Name: mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin
Uploaded: 2019-09-12T14:45:00
Duration: 10 min 21 s
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这项工作得到了NIH赠款R01NS093045（Y.H.），NIH赠款K08DK088950（X.Z.），R03DK099566（X.Z.）和美国克罗恩和科利蒂基金会研究奖学金（CCFA）481637（R.M.）的支持。

对于这份手稿，所有人类样本都是根据研究所审查委员会（IRB）和奥尔巴尼医学院人类研究委员会批准的议定书采购的。所有涉及动物的研究都严格按照奥尔巴尼医学院机构动物护理和使用委员会以及国家卫生研究院关于护理和使用实验室动物的指南批准的协议进行.
1. 收集人类肠道标本
<ol><li>根据该机构的研究委员会协议收集人体组织样本。</li>
	<li>从没有 IBD 病史的患者身上获取诊断为纤维化的 CD 患者的肠道组织（结肠）。</li>
	<li>使用部分肠道组织进行免疫组织学，将组织的另一部分用于分析mRNA，以及纤维化和细胞因子基因/标记蛋白表达的最后一部分。</li>
	<li>对于免疫组织学分析，首先将人体组织样本固定在4%的甲醛中至少48小时，然后将其转移到含有70%乙醇的管中至少16小时。使用组织-微托姆的部分。</li>
	<li>使用刷子，轻轻地将玻璃滑块上每个切割部分铺开，以便进行染色。</li>
	<li>染色组织部分滑动与三铬染色检测胶原蛋白沉积，并与βSMA染色检测肌纤维细胞（见第3节有关三铬和βSMA染色的详细信息）。在光学显微镜下检查染色部分。</li>
	<li>处理获得人体组织样本的另一部分，使蛋白质解结酶通过西斑检测βSMA（有关西方斑点分析的详细信息，见第7节）。</li>
	<li>使用提取试剂（材料表）从人体组织样本的最后部分获取RNA，并通过RT-PCR将mRNA转化为cDNA。</li>
	<li>通过 qPCR 分析纤维化和细胞因子基因（有关 mRNA 制备的详细信息，请参阅第 6 节）。</li>
</ol>2. 小鼠TNBS纤维化和拉帕霉素治疗的诱导
<ol><li>根据机构批准的动物研究规程进行动物研究。</li>
	<li>在颈部区域周围切下成年小鼠，以便通过皮肤接触对TNBS进行预敏。将 TNBS 浸泡在棉签中，然后将 TNBS 涂抹到小鼠颈部的被扫描区域。 注：预敏化是一个非常重要的步骤，因为它改善延迟超敏反应，以启动TNBS介导的炎症。</li>
	<li>敏感后8天，每周一次，每周一次，为期六周，通过直肠内给政治疗诱发结肠炎。通过连接到3.5法国聚氨酯导管的1mL注射器，使用100μL灌肠，使用4毫克TNBS（在25%乙醇中），仅给对照小鼠100μL25%乙醇。<ol>
<li>在TNBS给内，用五巴比妥（25毫克/千克腹内）麻醉小鼠，或将其暴露于2.5%的亚氟兰，以及1升/分钟的氧气。通过轻轻捏脚趾和寻找没有反射来确认麻醉。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在小鼠麻醉时，使用眼睛上的兽医药膏来防止干燥。</li>
	<li>每周一周向对照和TNBS治疗的小鼠注射2mg/kg/天或车辆（5%补间-20和4%乙醇），持续3-6周，内腹炎。</li>
	<li>使用6周TNBS经过治疗的小鼠肠道分析细胞外测定，包括成科、流式细胞测定、西印和RNA提取。为了收获器官，使用CO2吸入对小鼠实施安乐死，并确认宫颈脱位安乐死。<ol>
<li>为了收获器官，使用CO2吸入对小鼠实施安乐死，并确认宫颈脱位安乐死。安乐死后，用手术级剪刀和钳子纵向打开小鼠的腹腔侧。从直肠中取出整个结肠到终端的二聚体区域。快速将结肠转移到冰冷的 1x HBSS，并使用相同的缓冲液清洗结肠。</li>
		<li>测量和比较对照和TNBS处理小鼠的结肠长度。尽可能快地执行此步骤，以避免结肠干燥，以避免细胞死亡。</li>
		<li>将结肠切成小块，并保持在-80°C，以储存，以用于将来（RNA/西斑分析）。使用另一个冒号进行 FACS 分析。</li>
		<li>一定要从对照和TNBS处理的动物结肠的类似区域切块和收集结肠组织样本。 注：TNBS接种可预期死亡率为10%-20%，但经验可显著降低死亡率。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 肠道纤维化的免疫组织病理学评估
<ol><li>将人和/或小鼠组织固定在4%的甲醛中48小时，然后转移到70%乙醇16小时。 注：甲醛是一种神经毒性化学物质，因此避免吸入;使用面罩时使用。</li>
	<li>石蜡嵌入固定结肠组织，切片至5μm厚度，并直接将组织放在玻璃玻片上，用于组织学。</li>
	<li>根据制造商的说明执行 H&E 和三铬蓝色染色，以检测胶原蛋白。<ol>
<li>简单地说，首先将包含截面的幻灯片浸入两室的两室中，在每个腔室中浸解5分钟。</li>
		<li>用100%酒精冲洗幻灯片1分钟;重复此步骤三次。用自来水再次冲洗1分钟。</li>
		<li>之后，在56°C的预热布恩溶液中浸泡幻灯片60分钟。布恩的溶液外观为黄色;在自来水中从布恩溶液中拿出幻灯片3分钟后洗净，或直到幻灯片变成无色。</li>
		<li>在室温下将幻灯片浸入改性迈尔的血氧林溶液中 7 分钟。</li>
		<li>在Trichrome染色中浸泡5-8分钟，将幻灯片浸入三铬污渍中5-8分钟。立即在自来水中冲洗幻灯片5-10秒，以去除多余的Trichrome污渍。</li>
		<li>脱水幻灯片与100%酒精1分钟。重复这个程序三次。</li>
		<li>用二甲苯清除幻灯片 1 分钟，然后重复步骤 3 倍。</li>
		<li>使用安装介质安装滑轨 （材料表）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>小心地用钳子将盖玻片握住，使其覆盖整个部分，而不会有任何气泡。如果有气泡，请点击盖玻片快速去除气泡。</li>
	<li>使用免疫染色检测βSMA。<ol>
<li>在室温下阻塞缓冲液（0.2%Triton X-100 和 5% 正常山羊血清，在 1x PBS 中）中阻塞结肠部分 1 小时。</li>
		<li>在4°C过夜的4°C下，在滑道溶液（0.2%Triton X-100和3%正常山羊血清）上孵育100μL稀释原抗体的βSMA（材料表）。</li>
		<li>用 1x PBS 洗涤部分三次。</li>
		<li>使用山羊抗小鼠IgG （H + L）与Alexa荧光488（材料表）结合作为二级抗体在室温下2小时。</li>
		<li>用 1x PBS 洗涤部分三次。</li>
		<li>使用 DAPI 对原子核进行 5 分钟的抗污。</li>
		<li>用 1x PBS 洗涤部分三次。</li>
		<li>用荧光安装介质安装滑梯（材料表），并用指甲油盖玻片密封。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用LSM 880共聚焦显微镜采集图像，并使用显微镜软件处理图像。</li>
	<li>使用 ImageJ 在同一节中平均拍摄多个选定区域，从而量化图像。</li>
</ol>4. 分离肠道拉皮纳普氏体和纯化Cx3Cr1+单核吞噬细胞
<ol><li>纵向打开冰冷的汉克平衡盐溶液（HBSS;材料表）用同样的缓冲液清洗结肠。</li>
	<li>在 HBSS 中使用无菌剪刀切割约 5 厘米小结肠组织。</li>
	<li>在含有10 mL预消化缓冲液的50 mL锥形管中转移小结肠组织片（1x HBSS，带5%FBS、5 mM EDTA和1 mM DTT），在37°C培养箱11中，在100rpm下摇动20分钟。 注：在100rpm摇动条件下，在37°C中孵育结肠组织，允许有效的胶原酶组织消化和高产活细胞。</li>
	<li>通过40μm细胞过滤器，丢弃分离的结肠上皮。</li>
	<li>从滤网中收集剩余的组织，并在消化缓冲液中进一步消化，其中含有胶原酶IV型和DNase I（材料表），在1xHBSS中，在37°C的转速100rpm下，用5%FBS进行20分钟。</li>
	<li>涡旋消化组织约20秒，并通过40μm细胞过滤器获得拉米纳普氏菌分。</li>
	<li>在 4°C 中，将层皮基球分在 700 x g下颗粒</li>
	<li>要从拉米纳基里亚中排除死细胞，请使用密度梯度（材料表）。 注：此处使用的密度梯度介质（材料表）可能导致单核细胞的丢失;然而，它极大地去除了制备中的死细胞，这整体上提高了纯度。<ol>
<li>在 30% 和 70% 密度梯度介质解决方案中，每个解决方案均生产 100 mL。在 30% 溶液的 10 mL 中重新悬浮获得的细胞，并在 15 mL 管中覆盖在 70% 溶液的 5 mL 之上。</li>
		<li>在 1，000 x g和室温下，在无制动器条件下将梯度离心。收集含有拉米纳普拉姆细胞的白色环相，这将在30%和70%梯度层之间。</li>
	</ol></li>
	<li>在冰冷的HBSS中重新悬浮和在500 x g、20°C下离心机10分钟洗涤获得的细胞。 在FACS（荧光活性细胞分选）缓冲液（PBS，pH 7.4，1%BSA和2 mM EDTA）中重新悬浮细胞。</li>
	<li>使用磁珠和/或FACS分拣从收集的细胞中纯化单核噬细胞。<ol>
<li>磁性净化<ol>
<li>在用抗体染色之前，使用抗小鼠CD16/CD32 Fc阻滞剂孵育层皮质细胞的第一块细胞表面在冰上孵育15分钟。</li>
			<li>用抗Cx3Cr1-PE（纤维素）抗体与抗PE微珠（材料表）在冰上孵育细胞30分钟，以捕获结合的细胞。使用 FACS 缓冲液清洗细胞。</li>
			<li>通过磁场中的磁性激活细胞分拣柱将抗体/珠结合细胞传递，以去除未结合的细胞。使用 FACS 缓冲液洗涤三次。从磁场中取出柱，并推入柱塞，以产生珠约束单元。</li>
		</ol>
</li>
		<li>FACS 排序 注：FACS分拣可用于代替磁性净化。尽管磁纯化是一种简单且经济高效的方法，但它仅限于纯化单个细胞，而不是细胞亚群。因此，为了分离细胞的亚群，FACS排序方法是对单个细胞以及细胞子群进行排序的有效方法。<ol>
<li>使用抗小鼠 CD16/CD32 Fc 阻滞剂 （材料表） 阻止拉米纳基里亚细胞。</li>
			<li>通过用抗CD64、CD11c、CD11b、Cx3Cr1、Ly6C和MHCII抗体孵育染色细胞。</li>
			<li>使用 FACS 流式细胞仪进行排序，对 CD11c-CD64 + CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C-细胞进行门控，以纯化 CX3Cr1 （P3 + P4） 总体。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Lyse 对细胞进行总RNA制备，并检测细胞因子和纤维化标记（参见RNA和cDNA制备第6节）。</li>
	<li>分析纤维化标记物的mRNA表达和从磁性纯化分离的单细胞悬浮液的炎症细胞因子分析。</li>
	<li>对于FACS分析，在用抗体对表面或细胞内标记染色之前，用抗小鼠CD16/CD32Fc阻滞剂（材料表）阻断细胞。</li>
</ol>5. 流式细胞分析
<ol><li>细胞表面染色和分析<ol>
<li>在 50 mL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮 5-10 × 105分离的拉米纳普列菌细胞（1% BSA，PBS 中的 2 mM EDTA，pH 7.4）。</li>
		<li>用抗小鼠CD16/CD32（材料表）孵育细胞，以1：50稀释，将Fc受体在冰上阻断10分钟。</li>
		<li>使用 500 μL 的冰冷的 FACS 缓冲液清洗细胞，以去除细胞表面染色前的未结合抗 CD16/CD32。</li>
		<li>表面染色结肠单细胞悬浮液（106细胞/50 mL），在1：100稀释冰上1：100稀释30分钟，以评估结肠拉米纳普氏菌。</li>
		<li>用500μL的冰冷的FACS缓冲液清洗标记的细胞两次，以去除未结合的抗体。</li>
		<li>通过流式细胞测定法分析标记的单核细胞。门为实时，然后为FSC+SSC+其次是CD11b+ Cx3Cr1+，然后分析其他巨噬菌体激活标记，包括MHCII，CD80，CD86和CD40。</li>
	</ol>
</li>
	<li>细胞内细胞因子染色和分析<ol>
<li>对于细胞内细胞因子染色，使用固定/渗透溶液套件（材料表）修复和渗透表面染色的细胞;请按照制造商的说明了解详细步骤。</li>
		<li>门拉皮纳蛋白酶细胞用于活，然后用于FSC+SSC+后跟CD11b+ Cx3Cr1+IL23+检测IL23细胞因子和CD11b的细胞内水平= Cx3Cr1+IL1+检测IL1+细胞因子的细胞内水平。</li>
	</ol>
</li>
	<li>*SMA 染色和分析<ol>
<li>用FACS缓冲液洗涤细胞两次，在200 x g和4°C下离心5分钟，以去除多余的固定缓冲液。</li>
		<li>要确定βSMA水平，使用固定/渗透溶液套件（材料表）渗透细胞。</li>
		<li>用抗βSMA-AF488抗体（材料表）孵育细胞，在冰上稀释1：1，00030分钟。</li>
		<li>洗涤细胞两次，然后做FACS分析。活门，FSC+SSC=然后检测结肠细胞中的βSMA+细胞。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. RNA分离，RT-PCR，实时PCR
<ol><li>通过在萃取试剂中将其同质化，从MACS或FACS纯化细胞或结肠切除组织中分离RNA（材料表）。 注意：使用此试剂时，请使用安全护目镜和其他实验室防护装备，因为它是肺部和皮肤刺激物。在引擎盖中安全地工作。</li>
	<li>从20μg/mL糖原库存溶液（材料表）中加入0.5μL的无RN酶糖原，以改善在用异丙醇沉淀RNA之前总RNA的恢复。</li>
	<li>将RNA颗粒重新悬浮在50μL的RNase自由水（材料表）中，并在55°C孵育5分钟，以完全溶解RNA味觉。</li>
	<li>使用 260 nm 的分光光度计读取 RNA 浓度。</li>
	<li>使用1μg总RNA和逆转录合成试剂盒合成cDNA（材料表）。</li>
	<li>通过实时PCR分析使用2μL的cDNA作为模板的基因表达。使用 96 孔 PCR 板 qPCR 主混合套件 （材料表）。在GAPDH/HPRT值正常化后，使用CT值计算RNA丰度的折叠变化。</li>
</ol>7. 西方印迹
<ol><li>使用RIPA裂液缓冲液（1%NP40）进行裂化结肠组织。</li>
	<li>在80V的恒定电压下，在8%的二元凝胶中分解蛋白质解乳酸。</li>
	<li>在冷转移缓冲液中将凝胶蛋白转移到硝化纤维素膜，在4°C下以50 mA的恒定电流运行2小时。</li>
	<li>在TBST（25 mM Tris-HCl，pH7.4，1.5M NaCl，0.05%补间-20）下，使用5%的脱脂牛奶在TBST中阻断蛋白质转移膜上的非特定区域，在室温下至少1小时。</li>
	<li>为了检测βSMA水平，在4°C过夜时用βSMA原发检测抗体孵育膜。</li>
	<li>每隔15分钟使用TBST清洗膜3-4次。</li>
	<li>在TBST的5%非脂牛奶中用HRP结合的二级抗体（1：10，000）孵育。</li>
	<li>使用 ECL 开发套件开发膜。</li>
	<li>使用 GAPDH 使蛋白质信号强度标准化，作为密度分析的载荷控制。</li>
</ol>8. 统计分析
<ol><li>通过比较野生动物和KO动物，利用所选择的数据分析软件分析数据。</li>
	<li>将 <0.05 的 P 值视为显著值（*P < 0.05;+P < 0.01;+P < 0.01）。</li>
	<li>使用学生 t 检验测试来测试两组之间的差异，而 ANOVA 测试则用于分析两组以上组之间的差异。</li>
</ol>

<ol>
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相互竞争的利益：作者声明没有相互竞争的利益。

伤口愈合或组织修复是一个严格调节的生物过程17。在化学、机械和感染条件下的组织损伤期间，炎症反应触发组织修复过程。然而，调节不良和病理性炎症反应导致发展疤痕或纤维化反应，这可能损害组织修复功能9，18，19。在这里，我们展示了TNBS诱导纤维化动物模型的程序，该模型与人类克罗恩病显著地共享病理生理学。连续接种TNBS化学暴露损害小鼠上皮会导致深度溃疡，并诱导纤维化发展。该方法可靠、成本低、病害发病快速诱导，在组织损伤、体外炎症和肠脑轴研究方面为多个研究小组广泛接受。
为了成功实施TNBS纤维化模型，有几个重要的步骤。例如，TNBS给药的充足剂量和时间是非常重要的。6-8周的TNBS接种允许深度组织溃疡，强烈建议用于慢性纤维化研究。小鼠流出的粪便和接种的TNBS的逆行反射是两个主要问题，可能导致向小鼠提供可变剂量。小鼠直肠附近的温和压力可能有助于在TNBS前释放粪便。将动物的头按住几秒钟，极大地有助于阻止TNBS的反向反流。把老鼠关在笼子里，把笼子放在热垫上，给老鼠提供纳帕花蜜，也是防止高死亡率的有用策略。
在这里，我们还讨论了TNBS纤维化期间的肠道炎症及其对纤维化反应的影响。mTOR/自噬作用广泛涉及肠道平衡和IBD发病机制20，21。我们发现mTOR/自噬信号对调节来自Cx3Cr1的IL-23和IL1+细胞因子的亲炎反应至关重要，这些细胞因子影响亲纤维化IL-23/IL-22轴的单核噬细胞（图3A）9.因此，纯化单Cx3Cr1和单核细胞进行免疫分析和基因表达是该模型的关键步骤。我们详细讨论了分离拉米纳普里亚的协议，并为使用磁珠的Cx3Cr1– 单核细胞提供了纯化程序。
总体而言，尽管存在克罗恩病的遗传和自发模型，TNBS-结肠炎仍然是研究CD免疫发病机制的有力工具，并有可能评估克罗恩的纤维化治疗。使用化学诱导的纤维化模型（如 TNBS）的主要限制是用户对用户的高变异性以及数据中异常值的可能性。每组 5-8 只动物的样本大小以及更增强的用户体验可以提高模型的一致性。然而，找到一个合适的基因模型导致自发克罗恩的纤维化是，将永远是必要的。

肠道免疫平衡调节不良导致致病性炎症，并广为人知导致炎症性肠病（IBD）1，2。肠道纤维化是炎症性肠病（IBDs）的慢性后果，如克罗恩病（CD）3。CD的不可逆病理生理学包括肠道严格性或纤维化狭窄，这限制了治疗选择，而且目前没有药物，唯一的治疗是手术。最终，开发有效疗法来对抗不适当的炎症是研究CD机制非常需要的，这将使我们更接近于此。
有多种基因小鼠模型可用于研究IBD，包括IL10 KO、SAMP/Yit和采用CD45+RB高细胞转移到SCID小鼠4，5，6。在这里，我们展示了在CD小鼠模型中TNBS介导纤维化的程序，与人类克罗恩纤维化的病理学相媲美。TNBS诱导模型具有一定的优势。此模型在技术上很简单;疾病发病迅速，价格低廉，可广泛用于不同动物（如小鼠、大鼠和豚鼠7）。乙醇和TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）的共管突然破坏肠道屏障，使结肠组织蛋白暴露在TNBS中，引起大量免疫反应8，9。反复接触TNBS会导致对炎症和损伤反应过度反应的修复过程，并在肠道中形成纤维化反应。因此，TNBS诱导的纤维化模型是研究克罗恩相关肠道纤维化的一个非常令人信服的模型。
此外，单核噬细胞是仲裁先天免疫反应的发病机制和损伤在肠道10，11，12，13的主要细胞。为了阐明细胞机制，并确立Cx3Cr1+单核噬细胞在TNBS纤维化模型中的作用，我们展示了纯化单核噬细胞的过程。分析Cx3Cr1+细胞是评估炎症标记和确定肠道纤维化伴随机制的重要步骤。总体而言，TNBS纤维化的这一详细程序将有助于解释肠道纤维化的细胞机制。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>53-9760-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>149760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>101226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse purified CD16/32 Fc block</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>14-9760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-105-639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-isdn</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D263-5vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 40&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td><a href="http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software Inc</td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>HXMMHPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percol</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA/Ionomycin salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A25777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>LC LABORATORIES</td>
			<td>1003799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>92823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichorme staining kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>STOSTBPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black 2.1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue lite 2.3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin

已经进行了重要的研究，以了解肠道纤维化的有效管理。然而，缺乏对纤维化的更好知识阻碍了预防性药物的开发。首先，找到一个合适的动物模型对于理解克罗恩相关的肠道纤维化病理学机制具有挑战性。在这里，我们采用了一种有效的方法，即TNBS化学接触小鼠直肠产生深度溃疡和慢性炎症，然后小鼠慢性发展肠道纤维化。此外，我们描述了一种技术，其中拉帕霉素注射显示抑制作用，在TNBS介导纤维化在小鼠模型。为了评估纤维化的基本机制，我们有条不紊地讨论了从TNBS治疗和控制小鼠的拉米纳普里亚中纯化Cx3Cr1+细胞的程序。这一详细的方案将有助于研究人员谁正在研究纤维化的机制，并铺路找到更好的治疗发明的克罗恩相关的肠道纤维化。

我们采用TNBS结肠炎小鼠模型来研究和阐明肠道纤维化8的基本机制。在这里，我们对TNBS介导的结肠炎进行了详细的时间过程研究，其中TNBS每周对野生型小鼠进行直肠管理，时间长达6周，如原理图所示（图1A）。经过六周的TNBS治疗，我们注意到结肠长度在TNBS治疗过程中逐渐缩短，从对照组的平均值5±0.5厘米缩短到TNBS组的平均3~0.5厘米;这种对结肠长度的定量分析表示结肠长度的非常明显的减少（图1B）。为了确保TNBS克罗恩病模型与人类克罗恩的纤维化模型相媲美，并且不是与该方法相关的伪影，我们在TNBS注射到野生类型的详细时间过程中分析了多层面的纤维化标记物。.在大多数纤维化发生率中，已报告阿尔法平滑肌活动（βSMA）阳性细胞和胶原蛋白沉积在大多数纤维化发生率中，并被视为纤维化事件14的标志。我们发现，被染上βSMA的TNBS处理小鼠的结肠部分在结肠亚粘体层上呈4-6倍增长，正染上βSMA（图1C）。此外，这些部分的Trichrome蓝色染色也显示2-4倍增加，表明明显的胶原蛋白沉积，这验证了严重的肠道纤维化（图1D）。我们进一步评估了肌纤维细胞的活化，通过FACS分析检测βSMA阳性细胞在TNBS处理小鼠结肠，并发现显著积累的βSMA阳性染色（图1E）。此外，我们发现在TNBS处理小鼠的qPCR分析下，在βSMA、Col-I和Col-III的表达中进行了大量诱导（图1F）。在西方斑点分析中βSMA蛋白的表达增加，表明纤维化增加（图1G）。总体而言，TNBS动力学治疗提供了在慢性疾病中获得假定免疫反应的机会，这与CD慢性相症密切相关，对纤维化发展至关重要。
为了比较TNBS纤维化与克罗恩的相关纤维化，我们分析了活跃CD或缓解患者在新鲜组织活检中纤维化标记和细胞因子的表达。值得注意的是，我们发现βSMA阳性层增稠显著诱导，在活性CD部分通过三铬染色检测到胶原蛋白沉积增加（图2A）。我们还进行了西印体分析，并确认了活性CD样本中βSMA表达的诱导（图2B）。此外，我们还观察到了通过qPCR分析检测到的纤维化标记物（如图2C）的显著诱导，包括βSMA、Col1。
接下来，为了确定一种机制来限制TNBS纤维化，我们评估了雷帕霉素的影响，雷帕霉素是mTOR活性15，16的药理抑制剂。因此，我们用TNBS和拉帕霉素对小鼠进行了治疗，并分析了结肠组织学中的βSMA和胶原蛋白水平，并在密度测定图中显示了βSMA和胶原蛋白的定量测量（图3A）。我们的数据表明，拉帕霉素减少了亚粘层中的βSMA阳性染色，并减少了胶原蛋白沉积。为了进一步验证和量化纤维化反应，我们通过qPCR确定了βSMA、胶原蛋白和TGF®表达，并通过TNBS处理结肠中的流式细胞测定法测定了βSMA表达（图3B，3C）。我们还表明Cx3Cr1–单核噬细胞诱导炎症免疫反应损伤9。因此，我们想看看在TNBS治疗的小鼠中给拉帕霉素的分用是否能逆转炎症和纤维化的影响。因此，我们使用磁性微珠从结肠单细胞悬浮液中纯化Cx3Cr1+常驻单核噬细胞（图3D）。我们发现Cx3Cr1的p-p70和p-S6水平增加——通过TNBS处理小鼠的西方斑点分析，居民单核噬细胞，这一水平被雷帕霉素（图3E）阻断。此外，我们发现，在TNBS处理组（图3F）中，拉帕霉素治疗会抑制IL-23和IL-1+。此外，这些发现阐明了TNBS纤维化诱导的有效机制，并表明雷帕霉素能减弱纤维化的诱导。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig1.jpg"> 图1：成功的TNBS给政导致小鼠肠道纤维化。给野生型小鼠的每周TNBS治疗的图状图表示.B.在TNSB治疗后的第0周、第2周、第4周和第6周采集的TNBS处理小鼠的结肠图像和结肠长度的测量。C-D.结肠部分组织学分析沾染抗βSMA抗体，用于激活肌纤维细胞和胶原蛋白的三铬蓝色染色;刻度条 100 μm.FACS 分析，以识别结肠中的 βSMA 阳性细胞和 βSMA 阳性细胞的定量。F. qPCR检测到的纤维化标记和细胞因子。G. TNBS处理和控制小鼠结肠莱沙的βSMA的西方污点分析。这个修改的数字是重复使用，并经前一出版物9在粘膜免疫学，2019年由Mathur等人<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig1large.jpg" target="_blank">使用。 请点击这里查看这个数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig2.jpg"> 图2：TNBS纤维化与克罗恩相关的肠道纤维化相当。A.结肠活检对照的代表性图像，活性CD显示三铬蓝色染色和βSMA阳性染色在亚粘层中显著增加，刻度条50μmB。 西方对_SMA表达和定量的污点分析。C.纤维化标记和细胞因子的qPCR分析。这个修改的数字是重复使用，并经前一出版物9在粘膜免疫学，2019年由Mathur等人<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig2large.jpg" target="_blank">使用。 请点击这里查看这个数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig3.jpg"> 图3：拉帕霉素治疗有效改善TNBS诱发纤维化。A.结肠组织分析 - 肌纤维细胞染色与抗βSMA抗体和胶原蛋白染色与Trichrome蓝色，刻度棒100μm的代表性图像。 TNBS 处理的小鼠结肠。C. FACS分析用对照/TNBS处理的小鼠结肠单细胞悬浮液中的βSMA。D. Cx3Cr1–细胞从结肠层皮基体基质部分和FACS纯化细胞分析的纯化架构。E.用TNBS和/或雷帕霉素治疗的小鼠的纯化Cx3Cr1+单核噬细胞中p-p70和p-S6水平的西方斑点分析。F. qPCR分析纯化Cx3Cr1+单核噬细胞中的表达，产生IL-23和IL-1+。这个修改的数字是重复使用，并经前一出版物9在粘膜免疫学，2019年由Mathur等人<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig3large.jpg" target="_blank">使用。 请点击这里查看这个数字的较大版本。</a>

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Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

在这项研究中，我们描述了TNBS介导的肠道纤维化的详细过程，它具有与克罗恩纤维化类似的病理生理学。我们还讨论了这种方法，鉴于拉帕霉素促进抑制作用的肠道纤维化。

对TNBS介导肠纤维化发展的力学洞察与拉帕霉素抑制作用的评价

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

该协议在人类中表现出克罗恩纤维化高度可比的病理生理学，并讨论了拉帕霉素的抑制作用对肠道纤维化的影响。该协议的主要优点是，它描述了肠道纤维化的发展在很短的时间从四到八周，这给了我们机会来研究组织修复和组织再生。该协议将有助于研究人员谁急于获得纤维化的机制，并帮助找到更好的技术，以预测干预克罗恩相关的肠道纤维化。要开始此过程，请剃光颈部周围的成年小鼠，以便通过皮肤暴露对 TNBS 进行预敏感。然后用 TNBS 浸泡一个科顿拭子，并将其涂抹在鼠标颈部的剃光区域。敏感后八天，每周一次，六周，通过直肠内治疗诱发结肠炎。为此，使用100微升灌肠，通过连接到钢磨针的1毫升注射器，在25%乙醇中应用4毫克TNBS。只给对照小鼠100微升25%乙醇。麻醉小鼠后，每天以每公斤两毫克的速度注射雷帕霉素，或两者同时注射，每个工作日为对照组和TNBS治疗小鼠注射三到六周。在此之后，使用六周TNBS后处理小鼠肠道分析细胞外测定。首先，在冰冷的HSS中纵向打开结肠，在HBSS中清洗结肠。使用无菌剪刀将结肠切成大约五厘米的 HBSS 小片。将小结肠组织片段转移到含有10毫升消化缓冲液的15毫升锥形管中。在 37 摄氏度的培养箱中以 100 RPM 转速摇动管子 20 分钟。接下来，通过40微米细胞过滤器的悬浮液，并丢弃附着的结肠上皮。从过滤器中收集剩余的组织，并在含有胶原酶 IV 型和 DNASE1 的消化缓冲液中进一步消化，在 1X HBSSS 中，用 5%FBS 在 37 摄氏度的培养箱中 20 分钟，同时在 100 RPM 下摇动。在此之后，涡流消化的组织约20秒，并通过一个40微米细胞过滤器，以获得层状的正分。在700倍的G和4摄氏度的离心层状，以分解细胞。然后，制作 100 毫升的 30% 和 70% 密度梯度介质解决方案。将获得的细胞重新用 30% 溶液的 10 毫升中重新发送，并覆盖在 15 毫升管中 70% 溶液的 5 毫升以上。在1000倍G和室温下在无断裂条件下将梯度离心。收集含有层状淋巴细胞的白环相，该细胞将在30%和70%梯度层之间。将获得的细胞重新在冰冷的HSS中清洗，并在500°C和10摄氏度下离心10分钟。然后在 FACS 缓冲区中重新发送单元格。在抗体染色之前，首先用抗小鼠CD16在冰上用32FC阻滞剂孵育15分钟，阻断层状细胞的细胞表面。接下来用抗CX3CR1PE抗体和抗PE微珠在冰上孵育细胞30分钟，捕获结合细胞，然后用FACS缓冲液清洗细胞。通过磁场中的磁激活细胞分拣柱传递抗体和珠束细胞，以去除未绑定的细胞。用 FACS 缓冲液清洗细胞三次。在此之后，从磁场中移除柱，并推柱塞在柱中产生珠束细胞。首先，用32FC块在冰上用抗小鼠CD16阻断拉米纳丙烯细胞。使用抗CD64、CD11c、CD11b、CX3CR1、Ly6C和MHC II类抗体对细胞进行应变，然后使用FACS流式细胞仪对细胞进行排序，如文本协议中所述。将分类的细胞酶，用于总RNA制备，并检测细胞因子和纤维化标记。从磁纯化中分离的单细胞悬浮液分析纤维化标记物和炎症细胞因子分析的mRNA表达。要开始细胞表面染色和分析，在15毫升的FACS缓冲液中重新填充50万至100万个分离的拉米纳丙烯细胞。用抗CD16的细胞孵育32个抗体，在冰上稀释1至50，10分钟。在此之后，用500微升的冰冷FACS缓冲液清洗细胞，以去除未绑定的抗体。表面染色结肠单细胞悬浮液，用荧光标记抗体在冰上稀释1至100分钟30分钟。每次洗涤时，使用 500 微升的冰冷 FACS 缓冲液清洗标记的细胞，以去除未绑定的抗体。然后按文本协议中概述的流动细胞图分析标记的单核细胞。要开始细胞因子染色和分析，请使用固定渗透溶液套件，根据制造商的说明固定和渗透表面染色的细胞。如文本协议中所述的切中层状丙体细胞，以检测IL-1β细胞因子的细胞内水平。接下来，通过添加 FACS 缓冲液和在 200 倍 G 和 4 摄氏度的离心 5 分钟来清洗细胞，以去除多余的固定缓冲液。重复一次此洗涤。要确定α平滑肌肉作用水平，首先用固定渗透溶液套件渗透细胞。用抗αSMA亚历克萨氟488抗体在冰上稀释1至1000分钟，孵育细胞。然后通过添加 FACS 缓冲液和在 200 倍 G 和 4 摄氏度的离心 5 分钟来清洗细胞，以去除多余的固定缓冲液。重复一次此洗涤。执行 FACS 分析并像文本协议中概述的单元格进行门控。本研究采用TNBS结肠炎小鼠模型来研究和阐明肠道纤维化的基本机制。经过六周的 TNBS 治疗后，可以看到，在 TNBS 治疗过程中，结肠长度逐渐缩短，从对照组的约 5 厘米缩短到 TNBS 组的约 3 厘米。为了确保 TNBS 克罗恩病模型与人类克罗恩的纤维化模型具有可比性，并且不是与该方法相关的伪影，在详细的时道研究中对纤维化标记进行了多个级别的分析。在大多数纤维化发生率中，都报告了α平滑肌活性蛋白阳性细胞和胶原蛋白沉积的积累，并被视为纤维化事件的标志为了比较TNBS纤维化与克罗恩的相关纤维化，在活体CD或缓解不足患者的新鲜组织活检中分析了纤维化标记物和细胞因子的表达。值得注意的是，标记诱导被看到的α平滑肌肉活性正层增厚和增加胶原蛋白沉积在活动CD部分。进行西印点分析，以确认在活性CD样本中诱导α平滑肌肉行为素表达。此外，通过qPCR分析检测纤维化标记物的显著诱导。然后评估M4活性的药理抑制剂拉帕霉素的作用，以确定限制TNBS纤维化的机制。小鼠同时接受TNBS和拉帕霉素治疗，并分析结肠组织学中α平滑肌肉作用素和胶原蛋白的水平。重要的是要记住，接种相同数量的TNBS到每只小鼠，并尽快处理分离的米纳丙烯细胞，以避免细胞损失，以及保持细胞活力。我们的协议详细介绍了TNBS纤维化和纤维化缓解，以及纤维化形成中拉帕霉素的抑制因子。其他研究人员可能有兴趣使用这种技术，以找到更好的药物靶点纤维化和结肠癌。请记住，TNBS 是一种皮肤刺激物，在处理过程中应穿实验室外套，以避免皮肤接触。

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