Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

Detta arbete stöddes av medel från forskningsstipendier rådet Hong Kong, hälso-och sjukvårds forskningsfonden (Hongkong), CUHK direkt bidragssystem, United College donationsfond och TUYF välgörenhets förtroende.

Alla tillvägagångssätt följde var i överensstämmelse med de etiska standarderna av den djura experimenterande etikkommittén av det kinesiska universitetar av Hong Kong.
1. beredning av täckglas
<ol><li>Placera en steril 18 mm cirkulär täckslip i varje brunn av en 12-och vävnadsodling plattan.</li>
	<li>Täck täckslip med 5 μg/mL Poly-D-lysin lösning i en fuktad 37 ° c inkubator i minst 1 h.</li>
	<li>Aspirera Poly-D-lysin lösning från vävnaden kultur plattan och skölj de b...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Som nämnts tidigare, PC12 och dess subkloner är allmänt anställda för att studera påverkar förlängning eftersom de har utmärkta transfektion effektivitet2,3. I motsats, primära nervceller har en låg transfektion hastighet, vilket är ett stort hinder för att studera påverkar utväxt regulatorer genom transfektion7. Här beskriver vi ett bekvämt protokoll för att kvantifiera påverkar utväxt i primära nervceller. Trots den ...

Neuriter, inklusive både axoner och dendriter, är projektionerna från nervceller inblandade i inrättandet av neurala nätverk. Den dynamiska utväxten av neuriter är avgörande för neuroutveckling. De bakomliggande regleringsmekanismerna under förblir dock oklara. I synnerhet, neurit skador observeras ofta i olika neurodegenerativa sjukdomar och efter hjärnskador1. Därför, utredning av roller av förmodade molekyler i olika påverkar utväxt reglerings vägar skulle förbättra vår förståelse av processen. Dessutom kan det avslöja nya terapeutiska mål för olika neurologiska sjukdomar. Neuronala cellinjer är värdefulla modeller för att studera neuronala processer inklusive påverkar utväxt eftersom de är lätta att manipulera och transfect2,3. Emellertid, genetisk drift har rapporterats förekomma i vissa vanligen använda cellinjer, vilket kan leda till variationer i deras fysiologiska svar4. Dessutom, Differentiellt proteinuttryck har visats mellan neuronala cellinjer och primära nervceller. Till exempel, PC12, en neuronala cellinjer härrör från råtta binjurar som ofta används för att studera neurit utväxt2,3, inte uttrycker NMDA-receptorer5. Dessutom har det föreslagits att den minskade lyhördhet mus neuroblastom linje neuro-2A till neurotoxiner i jämförelse med primära nervceller beror på avsaknaden av uttryck för vissa membran receptorer och jonkanaler6. Därför, primära nervceller är en mer önskvärd och representativ modell för utredning av neurit utväxt. Emellertid, användningen av primära nervceller hindras av deras låga transfektion effektivitet7.
Här beskriver vi en metod som involverar Co-transfektion av proteinet av intresse (POI) och EGFP till primär råtta kortikala neuroner. Egfp fungerar som en morfologisk markör för identifiering av framgångsrikt transfekterade nervceller och tillåter mätning av neuriter. Vi validerade denna metod genom att använda föreningar/molekyler som har rapporterats att modulera påverkar utväxt. Dessutom, FE65, en neuronala adapter protein som har visat sig stimulera påverkar utväxt, användes för att illustrera detta tillvägagångssätt8,9. Detta protokoll innebär (1) isolering av primära kortikala neuroner från embryonala dag 18 (E18) råtta embryon, (2) Co-transfektion av nervceller med EGFP och POI (FE65 i denna studie) och (3) avbildning och analys av nervceller med hjälp av bildbehandling programvara ImageJ med NeuronJ plugin10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Neurite utväxt är en grundläggande händelse i bildandet av neurala kretsar under nervsystemets utveckling. Svår neurit skador och synaptisk dysfunktion förekommer i olika neurodegenerativa sjukdomar och åldersrelaterade degeneration. Utredning av de mekanismer som reglerar påverkar utväxt skulle inte bara kasta värdefullt ljus över hjärnans utvecklingsprocesser utan också på sådana neurologiska sjukdomar. På grund av den låga transfektion effektivitet, det är för närvarande utmanande att studera effekten av ett specifikt protein på neurit utväxt i primära däggdjurs nervceller. Här beskriver vi en enkel metod för utredning av påverkar utväxt av co-transfektion av primära råtta kortikala neuroner med egfp och ett protein av intresse (POI). Denna metod gör det möjligt att identifiera POI transfekterade nervceller genom egfp signalen, och därmed effekten av POI på påverkar utväxt kan bestämmas exakt. Denna egfp-baserade analysen ger en bekväm metod för utredning av vägar som reglerar påverkar utväxt.

För att testa denna metod, vi använde CYTO D och nervtillväxtfaktor NGF, som har visat sig hämma och stimulera neurit utväxt respektive14,15,16. Neuritlängden av neuroner som transfekterade med egfp mättes efter behandling med CYTO D eller NGF. Den transfektion effektivitet EGFP till nervceller var 2,7% (1 068 nervceller räknas). Som visas i figur 1A<...

Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för att studera påverkar utväxt i embryonala råtta kortikala neuroner genom Co-transfecting med egfp och proteinet av intresse.

En förbättrad grön fluorescens proteinbaserad test för att studera Neurite utväxt i primära nervceller

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Låg transfektionseffektivitet är ett stort hinder för att bestämma hur protein återaktiverar neuritutväxt i primära nervceller. Vårt protokoll övervinna denna fråga genom co-transfection av EGFP att identifiera framgångsrikt transfected celler. Den höga samtransfektionsgraden för EGFP och intresseproteinerna säkerställer analysens noggrannhet.Och följaktligen krävs nu immunofluorescensfärgning. Som neurit utväxt sker under neurala förnyelse, denna metod kan tillämpas på identifiering av nya mål för att återställa den skadade neuronala nätverket i hjärnan trauma eller neurodegenerativa sjukdomar. Innan du börjar proceduren, placera en steril 18 millimeter cirkulär täckslip i varje brunn av en 12 väl vävnad kultur tallrik och päls varje coverslip med fem mikrogram per millimeter poly-D-Lysinlösning i en befuktad 37 grader Celsius inkubator i minst en timme.I slutet av inkubationen aspirerar du Poly-D-Lysinlösningen och sköljer överdragna med sterilt vatten. På embryonala dag 18, placera livmodern skördas från en tidsbetonad gravid Sprague Dawley råtta i en 10 centimeter Petriskål och använda små dissekera sax för att öppna livmodern och fostersäcken. Använd saxen för att ta bort moderkakan och använd tivpeter för att överföra ett helt embryo till en ny 10 centimeter petriskål som innehåller kyld PBS-glukos.Använd saxen för att skära längs den sagittala suturen av skallen och använda en liten platt spatel för att överföra den embryonala hjärnan till en ny 10 centimeter Petriskål som innehåller färsk iskall PBS glukos. Med hjälp av två nummer fem pincett och en dissekering mikroskop, separera de två cerebrala halvkloten från lillhjärnan och hjärnstammen och ta bort hjärnhinnorna. Sedan isolera cortex från hjärnhalvorna och placera cortex i en 15 milliliter slang som innehåller färsk iskall PBS glukos.För primär kortikala neuron kultur, i en klass II biosäkerhet skåp, tillåta cortex att bosätta sig genom gravitationen i fem minuter vid fyra grader Celsius innan du ersätter PBS glukos med 0,05%trypsin EDTA. Blanda med skonsam tappning och inkubera vävnaden i ett 37 graders Celsius vattenbad i 10 minuter med ytterligare skonsam tappning varannan minut. Vid slutet av inkubationen, stoppa matsmältningen med fyra milliliter underhållsmedium och använd en milliliterpipett för att separera vävnaden med mild trituration.Sedimentera cellerna genom centrifugering och resuspend pelleten i en milliliter underhållsmedium för en andra centrifugering. Resuspend pelleten bildas efter den andra centrifugeringen i en milliliter av färskt underhållsmedium för räkning och platta de isolerade nervcellerna vid en 6,5 gånger 10 till den fjärde livskraftiga celler per centimeter kvadratkoncentration i en milliliter underhållsmedium per brunn i en 12 brunnsplatta. Efter två dagar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid, späd EGFP och mål proteinplasmid DNAs och transfektionsreagens i två separata 1,5 milliliter rör och sedan blanda ihop dem.Transfekt cellerna med EGFP konstruera genom att lägga till transfection mix till brunnarna. Efter 24 timmar, tvätta cellerna med 37 grader Celsius PBS och fixa dem med 4%paraformaldehyd i PBS i 10 minuter i mörker vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, tvätta de fasta cellerna tre gånger med färsk PBS per tvätt och tillsätt en minimal volym av fluorescens monteringsmedium på ett mikroskop glasglas per prov.Överför sedan försiktigt de belagda täckslipsna på monteringsmediet med proverna som är riktade mot glasglasen. För att avbilda neurittillväxten väljer du 40X-målet på ett epifluorescerande mikroskop och klickar på start för att ta bilder från minst 40 intakta EGFP-positiva nervceller per transinfektion. När alla neuriterna har avbildats, öppna de tagna bilderna i ImageJ med Plugin NeuronJ och mäta längden på den längsta neuriten av varje neuron från cellkroppen till spetsen av tillväxtkonen.Analysera sedan de data som erhålls med programvaran för att bestämma effekten av de riktade proteinerna på neurittillväxt. Cytochalasin D dämpar neuritförlängning på ett dosberoende sätt medan neuritutväxt förstärks i nervceller som behandlas med nervtillväxtfaktor. Dessutom stimulerar neuronala tillväxt adaptor protein FE65 avsevärt neurit utväxt tvåfaldigt jämfört med oöversända nervceller.Trots en låg transfection effektivitet, immunofluorescens analys visar att över 80%av en två dagars cell kultur framgångsrikt kan samtransfekteras med EGFP och FE65. EGFP uttryck upptäcks vid sex timmar efter transfection medan FE65 först upptäcks vid timme 12 och båda signalerna upptäcks i upp till sju dagar efter transfection. Transfektion av primära råtta när nervceller med olika mängder FE65 plasmid DNA avslöjar en dosberoende ökning av neurit förlängning med 0 till 0,5 mikrogram FE65 plasmid.Dock observeras ingen signifikant skillnad i tillväxt i nervceller transfected med 0.5 eller ett mikrogram av plasmiden. Vid försök till protokollet är det viktigt att isolera lämplig region från den embryonala hjärnan. Denna teknik kan också tillämpas på studiet av neural tillväxt i mänskliga iPSC-härledda nervceller som har värdefulla verktyg för regenerativ medicin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick näthinnor för Primär cellkulturstudier: En<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Tillvägagångssätt

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiella utväxt Kultur-analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Bedömning av epikardiella-härledda cellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Kirurgisk ablation analys för att studera ögon Regeneration i Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans att analysera intracellulära Transport i nervceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Införliva en endotelceller pärla groning Assay pericyter

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion och validering av cellulära åldras i primära mänskliga celler

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

En multi-omics extraktion metod för djupgående analys av synkroniserade kulturer av den gröna Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...