему путем совместной трансфекции EGFP для выявления успешно трансфицированных клеток. Высокий уровень совместной трансфекции EGFP и белков, представляющих интерес обеспечивает точность анализа.И, следовательно, иммунофлуоресценции окрашивания в настоящее время требуется. Как neurite рост происходит во время нервной регенерации, этот метод может быть применен к выявлению новых целей для восстановления поврежденной нейронной сети в черепно-мозговой травмы или нейродегенеративных заболеваний. Перед началом процедуры поместите стерильные 18-миллиметровые круговые крышки в каждый колодец из 12 хорошо ткани культуры пластины и пальто каждый coverslip с пятью микрограммами на миллиметр Раствора Poly-D-Lysine во влажной 37 градусов по Цельсию инкубатор, по крайней мере один час.В конце инкубации аспирировать раствор Poly-D-Lysine и промыть крышки стерильной водой. На эмбриональный день 18, место матки собраны из время беременности Sprague Доули крысы в 10 сантиметров Петри блюдо и использовать небольшие рассечения ножницы, чтобы открыть матку и амниотический мешок. Используйте ножницы, чтобы удалить плаценту и использовать типсы для передачи одного целого эмбриона в новую 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую охлажденную глюкозу PBS.Используйте ножницы, чтобы сократить вдоль sagittal шва черепа и использовать небольшой плоский шпатель для передачи эмбрионального мозга в новый 10 сантиметров Петри блюдо, содержащее свежий ледяной глюкозы PBS. Используя два пинцета номер пять и микроскоп вскрытия, отделить два полушария головного мозга от мозжечка и ствола мозга и удалить оболынивания. Затем изолируйте кору из полушарий головного мозга и поместите кору в 15 миллилитровую трубку, содержащую свежую ледяную глюкозу PBS.Для первичной культуры корковых нейронов, в классе II биобезопасности кабинета, позволяют коры осесть под действием силы тяжести в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, прежде чем заменить глюкозу PBS с 0,05%трипсина ЭДТА. Смешайте с нежным постукиванием и инкубировать ткани в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 минут с дополнительным нежным постукиванием каждые две минуты. В конце инкубации, остановить пищеварение с четырьмя миллилитров поддержания среды и использовать один миллилитр пипетки для разобщения ткани с нежной тритурации.Осадок клеток центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр среды обслуживания для второй центрифугации. Resuspend гранулы, образоваваемые после второй центрифугации в один миллилитр свежей среды обслуживания для подсчета и пластины изолированных нейронов в 6,5 раза от 10 до четвертого жизнеспособных клеток на сантиметр квадратной концентрации в один миллилитр поддержания среднего на колодец в 12 хорошо пластины. Через два дня при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе разбавляйте EGFP и целевую белковую плазмиду ДНК и трансфектический реагент в двух отдельных 1,5 миллилитровых трубках, а затем смешивайте их вместе.Transfect клетки с EGFP построить путем добавления трансфекции смесь скважин. После 24 часов, мыть клетки с 37 градусов по Цельсию PBS и исправить их с 4%paraformaldehyde в PBS в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть фиксированные клетки три раза со свежим PBS за стирку и добавить минимальный объем флуоресценции монтажа среды на один микроскоп стеклянный слайд на образец.Затем осторожно перенесите покрытые крышки на монтажные средства массовой информации с образцами, стоящими перед стеклянными слайдами. Чтобы изображение роста нейрита, выберите цель 40X на эпифлуоресцентном микроскопе и нажмите кнопку, чтобы захватить изображения, по крайней мере 40 нетронутых EGFP положительных нейронов на трансфекцию. Когда все невриты были изображены, откройте захваченные изображения в ImageJ с плагином NeuronJ и измерьте длину самого длинного нейрита каждого нейрона от клеточного тела до кончика конуса роста.Затем проанализируйте данные, полученные с помощью программного обеспечения, чтобы определить влияние целевых белков на рост нейрита. Циточалазин D подавляет расширение нейрита в зависимости от дозы образом, в то время как нейритный рост усиливается в нейронах, обработанных фактором роста нерва. Кроме того, белок адаптера роста нейронов FE65 значительно стимулирует рост нейрита в два раза по сравнению с нетрансфицированными нейронами.Несмотря на низкую эффективность трансфекции, иммунофлуоресценция анализ показывает, что более 80% двухдневной клеточной культуры могут быть успешно совместно с EGFP и FE65. Выражение EGFP обнаруживается в течение шести часов после трансфекции, в то время как FE65 впервые обнаруживается в час 12, и оба сигнала обнаруживаются на срок до семи дней после трансфекции. Трансфекция первичных корковых нейронов крысы с различным количеством плазмидной ДНК FE65 показывает доза-зависимое увеличение расширения нейрита с 0 до 0,5 микрограммов плазмиды FE65.Однако существенной разницы в росте не наблюдается в нейронах, трансфицированных 0,5 или одним микрограммом плазмиды. При попытке протокола важно изолировать соответствующую область от эмбрионального мозга. Этот метод также может быть применен к изучению нервного роста в человеческих нейронов, полученных iPSC, которые имеют ценные инструменты для регенеративной медицины.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований:<em&gt; Экс-ово</em&gt; Электропорация подход

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Эпикардиального вырост Культура Анализ и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Оценка эпикардиального производный миграции клеток

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Хирургическая абляция Анализ для изучения Регенерации глаз в планарии

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Иммобилизация Caenorhabditis elegans для анализа внутриклеточного транспорта в нейроны

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Включение Pericytes в эндотелиальных клеток шарик прорастания Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Метод извлечения мульти-омики для глубокого анализа синхронизированных культур зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...