Name: mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin
Uploaded: 2019-09-12T14:45:00
Duration: 10 min 21 s
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यह काम NIH अनुदान R01NS093045 (Y.H.), NIH अनुदान K08DK088950 (X.$), R03DK099566 (X.$), और क्रोहन और कोलिटिस फाउंडेशन ऑफ अमेरिका रिसर्च फैलोशिप (CCFA) 481637 (R.M.) द्वारा समर्थित किया गया था.

<ol>
	<li>Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis+and+inflammation+in+the+intestine.">Homeostasis and inflammation in the intestine.</a> Cell. 140, 859-870 (2010).</li><li>Park, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+regulatory+cells+maintain+intestinal+homeostasis+by+suppressing+gammadelta+T+cells.">T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells.</a> Immunity. 33, 791-803 (2010).</li><li>Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+intestinal+fibrosis.">Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).</li><li>Keubler, L. 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प्रतिस्पर्धी हितों: लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा.

घाव भरने या ऊतक की मरम्मत एक कसकर विनियमित जैविक प्रक्रिया17है . एक रासायनिक, यांत्रिक और संक्रमण की स्थिति के साथ ऊतक चोट के दौरान, एक सूजन प्रतिक्रिया ऊतक की मरम्मत की प्रक्रिया से चलाता है। हालांकि, एक disregulated और रोग भड़काऊ प्रतिक्रिया scarring या एक फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया विकसित करने के लिए होता है, जो ऊतक की मरम्मत समारोह9,18,19ख़राब कर सकता है . यहाँ, हम TNBS प्रेरित फाइब्रोसिस पशु मॉडल है, जो काफी मानव Crohn रोग के साथ pathophysiology शेयरों के लिए प्रक्रिया दिखा. माउस उपकला को नुकसान पहुंचाने के लिए टीएनबीएस रासायनिक जोखिम का क्रमिक टीका गहरे अल्सर का कारण बनता है और फाइब्रोसिस विकास को प्रेरित करता है। एक विश्वसनीय, कम लागत, और रोग शुरुआत के तेजी से प्रेरण के साथ, इस विधि व्यापक रूप से ऊतक चोट, transmural सूजन और आंत मस्तिष्क अक्ष के लिए अध्ययन में शामिल कई अनुसंधान समूहों द्वारा स्वीकार किया जाता है.
सफलतापूर्वक TNBS फाइब्रोसिस मॉडल को लागू करने के लिए, वहाँ कई आवश्यक कदम हैं. उदाहरण के लिए, पर्याप्त खुराक और TNBS प्रशासन के समय बहुत महत्वपूर्ण हैं. एक 6-8 सप्ताह TNBS टीका गहरी ऊतक अल्सर की अनुमति देता है और अत्यधिक पुरानी फाइब्रोटिक अध्ययन के लिए सिफारिश की है. चूहों से मल बाहर निकलने और टीका TNBS के प्रतिगामी पलटा दो प्रमुख समस्याएं हैं, जो चूहों को चर खुराक के वितरण में परिणाम हो सकता है. चूहों मलाशय के पास कोमल दबाव TNBS प्रशासन से पहले मल जारी करने में मदद कर सकते हैं. नाटकीय रूप से TNBS के रिवर्स भाटा को रोकने में मदद करता है कुछ सेकंड के लिए नीचे जानवर के सिर पकड़े. एक पिंजरे में चूहों रखते हुए, एक गर्मी पैड पर पिंजरे रखने, और नापा अमृत के साथ चूहों प्रदान भी उच्च मृत्यु दर को रोकने में उपयोगी रणनीति हो सकती है.
यहाँ, हम भी TNBS फाइब्रोसिस और फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया पर उनके प्रभाव के दौरान आंत सूजन पर चर्चा. आंतों के घर में और आईबीडी रोगजनन20,21में मोटे तौर पर जांच की गई है । हमने पहचान की है कि MTOR/autophagy संकेतन आईएल-23 से समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को मॉड्युलेट करने के लिए महत्वपूर्ण है और IL1 से IL1 ] cytokines Cx3Cr1से + मोनोन्यूक्लियर phagocytes कि समर्थक फाइब्रोटिक आईएल-23/IL-22 अक्ष को प्रभावित(चित्र 3ए)9 . इस प्रकार, इम्यूनोप्रोफाइलिंग और जीन अभिव्यक्ति के लिए एकल Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को शुद्ध करना मॉडल का एक महत्वपूर्ण कदम है। हम विस्तार से lamina propria अलग करने के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा और Cx3Cr1 के लिए शुद्धि प्रक्रिया प्रदान+ mononuclear कोशिकाओं चुंबकीय मोती का उपयोग कर.
सामूहिक रूप से, क्रोहन रोग के लिए आनुवंशिक और सहज मॉडल की उपस्थिति के बावजूद, TNBS-कोलाइटिस सीडी के इम्यूनो-रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बना हुआ है और क्रोहन फाइब्रोसिस उपचार का मूल्यांकन करने की क्षमता है। ऐसे TNBS के रूप में रासायनिक प्रेरित फाइब्रोसिस मॉडल का उपयोग करने की प्रमुख सीमा उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता से उच्च परिवर्तनशीलता का मौका है और डेटा में outliers की संभावना है. अधिक से अधिक उपयोगकर्ता अनुभव के साथ समूह प्रति 5-8 जानवरों का एक नमूना आकार मॉडल की स्थिरता बढ़ा सकते हैं. हालांकि, सहज Crohn फाइब्रोसिस के कारण एक उपयुक्त आनुवंशिक मॉडल खोजने है और हमेशा warranted किया जाएगा.

आंत में प्रतिरक्षा होरोस्टेसिस के रोगनियंत्रण से रोगजनक सूजन होती है और यह सूजन आंत्र रोग (आईबीडी)1,2केकारण व्यापक रूप से जाना जाता है। आंत्र फाइब्रोसिस सूजन आंत्र रोगों (आईबीडी) का एक पुराना परिणाम है, जैसे क्रोहन रोग (सीडी)3। सीडी के अपरिवर्तनीय pathophysiology आंत्र stricture या फाइब्रोसिस के एक प्रकार का रोग भी शामिल है, जो उपचार के विकल्प को सीमित करता है, और कोई दवा वर्तमान में उपलब्ध के साथ, केवल उपचार सर्जरी है. अंततः, अनुचित सूजन का मुकाबला करने के लिए प्रभावी उपचार के विकास के लिए बहुत सीडी के तंत्र का अध्ययन करने की जरूरत है, और यह हमें एक कदम है कि करीब का नेतृत्व करेंगे.
आईबीडी का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक माउस मॉडल उपलब्ध हैं जिनमें आईएल10 केओ, एसएएमपी/वाईट और दत्तक सीडी 45+एससीआईडी चूहों में आरबी उच्च कोशिका हस्तांतरण4,5,6शामिल हैं । यहाँ, हम सीडी के माउस मॉडल में TNBS मध्यस्थता फाइब्रोसिस के लिए प्रक्रिया है, जो मानव Crohn फाइब्रोसिस की विकृति के बराबर है दिखा. TNBS प्रेरित मॉडल कुछ फायदे हैं. इस मॉडल तकनीकी रूप से सरल है; रोग की शुरुआत तेजी से, सस्ती है, और व्यापक रूप से विभिन्न जानवरों में इस्तेमाल किया जा सकता है (उदा., माउस, चूहे और गिनी पिग7). इथेनॉल और टीएनबीएस (2,4,6-ट्रिनिट्रोबेन सल्फोनिक एसिड) का सह-प्रशासन अचानक आंतों के अवरोध को नुकसान पहुंचाता है और टीएनबीएस को कोलन टिशू प्रोटीन को उजागर करता है और पर्याप्त इम्यूनोलॉजिक प्रतिक्रियाएं8,9प्राप्त करता है। TNBS के बार-बार जोखिम सूजन और चोट का जवाब देने के लिए एक अति सक्रिय मरम्मत प्रक्रिया की ओर जाता है, और पेट में एक फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया विकसित करता है। इस प्रकार, TNBS प्रेरित फाइब्रोसिस मॉडल Crohn के संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस का अध्ययन करने के लिए एक बहुत सम्मोहक मॉडल होने के लिए कार्य करता है।
इसके अलावा , मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स प्राथमिक कोशिकाएं हैं जो पेट10,11,12,13में रोगजनन और चोट के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मध्यस्थता करती हैं . सेलुलर तंत्र को स्पष्ट करने के लिए और TNBS फाइब्रोसिस मॉडल में Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर phagocytes की भूमिका स्थापित करने के लिए, हम मोनोन्यूक्लियर phagocytes शुद्ध करने की प्रक्रिया दिखाते हैं। Cx3Cr1+ कोशिकाओं का विश्लेषण सूजन मार्करों का आकलन करने और आंतों फाइब्रोसिस के लिए सहवर्ती तंत्र निर्धारित करने के लिए एक आवश्यक कदम है। सामूहिक रूप से, TNBS फाइब्रोसिस के लिए यह विस्तृत प्रक्रिया आंतों फाइब्रोसिस के सेलुलर तंत्र की व्याख्या करने में सहायक होगी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>53-9760-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>149760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>101226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse purified CD16/32 Fc block</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>14-9760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-105-639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-isdn</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D263-5vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 40&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td><a href="http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software Inc</td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>HXMMHPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percol</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA/Ionomycin salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A25777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>LC LABORATORIES</td>
			<td>1003799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>92823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichorme staining kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>STOSTBPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black 2.1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue lite 2.3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin

आंतों की फाइब्रोसिस के प्रभावी प्रबंधन को समझने के लिए महत्वपूर्ण अध्ययन किए गए हैं। हालांकि, फाइब्रोसिस के बेहतर ज्ञान की कमी ने निवारक दवा के विकास में बाधा डाल दी है। मुख्य रूप से, एक उपयुक्त पशु मॉडल खोजने क्रोहन के संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस विकृति के तंत्र को समझने में चुनौतीपूर्ण है। यहाँ, हम एक प्रभावी तरीका अपनाया जहां चूहों मलाशय के लिए TNBS रासायनिक जोखिम काफी गहरी अल्सरेशन और पुरानी सूजन का उत्पादन, और चूहों तो लंबे समय से आंतों फाइब्रोसिस का विकास. इसके अलावा, हम एक तकनीक का वर्णन जहां एक rapamycin इंजेक्शन माउस मॉडल में TNBS-मध्यस्थ फाइब्रोसिस पर निरोधात्मक प्रभाव से पता चलता है. फाइब्रोसिस के अंतर्निहित तंत्र का आकलन करने के लिए, हम विधिपूर्वक TNBS उपचार और नियंत्रण चूहों की लेमिना प्रोपरिया से Cx3Cr1 + कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक प्रक्रिया पर चर्चा. यह विस्तृत प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए सहायक होगा जो फाइब्रोसिस के तंत्र की जांच कर रहे हैं और क्रोहन-संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस के लिए एक बेहतर चिकित्सीय आविष्कार खोजने का मार्ग प्रशस्त करते हैं।

हमने आंतों की फाइब्रोसिस8के अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने और उन्हें स्पष्ट करने के लिए टीएनबीएस कोलाइटिस माउस मॉडल को अपनाया . यहाँ, हमने टीएनबी-मध्यस्थ कोलाइटिस का एक विस्तृत समय-पाठ्यक्रम अध्ययन किया, जहां टीएनबीएस को योजनाबद्ध रूप से प्रतिनिधित्व के रूप में छह सप्ताह तक जंगली प्रकार के चूहों के लिए साप्ताहिक रूप से प्रशासित किया गया था (चित्र 1ए)। TNBS उपचार के छह सप्ताह के बाद, हमने देखा कि औपनिवेशिक लंबाई TNBS उपचार के दौरान उत्तरोत्तर छोटा, के एक औसत से 5 - 0.5 सेमी नियंत्रण समूह में 3 - 0.5 सेमी TNBS समूह में; बृहदान्त्र लंबाई का ऐसा मात्रात्मक विश्लेषण बृहदान्त्र लंबाई में बहुत स्पष्ट कमी का प्रतिनिधित्व करता है (चित्र 1ठ) यह सुनिश्चित करने के लिए कि TNBS Crohn रोग मॉडल मानव क्रोहन फाइब्रोसिस मॉडल के बराबर है और पद्धति से संबंधित एक कलाकृति नहीं थी, हमने जंगली प्रकार के लिए TNBS इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत समय पाठ्यक्रम अध्ययन में कई स्तरों पर फाइब्रोटिक मार्करों का विश्लेषण किया . अल्फा-स्मूथ मांसपेशी actin ($SMA) सकारात्मक कोशिकाओं और submucosal परतों के भीतर कोलेजन जमा का संचय फाइब्रोसिस घटनाओं के अधिकांश में सूचित किया गया है और फाइब्रोटिक घटनाओं के लिए एक पहचान के रूप में माना जाता है14. हमने पाया कि टीएनबीएस-उपचारित चूहों के बृहदान्त्र खंडों में जो जेडएसएमए के साथ दागे गए थे, ने कॉलोनिक सबम्यूकोसा परत में 4-6 गुना वृद्धि दिखाई जो $SMA (चित्र 1ब्) के साथ सकारात्मक रूप से दागित थी। इसके अलावा, इन वर्गों के लिए Trichrome नीले दाग भी एक 2-4 गुना वृद्धि दिखाई, महत्वपूर्ण कोलेजन बयान का सुझाव है, जो गंभीर आंतों फाइब्रोसिस पुष्टि (चित्र 1डी). हमने टीएनबीएस-उपचारित चूहों बृहदान्त्र में FACS विश्लेषण द्वारा $SMA-positive cells का पता लगाकर मायोफिब्रोब्लास्ट्स के सक्रियण का और मूल्यांकन किया और पाया कि $SMA-सकारात्मक धुंधला (चित्र 1ई)। इसके अलावा, हमने टीएनबीएस-उपचारित चूहों(चित्र 1च)में ुपीसीआर विश्लेषण द्वारा मापे गए एसएमए, कोल-I और कोल-III की अभिव्यक्ति में पर्याप्त प्रेरण पाया। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में $SMA प्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति से पता चला कि बढ़ी हुई फाइब्रोसिस (चित्र 1G) . कुल मिलाकर, TNBS गतिज उपचार पुरानी स्थितियों में putative प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है, जो बारीकी से सीडी पुरानी चरण हालत mimics और फाइब्रोसिस विकास के लिए आवश्यक है.
Crohn संबद्ध फाइब्रोसिस के साथ TNBS फाइब्रोसिस की तुलना करने के लिए, हम सक्रिय सीडी या छूट के तहत रोगियों के ileum से ताजा ऊतक बायोप्सी में फाइब्रोसिस मार्करों और साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। उल्लेखनीय है कि हमने सक्रिय सीडी खंडों में ट्राइक्रोम अभिरंजन द्वारा पाई गई संख्या के अनुसार$SMA-सकारात्मक परतों के गाढ़ा होने और बढ़ते कोलेजन निक्षेपकोन के तथा सक्रिय CD अनुभागों में त्रिवर्णी अभिरंजन द्वारा पाए गए प्रेरण को चिह्नित कियाहै। हमने पश्चिमी दाग विश्लेषण भी किया और सक्रिय सीडी नमूनों में $SMA अभिव्यक्ति को शामिल करने की पुष्टि की (चित्र 2ठ) . इसके अतिरिक्त, हमने फाइब्रोसिस मार्कर के महत्वपूर्ण प्रेरण का अवलोकन किया, जिसमें एसएमए, कोल1 शामिल हैं, जैसा कि ुपीसीआर विश्लेषण द्वारा पता लगाया गया है (चित्र 2ब्)।
इसके बाद, TNBS फाइब्रोसिस को सीमित करने के लिए एक तंत्र निर्धारित करने के लिए हमने rapamycin के प्रभाव का मूल्यांकन किया, mTOR गतिविधि के एक औषधीय अवरोधक15,16. तदनुसार, हमने चूहों के साथ टीएनबी और रैपामाइसिन दोनों का उपचार किया और बृहदान्त्र ऊतक विज्ञान में एसएमए और कोलेजन स्तर का विश्लेषण किया और डेन्सिटोमेट्री प्लॉट में एसएमए और कोलेजन की मात्रात्मक माप दिखाई है (चित्र 3ए)। हमारे डेटा से पता चलता है कि rapamycin submucosal परत में $SMA-सकारात्मक दाग कम कर देता है और कोलेजन जमा कम करता है. फाइब्रोटिक अनुक्रियाओं को और अधिक मान्य और परिमाणित करने के लिए, हमने यह निर्धारित किया है कि हमने ुपीसीआर द्वारा $SMA, कोलेजन और टीजीएफ- व्यंजकों को और TNBS-उपचारित बृहदान्त्रमेंप्रवाह साइटोमेट्री द्वारा $SMA व्यंजक ोंका ंह किया है । हम भी Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर phagocytes चोट9के लिए एक भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित दिखाया है. इस प्रकार, हम देखना चाहते थे कि क्या TNBS-उपचार चूहों में rapamycin का प्रशासन भड़काऊ और फाइब्रोटिक प्रभाव रिवर्स कर सकता है. अतः हम चुंबकीय सूक्ष्म-बीजों का उपयोग करके कोलनिक एकल कोशिका निलंबन से कक3ब्1़़ निवासी मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स को शुद्ध करते हैं । हमने पाया कि Cx3Cr1 में p-p70 और p-S6 का स्तरबढ़ गया है + निवासी मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स द्वारा पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा TNBS-उपचारित चूहों, और इस स्तर rapamycin द्वारा अवरुद्ध किया गया था ( चित्र3ई). इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि रैपामाइसिन उपचार टीएनबीएस-उपचारित समूह में आईएल-23 और आईएल-1 को कम कर देता है (चित्र 3च)। इसके अलावा, ये निष्कर्ष टीएनबीएस-फाइब्रोसिस के प्रेरण में शामिल प्रभावी तंत्र को स्पष्ट करते हैं और यह दिखाया गया है कि रैपामाइसिन फाइब्रोसिस के प्रेरण को कम करता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig1.jpg"> चित्रा 1: सफल TNBS प्रशासन चूहों में आंत्र फाइब्रोसिस के विकास की ओर जाता है. जंगलीप्रकार चूहों को दिया साप्ताहिक TNBS उपचार के एक Schematic आरेख प्रतिनिधित्व. बी बृहदान्त्र छवियों और TNBS से बृहदान्त्र लंबाई की माप का इलाज चूहों, सप्ताह पर काटा 0, 2, 4, और 6 के बाद TNSB उपचार. सी-डी. कोलेजन के लिए मायोफीब्रोब्लास्ट्स और ट्राइक्रोम ब्लू धुंधला के सक्रियण के लिए एंटी-एसएमए एंटीबॉडी के साथ सना हुआ बृहदान्त्र वर्गों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण; स्केल बार 100 डिग्री मी. एफएसीएस विश्लेषण बृहदान्त्र और $SMA-सकारात्मक कोशिकाओं के परिमाणीकरण में $SMA-सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। एफ Fibrotic मार्करों और cytokines QPCR द्वारा पता चला. TNBS के बृहदान्त्र lysate से $SMA के जी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इलाज किया और चूहों को नियंत्रित. इस संशोधित आंकड़े को पिछले प्रकाशन9 की अनुमति से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, 2019 में माथुर एट अल द्वारा पुन: उपयोग किया जा रहा है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig2.jpg"> चित्रा 2: TNBS फाइब्रोसिस क्रोहन-संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस के बराबर है। ए नियंत्रण के बृहदान्त्र बायोप्सी के प्रतिनिधि छवियों, सक्रिय सीडी trichrome नीले धुंधला की एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखा रहा है और submucosal परतों में $SMA सकारात्मक दाग, पैमाने बार 50 m. बी. $SMA अभिव्यक्ति और परिमाणीकरण के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. फाइब्रोटिक मार्कर और साइटोकिन्स का सी क्यूपीसीआर विश्लेषण। इस संशोधित आंकड़े को पिछले प्रकाशन9 की अनुमति से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, 2019 में माथुर एट अल द्वारा पुन: उपयोग किया जा रहा है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig3.jpg"> चित्रा 3: Rapamycin उपचार प्रभावी ढंग से TNBS प्रेरित फाइब्रोसिस सुधार. A. Colon हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण - एंटी-एसएमए एंटीबॉडी और ट्राइक्रोम ब्लू के साथ कोलेजन धुंधला के साथ मायोफिब्रोब्लास्ट के प्रतिनिधि छवियों, स्केल बार 100 [m. B. $SMA, कोलेजन और TGF] अभिव्यक्ति के नियंत्रण में TNBS इलाज माउस बृहदान्त्रs. C. नियंत्रण/TNBS के साथ इलाज माउस बृहदान्त्र से एकल सेल निलंबन में $SMA का FACS विश्लेषण. D. Cx3Cr1 की शुद्धि के लिए Schematic+ कोलोनिक lamina प्रोपरिया अंश और शुद्ध कोशिकाओं के FACS विश्लेषण से कोशिकाओं. ई. p-p70 और p-S6 स्तर शुद्ध Cx3Cr1 में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण + TNBS और / शुद्ध Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर phagocytes, जो आईएल-23 और आईएल-1 का उत्पादन में अभिव्यक्ति का F. PCR विश्लेषण। इस संशोधित आंकड़े को पिछले प्रकाशन9 की अनुमति से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, 2019 में माथुर एट अल द्वारा पुन: उपयोग किया जा रहा है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

इस अध्ययन में, हम TNBS मध्यस्थता आंत्र फाइब्रोसिस की एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन है, जो क्रोहन फाइब्रोसिस के लिए तुलनीय pathophysiology दर्शाती है. हम भी rapamycin के प्रकाश में इस दृष्टिकोण पर चर्चा आंतों फाइब्रोसिस पर निरोधात्मक प्रभाव में मदद की.

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