Name: mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin
Uploaded: 2019-09-12T14:45:00
Duration: 10 min 21 s
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Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01NS093045 (Y.H.), la subvention des NIH K08DK088950 (X.Z.), R03DK0956 (X.Z.), et la Crohn's and Colitis Foundation of America research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).

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Intérêts contradictoires : Les auteurs ne déclarent aucun intérêt opposé.

La cicatrisation ou la réparation des tissus est un processus biologique étroitement réglementé17. Pendant les dommages de tissu avec un état chimique, mécanique et d'infection, une réponse inflammatoire déclenche le processus de réparation de tissu. Cependant, une réponse inflammatoire dysrégulée et pathologique conduit à développer des cicatrices ou une réaction fibrotique, qui pourrait altérer la fonction de réparation des tissus9,18,19. Ici, nous montrons la procédure pour le modèle animal de fibrose TNBS-induit, qui partage de manière significative la pathophysiologie avec la maladie humaine de Crohn. L'inoculation successive de l'exposition chimique de TNBS pour endommager l'épithélium de souris cause des ulcérations profondes et induit le développement de la fibrose. Avec un fiable, à faible coût, et l'induction rapide de l'début de la maladie, cette méthode est largement acceptée par de multiples groupes de recherche impliqués dans des études pour les lésions tissulaires, l'inflammation transmurique et l'axe intestin-cerveau.
Pour mettre en œuvre avec succès le modèle de fibrose TNBS, il y a plusieurs étapes essentielles. Par exemple, une posologie adéquate et le moment de l'administration du TNBS sont très importants. Une inoculation de TNBS de 6-8 semaines permet l'ulcération profonde de tissu et est fortement recommandée pour des études fibrotiques chroniques. Les selles sortantes de souris et le réflexe rétrograde du TNBS inoculé sont deux problèmes majeurs, qui pourraient avoir comme conséquence la livraison des doses variables aux souris. La pression douce près du rectum de souris peut aider à libérer des selles avant l'administration de TNBS. Maintenir la tête de l'animal vers le bas pendant quelques secondes aide considérablement à arrêter le reflux inverse de TNBS. Garder les souris dans une cage, placer la cage sur un coussin chauffant et fournir aux souris du nectar de Napa pourraient également être des stratégies utiles pour prévenir une mortalité élevée.
Ici, nous discutons également de l'inflammation d'intestin pendant la fibrose de TNBS et de leur impact sur la réponse fibrotique. le rôle de mTOR/autophagie est largement impliqué sur l'homéostasie intestinale et dans la pathogénie d'IBD20,21. Nous avons identifié que la signalisation mTOR/autophagie est essentielle pour moduler les réponses pro-inflammatoires des cytokines IL-23 et IL1MD de Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires qui affectent l'axe pro-fibrotique IL-23/IL-22 (Figure 3A)9 . Par conséquent, la purification des cellules mononucléaires Cx3Cr1et Cx3Cr1 pour l'immunoprofiling et l'expression des gènes est une étape critique du modèle. Nous discutons en détail du protocole pour isoler lalame propria et fournissons la procédure de purification pour les cellules mononucléaires Cx3Cr1à l'aide de perles magnétiques.
Collectivement, malgré la présence de modèles génétiques et spontanés pour la maladie de Crohn, TNBS-colite reste un outil puissant pour étudier l'immuno-pathogénie de CD et a le potentiel d'évaluer les traitements de la fibrose de Crohn. La principale limitation de l'utilisation de modèles de fibrose induits chimiquement tels que le TNBS est la possibilité d'une grande variabilité d'un utilisateur à l'autre et la possibilité de valeurs aberrantes dans les données. Une taille d'échantillon de 5-8 animaux par groupe ainsi qu'une plus grande expérience utilisateur peuvent augmenter la cohérence du modèle. Cependant, la recherche d'un modèle génétique approprié causant la fibrose spontanée de Crohn est et sera toujours justifiée.

Dysregulation de l'homéostasie immunitaire dans l'intestin conduit à une inflammation pathogène et a été largement connu pour causer une maladie inflammatoire de l'intestin (IBD)1,2. La fibrose intestinale est une conséquence chronique des maladies inflammatoires de l'intestin (MII), comme la maladie de Crohn (CD)3. La pathophysiologie irréversible de CD inclut la restriction intestinale ou la sténose de la fibrose, qui limite des options de traitement, et sans médicaments actuellement disponibles, le seul traitement est chirurgie. En fin de compte, le développement de thérapies efficaces pour contrer l'inflammation inappropriée est très nécessaire pour étudier le mécanisme de La CD, et cela nous mènera un pas de plus vers cela.
Une variété de modèles génétiques de souris sont disponibles pour étudier IBD comprenant IL10 KO, SAMP/Yit et Le transfert de cellules élevées de CD45etRB adoptif dans des souris de SCID4,5,6. Ici, nous montrons la procédure pour la fibrose TNBS-négociée dans le modèle de souris de CD, qui est comparable à la pathologie de la fibrose humaine de Crohn. Le modèle induit par le TNBS présente certains avantages. Ce modèle est techniquement simple; l'onde de la maladie est rapide, peu coûteuse et pourrait être largement utilisée chez différents animaux (p. ex., souris, rat et cobaye7). La co-administration de l'éthanol et du TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) endommage brusquement la barrière intestinale et expose la protéine de tissu du côlon au TNBS et suscite des réponses immunologiques substantielles8,9. L'exposition répétée de TNBS mène à un processus de réparation surréactif répondant à l'inflammation et aux dommages, et développe une réaction fibrotique dans l'intestin. Ainsi, le modèle de fibrose TNBS-induit sert à être un modèle très convaincant pour étudier crohn's-associé fibrose intestinale.
En outre, les phagocytes mononucléaires sont les cellules primaires qui arbitrent la réponse immunitaire innée à la pathogénie et aux dommages dans l'intestin10,11,12,13. Pour élucider le mécanisme cellulaire et pour établir le rôle des phagocytesmononucléaires Cx3Cr1 dans le modèle de fibrose TNBS, nous montrons la procédure de purification des phagocytes mononucléaires. L'analyse descellules Cx3Cr1 est une étape essentielle afin d'évaluer les marqueurs inflammatoires et de déterminer le mécanisme concomitant de la fibrose intestinale. Collectivement, cette procédure détaillée pour la fibrose de TNBS sera utile pour expliquer les mécanismes cellulaires de la fibrose intestinale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>53-9760-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>149760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>101226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse purified CD16/32 Fc block</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>14-9760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-105-639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-isdn</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D263-5vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 40&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td><a href="http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software Inc</td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>HXMMHPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percol</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA/Ionomycin salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A25777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>LC LABORATORIES</td>
			<td>1003799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>92823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichorme staining kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>STOSTBPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black 2.1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue lite 2.3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin

Des études significatives ont été menées pour comprendre la gestion efficace de la fibrose intestinale. Cependant, le manque de meilleure connaissance de la fibrose a entravé le développement d'un médicament préventif. Principalement, trouver un modèle animal approprié est difficile en comprenant le mécanisme de crohn's-associé la pathologie intestinale de fibrose. Ici, nous avons adopté une méthode efficace où l'exposition chimique de TNBS aux rectums de souris produit l'ulcération sensiblement profonde et l'inflammation chronique, et les souris développent alors chroniquement la fibrose intestinale. En outre, nous décrivons une technique où une injection de rapamycine montre des effets inhibiteurs sur la fibrose TNBS-négociée dans le modèle de souris. Pour évaluer le mécanisme sous-jacent de la fibrose, nous discutons méthodiquement d'une procédure pour purifier les cellules Cx3Cr1MD à partir de la propria lamina des souris traitées et témoins de TNBS. Ce protocole détaillé sera utile aux chercheurs qui étudient le mécanisme de la fibrose et ouvrir la voie à la recherche d'une meilleure invention thérapeutique pour la fibrose intestinale associée à Crohn.

Nous avons adopté le modèle de souris de colite de TNBS pour étudier et élucider les mécanismes sous-jacents de la fibrose intestinale8. Ici, nous avons effectué une étude détaillée de la colite médiée par TNBS, où le TNBS a été administré de façon rectale chaque semaine à des souris de type sauvage pendant six semaines comme représenté schématiquement (Figure 1A). Après six semaines de traitement TNBS, nous avons remarqué que les longueurs du côlon raccourcissent progressivement au cours du traitement tNBS, d'une moyenne de 5 à 0,5 cm dans le groupe témoin à 3 à 0,5 cm dans le groupe TNBS; une telle analyse quantitative de la longueur du côlon représente une réduction très apparente de la longueur du côlon (figure 1B). Pour nous assurer que le modèle de la maladie de TNBS Crohn est comparable au modèle de fibrose de Crohn humain et n'était pas un artefact lié à la méthodologie, nous avons analysé les marqueurs fibrotiques à plusieurs niveaux dans une étude détaillée de cours de temps pour l'injection de TNBS au type sauvage . L'accumulation de l'actine musculaire alpha-lisse (SMA) des cellules positives et des dépôts de collagène dans les couches submucosales ont été signalés dans la plupart des incidences de fibrose et est considéré comme une marque pour les événements fibrotiques14. Nous avons constaté que les sections du côlon des souris tNBS-traitées qui ont été souillées avec 'SMA ont montré une augmentation de 4-6 fois de la couche de submucosa du côlon positivement tachée avec 'SMA (Figure 1C). En outre, la coloration bleue Trichrome pour ces sections a également montré une augmentation de 2-4 fois, suggérant le dépôt significatif de collagène, qui valide la fibrose intestinale grave (figure 1D). Nous avons en outre évalué l'activation des myofibroblastes en détectant les cellules positives de l'AMA par l'analyse FACS chez les souris du côlon traitées par TNBS et avons constaté une accumulation significative de taches positives à l'AMA (Figure 1E). De plus, nous avons constaté une induction importante dans l'expression de l'AMS, du Col-I et du Col-III mesurée par l'analyse qPCR chez les souris traitées au TNBS(figure 1F). L'expression accrue de la protéine SMA dans l'analyse de tache occidentale a indiqué la fibrose accrue (figure 1G). Dans l'ensemble, le traitement cinétique TNBS offre la possibilité d'accéder à la réponse immunitaire putative dans les conditions chroniques, qui imite étroitement la condition de phase chronique de CD et est essentielle au développement de fibrose.
Pour comparer la fibrose de TNBS avec la fibrose associée de Crohn, nous avons analysé l'expression des marqueurs de fibrose et des cytokines dans la biopsie fraîche de tissu de l'ileum des patients présentant le CD actif ou sous remise. Remarquablement, nous avons trouvé l'induction marquée de l'épaississement des couches sMA-positives et le dépôt accru de collagène tel que détecté par la coloration trichrome dans les sections actives de CD (figure 2A). Nous avons également effectué l'analyse de la tache occidentale et confirmé l'induction de l'expression de l'AMA dans des échantillons de CD actifs (figure 2B). De plus, nous avons observé une induction significative de marqueurs de fibrose, y compris l'AMA, Col1, tel que détecté par l'analyse qPCR(figure 2C).
Ensuite, pour déterminer un mécanisme pour limiter la fibrose TNBS nous avons évalué les effets de la rapamycine, un inhibiteur pharmacologique de l'activité mTOR15,16. En conséquence, nous avons traité des souris avec le TNBS et la rapamycine et analysé le niveau de SMA et de collagène dans l'histologie du côlon et avons montré la mesure quantitative de la SMA et du collagène dans l'intrigue de densitométrie (Figure 3A). Nos données suggèrent que la rapamycine réduit la coloration positive de l'AMA dans la couche submucosal et diminue le dépôt de collagène. Pour valider et quantifier davantage les réponses fibrotiques, nous avons déterminé les expressions de l'AMC, du collagène et du TGF par qPCR, et l'expression de la SMA par cytométrie de flux dans le côlon traité par TNBS(figure 3B, 3C). Nous avons également montré Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires induire une réponse immunitaire inflammatoire à la blessure9. Ainsi, nous voulions voir si l'administration de la rapamycine chez les souris traitées au TNBS pouvait inverser les effets inflammatoires et fibrotiques. Par conséquent, nous avons purifié Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires résidents à partir de suspensions de cellules individuelles du côlon en utilisant des microbilles magnétiques (Figure 3D). Nous avons constaté une augmentation du niveau de p-p70 et p-S6 dans Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires résidents par l'analyse de tache occidentale de souris tNBS-traitées, et ce niveau a été bloqué par la rapamycine (Figure 3E). En outre, nous avons constaté que le traitement de la rapamycine amortit l'IL-23 et l'IL-1 dans le groupe traité par TNBS (figure 3F). En outre, ces résultats élucident le mécanisme efficace impliqué dans l'induction de TNBS-fibrosis et ont prouvé que la rapamycine atténue l'induction de la fibrose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig1.jpg"> Figure 1 : Une administration réussie du TNBS entraîne le développement de la fibrose intestinale chez la souris. A. Représentation schématique de diagramme du traitement hebdomadaire de TNBS donné aux souris sauvages-type. B. Images du côlon et mesure des longueurs du côlon des souris traitées au TNBS, récoltées sur les semaines 0, 2, 4 et 6 traitements post-TNSB. C-D. L'analyse histologique des sections de colon souillée avec l'anticorps anti-SMA pour l'activation des myofibroblastes et de la coloration bleue trichrome pour le collagène ; barre d'échelle de 100 m. E. L'analyse FACS pour identifier les cellules sMA-positives dans le côlon et la quantification des cellules sMA-positives. F. Marqueurs fibrotiques et cytokines détectés par qPCR. G. analyse de tache occidentale de 'SMA du lysate de deux points des souris TNBS-traitées et témoins. Ce chiffre modifié est réutilisé avec la permission de la publication précédente9 dans Mucosal Immunology, 2019 par Mathur et al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig2.jpg"> Figure 2 : La fibrose tNBS est comparable à la fibrose intestinale associée à Crohn. R. Images représentatives des biopsies du côlon de contrôle, CD actif montrant une augmentation significative de la coloration bleu trichrome et de la coloration positive de l'AMA dans les couches submucosales, barre d'échelle de 50 m. B. Analyse de tache occidentale de l'expression et de la quantification de l'AMA. Analyse C. qPCR des marqueurs fibrotiques et des cytokines. Ce chiffre modifié est réutilisé avec la permission de la publication précédente9 dans Mucosal Immunology, 2019 par Mathur et al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig3.jpg"> Figure 3 : Le traitement de rapamycine améliore efficacement la fibrose TNBS-induite. A. Analyse histologique du côlon - images représentatives de la coloration myofibroblaste avec des taches d'anticorps anti-SMA et de collagène avec le bleu Trichrome, barre d'échelle de 100 m. Analyse B. qPCR de l'expression de l'AMM, du collagène et du TGF dans Control/ colons de souris traités par TNBS. C. FACS analyse de la SMA dans la suspension à cellule unique du côlon de souris traité avec le contrôle/TNBS. D. Schématique pour la purification des cellules Cx3Cr1de la fraction de propria de la lamina du côlon et de l'analyse FACS des cellules purifiées. E. Analyse de tache occidentale des niveaux de p-p70 et de p-S6 dans les phagocytes mononucléaires purifiés de Cx3Cr1MD des souris traitées avec TNBS et/ou rapamycine. F. qPCR analyse de l'expression dans les phagocytes mononucléaires cx3Cr1MD purifiés, qui produisent l'IL-23 et l'IL-1. Ce chiffre modifié est réutilisé avec la permission de la publication précédente9 dans Mucosal Immunology, 2019 par Mathur et al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig3large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Dans cette étude, nous décrivons une procédure détaillée de la fibrose intestinale TNBS-négociée, qui montre la pathophysiologie comparable à Crohn' fibrose de s. Nous discutons également cette approche à la lumière de la rapamycine a facilité des effets inhibiteurs sur la fibrose intestinale.

Aperçu mécaniste du développement de la fibrose intestinale médiée par tNBS et évaluation des effets inhibiteurs de la rapamycine

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

Ce protocole présente une pathophysiologie très comparable de la fibrose de Crohn chez l’homme et traite également des effets inhibiteurs de la rapamycine sur la fibrose intestinale. Le principal avantage de ce protocole est qu’il décrit le développement de la fibrose intestinale en très peu de temps variant de quatre à huit semaines, ce qui nous donne la possibilité d’étudier la réparation des tissus et la régénération des tissus. Ce protocole sera utile aux chercheurs qui sont pressés d’obtenir le mécanisme de la fibrose, et aider à trouver une meilleure technologie pour prédire l’intervention pour la fibrose intestinale associée de Crohn.Pour commencer cette procédure, raser des souris adultes autour de la région du cou afin de les pré-sensibiliser au TNBS par exposition cutanée. Puis tremper un écouvillon de coton avec TNBS et l’appliquer sur la zone rasée du cou de la souris. Huit jours après la sensibilisation, induire une colite par administration intrarectale une fois par semaine, pendant six semaines.Pour ce faire, appliquer quatre milligrammes de TNBS dans 25% d’éthanol à l’aide d’un lavement de 100 microlitres via une seringue d’un millilitre attachée à une aiguille de gavage en acier. Donnez aux souris témoins 100 microlitres de 25% d’éthanol seulement. Après anesthésier les souris, injecter intraperitoneally soit la rapamycine à deux milligrammes par kilogramme par jour, ou un véhicule, ou les deux, tous les jours de la semaine pendant trois à six semaines à la fois pour le contrôle et les souris traitées par TNBS.Après cela, utilisez des intestins de souris post-traités TNBS de six semaines pour analyser les analyses extracellulaires. Tout d’abord, ouvrez le côlon longitudicially dans le HBSS froid de glace et lavez le côlon dans HBSS. À l’aide de ciseaux stériles, couper le côlon en petits morceaux d’environ cinq centimètres de HBSS.Transférer les petits morceaux de tissu du côlon dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de tampon pré-digestion. Secouez le tube à 100 RPM dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, passez la suspension à travers une passoire à cellules de 40 micromètres, et jetez l’épithélium colonique attaché.Recueillir le tissu restant de la passoire et les digérer davantage dans le tampon de digestion contenant de la collagène de type IV et DNASE1 en 1X HBSS avec 5%FBS pendant 20 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius tout en secouant à 100 RPM. Après cela, vortex les tissus digérés pendant environ 20 secondes et le passer à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres pour obtenir des fractions propria lamina. Centrifugez les fractions de propria lamina à 700 fois G et quatre degrés Celsius pour pelleter les cellules.Ensuite, faire 100 millilitres de 30% et 70% de densité gradient solutions de médias. Resuspendez les cellules obtenues en 10 millilitres de la solution de 30% et superposez ceci au-dessus de cinq millilitres de la solution de 70% dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez le gradient dans un état de rupture libre à 1000 fois G et température ambiante.Recueillir la phase de l’anneau blanc contenant les lymphocytes propria lamina, qui sera entre les couches de gradient de 30% à 70%. Lavez les cellules obtenues en les réutilisant dans le HBSS glacé et en les centrifugant à 500 fois G et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis résuspendez les cellules dans le tampon FACS.Avant la coloration des anticorps, bloquez d’abord la surface cellulaire des cellules propria lamina en les incubant avec un bloqueur anti-souris CD16 par 32FC sur la glace pendant 15 minutes. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps anti-CX3CR1 PE avec des microbilles anti-PE sur la glace pendant 30 minutes pour capturer les cellules liées, puis laver les cellules avec tampon FACS. Passez les cellules liées aux anticorps et aux perles à travers une colonne magnétique de tri cellulaire activée dans un champ magnétique pour enlever les cellules non liées.Lavez les cellules trois fois avec le tampon FACS. Après cela, retirez la colonne du champ magnétique et poussez le piston dans la colonne pour donner les cellules liées aux perles. Tout d’abord, bloquer les cellules propria lamina avec anti-souris CD16 par bloqueur 32FC sur la glace.Filtrer les cellules en couveant avec des anticorps anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C et MHC de classe II Puis trier les cellules à l’aide d’un cytomètre d’écoulement FACS tel que décrit dans le protocole de texte. Lyse les cellules triées pour la préparation totale de l’ARN et de détecter la cytokine et les marqueurs fibrotiques. Analyser l’expression de l’ARNm des marqueurs fibrotiques et l’analyse inflammatoire de cytokine à partir de suspensions isolées à cellules simples de la purification magnétique.Pour commencer la coloration et l’analyse de la surface cellulaire, resuspendez entre 500 000 et 1 million de cellules de propria lamina isolées dans 15 millilitres de tampon FACS. Incuber les cellules avec des anti-CD16 par 32 anticorps à une dilution de 1 à 50 sur la glace pendant 10 minutes. Après cela, lavez les cellules avec 500 microlitres de tampon FACS froid de glace pour enlever les anticorps non liés.Les suspensions à cellule unique du côlon de surface avec des anticorps étiquetés fluorescents à une dilution de 1 à 100 sur la glace pendant 30 minutes. Lavez les cellules étiquetées deux fois pour enlever les anticorps non liés à l’aide de 500 microlitres de tampon FACS glacé pour chaque lavage. Ensuite, analyser les cellules mononucléaires étiquetées par cytomètre d’écoulement tel que décrit dans le protocole de texte.Pour commencer la coloration et l’analyse intracellulaires de cytokine, utilisez un kit de solution de permeabilization de fixation pour fixer et perméabilize les cellules souillées de surface selon les instructions du fabricant. Portez les cellules de propria de lamina comme décrit dans le protocole de texte pour détecter le niveau intracellulaire de cytokine bêta d’IL-1. Ensuite, lavez les cellules en ajoutant le tampon FACS et la centrifugeuse à 200 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer l’excès de tampon fixatif.Répétez ce lavage une fois. Pour déterminer le niveau alpha lisse d’actine de muscle, d’abord permeabilize cellules avec le kit de solution de permeabilization de fixation. Incuber les cellules avec des anticorps anti-alpha SMA Alexa Fluor 488 à une dilution de 1 à 1000 sur la glace pendant 30 minutes.Lavez ensuite les cellules en ajoutant un tampon FACS et une centrifugeuse à 200 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer l’excès de tampon fixatif. Répétez ce lavage une fois. Effectuez l’analyse FACS et portez les cellules comme décrit dans le protocole de texte.Dans cette étude, le modèle de souris colite TNBS est adopté pour étudier et élucider les mécanismes sous-jacents de la fibrose intestinale. Après six semaines de traitement de TNBS, on peut voir que la longueur du côlon s’est raccourcie progressivement au cours du traitement de TNBS d’environ cinq centimètres dans le groupe témoin à environ trois centimètres dans le groupe de TNBS. Pour s’assurer que le modèle de la maladie de TNBS Crohn est comparable au modèle humain de la fibrose de Crohn et n’est pas un artefact lié à la méthodologie, les marqueurs fibrotiques sont analysés à plusieurs niveaux dans une étude détaillée du cours du temps.L’accumulation des cellules positives alpha lisses d’actine de muscle et du dépôt de collagène dans les couches submucosal ont été rapportées dans la plupart des incidences de fibrose et est considérée comme marque pour des événements fibrotiques pour comparer la fibrose de TNBS avec Crohn' fibrose associée de s, l’expression des marqueurs de fibrose et des cytokines est analysée dans la biopsie de tissu frais de l’iléum des patients présentant le CD actif ou sous la remise. Remarquablement, l’induction marquée est vue de l’épaississement des couches positives alpha lisses d’actine de muscle et du dépôt accru de collagène dans les sections actives de CD. L’analyse occidentale de tache est exécutée pour confirmer l’induction de l’expression lisse d’actine de muscle alpha dans les échantillons actifs de CD.En outre, l’induction significative des marqueurs de fibrose est détectée par l’analyse de qPCR. Les effets de la rapamycine, un inhibiteur pharmacologique de l’activité M4 sont ensuite évalués pour déterminer un mécanisme pour limiter la fibrose TNBS. Les souris sont traitées avec le TNBS et la rapamycine et les niveaux d’actine musculaire alpha lisse et de collagène dans l’histologie du côlon sont analysés.Il est important de se rappeler d’inoculer la même quantité de TNBS à chaque souris et de traiter les cellules isolées de propria de lamina dès que possible pour éviter la perte de cellules aussi bien que pour maintenir la viabilité cellulaire. Nos détails de protocole sur la fibrose de TNBS et la remise de la fibrose aussi bien que le facteur inhibiteur de rapamycine dans la formation de fibrose. D’autres chercheurs pourraient être intéressés à utiliser cette technique pour trouver une meilleure cible médicament pour la fibrose et le cancer du côlon.S’il vous plaît rappelez-vous que TNBS est un irritant pour la peau et les manteaux de laboratoire doivent être portés pendant la manipulation pour éviter tout contact avec la peau.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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