Name: an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

Bu çalışma Araştırma Hibekonseyi Hong Kong, Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (Hong Kong), CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Charitable Trust fonları tarafından desteklendi.

Takip edilen tüm prosedürler, Hong Kong Çin Üniversitesi hayvan deneyleri etik komitesinin etik standartlarına uygun du.
1. Kapak Kapaklarının Hazırlanması
<ol><li>12 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyunun içine steril 18 mm'lik dairesel bir kapak yerleştirin.</li>
	<li>En az 1 saat nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde 5 μg/mL poli-D-lizin çözeltisi ile örtüyü kaplayın.</li>
	<li>Poli-D-lizin çözeltisini doku kültür plakasından aspire edin ve kaplamalı kapakl...

<ol>
	<li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system:+Lessons+from+neuronal+development.">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li><li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells.">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li><li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth.">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells.">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li><li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies.">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth.">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1.">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain:+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps.">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li><li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+growth:+roles+of+microfilaments+and+microtubules.">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li><li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change.">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li><li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth.">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li><li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription.">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats.">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li><li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro.">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation/Reoxygenation+Injury.">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li><li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement.">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).</li><li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+for+advanced+glycation+end+products+(RAGE)--soluble+form+(sRAGE)+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer.">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li><li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells.">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li><li>Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence:+Basic+Considerations.">Immunofluorescence: Basic Considerations.</a> Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).</li><li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides.">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li><li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+neuronal+cultures.">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).</li><li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+(hiPSC)-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures.">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons.">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle &amp; Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li></ol>

Daha önce de belirtildiği gibi, PC12 ve subklonları yaygın olarak neurite uzantısı çalışmak için istihdam çünkü mükemmel transfeksiyon verimliliği2,3. Buna karşılık, birincil nöronlar düşük transfeksiyon hızıvar, transfeksiyon7ile neurite outgrowth regülatörleri incelenmesi için önemli bir engeldir. Burada, birincil nöronlarda nötrit büyümesini ölçmek için uygun bir protokol uyguluyoruz. Düşük genel tr...

Hem aksonlar hem de dendritler de dahil olmak üzere nöritler, nöral ağların kurulmasında rol oynayan nöronların projeksiyonlarıdır. Nöritlerin dinamik büyümesi nörogelişim için gereklidir. Ancak, altında yatan düzenleyici mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Özellikle, neurite hasar genellikle çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda gözlenen ve beyin yaralanmalarısonra 1. Bu nedenle, çeşitli neurite outgrowth düzenleyici yollarda putatif moleküllerin rollerinin araştırılması süreci anlayışımızı artıracaktır. Ayrıca, çeşitli nörolojik bozukluklar için yeni terapötik hedefler ortaya çıkarabilir. Nöronal hücre hatları onlar işlemek ve transfectkolayolduğu gibi neurite outgrowth dahil olmak üzere nöronal süreçleri incelemek için değerlimodellerdir 2 ,3. Ancak, genetik sürüklenme bazı yaygın olarak kullanılan hücre hatları meydana bildirilmiştir, onların fizyolojik yanıtları varyasyonları yol açabilir4. Ayrıca nöronal hücre hatları ile primer nöronlar arasında diferansiyel protein ekspresyonu gösterilmiştir. Örneğin, PC12, yaygın neuriteoutgrowth2 ,3, NMDA reseptörleri ifade etmez çalışma için kullanılan sıçan adrenal bezinden elde edilen bir nöronal hücre hattı5 . Ayrıca, birincil nöronlara göre nörotoksinlere fare nöroblastom hattı nöroblastom hattı nöro-2a azaltılmış yanıt bazı membran reseptörleri ve iyonkanallarınınifade eksikliği nedeniyle olduğu ileri sürülmuştur 6 . Bu nedenle, birincil nöronlar daha arzu edilen ve temsili bir model neurite outgrowth soruşturma için. Ancak, birincil nöronların kullanımı düşük transfeksiyon verimliliği7tarafından engellenir.
Burada, ilgi proteininin (POI) ve EGFP'nin birincil sıçan kortikal nöronlarına birlikte transfeksiyonunu içeren bir yöntemi tanımlıyoruz. EGFP başarılı transfeced nöronların belirlenmesi için bir morfolojik belirteç olarak davranır ve nöritlerin ölçümü sağlar. Bu yöntemi, netürit büyümesini modüle ettiği bildirilen bileşikler/moleküller kullanarak doğruladık. Ayrıca, FE65, neurite büyüme uyarmak için gösterilmiştir bir nöronal adaptör protein, Bu yaklaşım göstermek için kullanılmıştır8,9. Bu protokol (1) embriyonik gün 18 (E18) sıçan embriyolarından birincil kortikal nöronların izolasyonunu, (2) egfp ve POI (bu çalışmada FE65) ile nöronların birlikte transfeksiyonunu ve (3) görüntü işlemeyi kullanarak nöronların görüntülenme ve analizini içerir. NeuronJ eklentisi ile yazılım ImageJ10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 tweezers</td>
			<td>Regine</td>
			<td>5-COB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circle Cover Slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Sterilize before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 10 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, 12.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13257019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Please see references 8 and 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enhanced green fluorescence protein-based assay for studying neurite outgrowth in primary neurons

Neurite büyüme sinir sistemi gelişimi sırasında nöral devrelerin oluşumunda temel bir olaydır. Şiddetli nötrit hasarı ve sinaptik disfonksiyon çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda ve yaşa bağlı dejenerasyonda meydana gelir. Neurite büyümesini düzenleyen mekanizmaların araştırılması sadece beyin gelişim süreçlerine değil, aynı zamanda bu tür nörolojik bozukluklara da değerli Bir ışık tutamaz. Düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle, şu anda birincil memeli nöronlarda nörit büyüme üzerinde belirli bir proteinin etkisini incelemek zordur. Burada, egfp ve ilgi bir protein (POI) ile birincil sıçan kortikal nöronların co-transfeksiyon tarafından neurite outgrowth soruşturma için basit bir yöntem açıklar. Bu yöntem, EGFP sinyali ile POI transfected nöronların belirlenmesini sağlar, ve böylece neurite outgrowth poi etkisi tam olarak belirlenebilir. Bu EGFP tabanlı test, neurite büyümesini düzenleyen yolların araştırılması için uygun bir yaklaşım sağlar.

Bu metodolojiyi test etmek için, sito D ve sinir büyüme faktörü NGF, sırasıyla inhibe ve nötrit büyümesini uyarmak için gösterilmiştir14,15,16kullanılır. EGFP ile transfektör lüznit uzunluğu Cyto D veya NGF ile tedavi edildikten sonra ölçüldü. EGFP'nin nöronlara transfeksiyon verimi %2.7 (1.068 nöron sayıldı) idi. Şekil 1A'da</stron...

Watch this Scientific Journal Video about An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons at JoVE.com

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Bu yazıda, EGFP ve ilgi proteini ile birlikte transfekting tarafından embriyonik sıçan kortikal nöronlarda neurite büyüme incelenmesi için basit bir protokol açıklanmıştır.

Primer Nöronlarda Neurite Outgrowth Çalışma için Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein Tabanlı Test

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Düşük transfeksiyon verimliliği, proteinin primer nöronlarda nörit büyümesini nasıl yeniden aktive ettigini belirlemenin önünde önemli bir engeldir. Protokolümüz bu sorunu başarılı bir şekilde transfected hücreleri belirlemek için EGFP'nin birlikte transfeksiyonu ile aşmaktadır. EGFP'nin yüksek transfeksiyon oranı ve ilgi proteinleri, talın doğruluğunu sağlar.Ve sonuç olarak, immünoresans boyama artık gereklidir. Nöral rejenerasyon sırasında neurite büyüme oluşur gibi, Bu yöntem beyin travması veya nörodejeneratif hastalıklarda hasarlı nöronal ağ geri için yeni hedeflerin belirlenmesi için uygulanabilir. İşleme başlamadan önce, 12 kuyu doku kültür plakasının her kuyusunun içine steril 18 milimetrelik dairesel bir kapak yerleştirin ve her coverslip'i milimetre başına beş mikrogram ile nemlendirilmiş 37 derece likantide en az bir saat boyunca Poli-D-Lizin çözeltisi ile kaplayın.Kuluçka sonunda Poli-D-Lizin çözeltisini aspire edin ve kapakları steril suyla durulayın. Embriyonik gün 18, 10 santimetre Petri çanak içine zamanlanmış hamile Sprague Dawley sıçan hasat rahim yerleştirin ve rahim ve amniyotik kese açmak için küçük diseksiyon makas kullanın. Plasentayı çıkarmak için makas kullanın ve soğutulmuş PBS glikoz içeren yeni bir 10 santimetre Petri kabına bir bütün embriyo aktarmak için plasedik kullanın.Kafatasının sagittal sütür boyunca kesmek için makas kullanın ve taze buz soğuk PBS glikoz içeren yeni bir 10 santimetre Petri çanak içine embriyonik beyin aktarmak için küçük bir düz spatula kullanın. İki numaralı beş cımbız ve bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, beyincik ve beyin sapından iki serebral hemisfer ayırın ve menenjler kaldırın. Sonra serebral hemisferlerden korteks izole ve taze buz soğuk PBS glikoz içeren 15 mililitrelik tüp korteks yerleştirin.Birincil kortikal nöron kültürü için, bir sınıf II biyogüvenlik kabine, korteks yerçekimi ile beş dakika için dört derece santigrat yerleşmek için izin 0.05% tripsin EDTA ile PBS glikoz değiştirmeden önce. Nazik dokunarak karıştırın ve ek nazik her iki dakikada dokunarak 10 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda doku kuluçka. Kuluçka sonunda, bakım orta dört mililitre ile sindirim durdurmak ve nazik trituration ile doku ayrıştırmak için bir mililitre pipet kullanın.Hücreleri santrifüj ile tortula çökün ve ikinci bir santrifüj için bir mililitre bakım ortamıiçinde peleti yeniden askıya alın. Sayım için bir mililitre taze bakım ortamının ikinci santrifüjünden sonra oluşan peleti yeniden askıya alın ve izole nöronların 12 kuyu plakasında ki bir kuyuda bir mililitre bakım ortamının bir mililitrelik konsantrasyonunda santimetre karesi olan dördüncü canlı hücreye kadar 6,5 kat 10'da plakalayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit iki gün sonra, seyreltik EGFP ve hedef protein plazmid DAA ve transfeksiyon reaktif iki ayrı 1.5 mililitre tüpler ve sonra onları karıştırın.EGFP ile transfect hücreler kuyulara transfeksiyon karışımı ekleyerek inşa. 24 saat sonra hücreleri 37 santigrat derece PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika pbs%4 paraformaldehit ile düzeltin. Kuluçka sonunda, sabit hücreleri yıkama başına taze PBS ile üç kez yıkayın ve numune başına bir mikroskop cam kaydırağı üzerine en az hacimli floresan montaj ortamı ekleyin.Daha sonra cam kaydıraklara bakan örneklerle kaplamalı kapakları montaj ortamına dikkatlice aktarın. Nötrit büyümesini görüntülemek için, epifloresan mikroskobun 40X hedefini seçin ve transfeksiyon başına en az 40 bozulmamış EGFP pozitif nörondan görüntüler yakalamak için başlat'ı tıklatın. Tüm nöritler görüntülendiğinde, NeuronJ eklentisi ile ImageJ yakalanan görüntüleri açın ve büyüme konisi ucuna hücre vücudundan her nöron en uzun nöronun uzun luğunu ölçmek.Daha sonra hedeflenen proteinlerin nörit büyümesi üzerindeki etkisini belirlemek için yazılımla elde edilen verileri analiz edin. Sitokasin D, neurite outgrowth sinir büyüme faktörü ile tedavi nöronlarda geliştirilmiş ise doza bağımlı bir şekilde neurite uzantısı bastırır. Buna ek olarak, nöronal büyüme adaptörü protein FE65 önemli ölçüde transfected nöronlar ile karşılaştırıldığında iki kat neurite outgrowth uyarır.Düşük transfeksiyon verimliliğine rağmen, immünoreskence analizi iki günlük hücre kültürünün %80'inden fazlasının EGFP ve FE65 ile başarılı bir şekilde transfeced olabileceğini ortaya koymaktadır. Fe65 ilk saat 12'de tespit edilirken eGFP ekspresyonu transfeksiyon sonrası altı saat içinde tespit edilir ve her iki sinyal de transfeksiyon sonrası yedi gün boyunca tespit edilir. Fe65 plazmid DNA farklı miktarlarda primer sıçan kortikal nöronların transfeksiyon FE65 plazmid 0 ila 0,5 mikrogram ile nisit uzantısı doza bağımlı bir artış ortaya koymaktadır.Ancak plazmidin 0.5 veya bir mikrogramı ile transfekte olan nöronlarda büyümede anlamlı bir fark gözlenmez. Protokolü denerken, embriyonik beyinden uygun bölgeyi izole etmek önemlidir. Bu teknik aynı zamanda rejeneratif tıp için değerli araçlara sahip insan iPSC kaynaklı nöronlarda nöral büyüme çalışması için uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii eşitlenmiş kültürlerin derinlemesine analizi için Multi-Omics ekstraksiyon yöntemi

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...