Name: mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin
Uploaded: 2019-09-12T14:45:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin at JoVE.com

この研究は、NIH助成金R01NS093045(Y.H.)、NIH助成金K08DK088950(X.Z.)、R03DK099566(X.Z.)、クローン・アンド・コリチス財団・アメリカ研究フェローシップ(CCFA)481637(R.M.)によって支援されました。

この原稿では、すべてのヒトサンプルは、研究所レビュー委員会(IRB)およびアルバニー医科大学の人間研究委員会によって承認されたプロトコルに従って調達されました。動物に関するすべての研究は、アルバニー医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会と、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドによって承認されたプロトコルに従って厳密に行われました。.
1. ヒト腸標本の採取
<ol><li>機関の研究委員会のプロトコルに従ってヒト組織サンプルを収集します。</li>
	<li>線維症と診断されたCD患者の腸組織(イレオコロニック)を調達し、IBDの既往歴のない患者からサンプルをコントロールする。</li>
	<li>免疫組織学のための腸組織の一部、mRNAを分析するための組織の別の部分、および線維性およびサイトカイン遺伝子/マーカーのタンパク質発現のための最終部分を使用します。</li>
	<li>免疫組織学分析では、まず少なくとも48時間の4%パラホルムアルデヒドでヒト組織サンプルを固定し、少なくとも16時間70%エタノールを含むチューブに移します。組織マイクロトームを使用してセクション。</li>
	<li>ブラシを使用して、染色用のガラススライド上の各カットセクションを静かに広げます。</li>
	<li>コラーゲン沈着を検出するためにトリクロム染色を用いた染色組織セクションスライド、およびαSMA染色で筋線維芽細胞を検出する(トリクロムおよびαSMA染色に関する詳細については、セクション3を参照)。光顕微鏡で染色された部分を調べます。</li>
	<li>得られたヒト組織サンプルの別の部分を処理して、タンパク質をライサートして、ウェスタンブロットを介してαSMAを検出します(ウェスタンブロット分析の詳細については、セクション7を参照してください)。</li>
	<li>抽出試薬(材料の表)を使用してヒト組織サンプルの最終部分からRNAを取得し、RT-PCRを介してcRNAをcDNAに変換します。</li>
	<li>qPCRによって線維性およびサイトカイン遺伝子を分析する(mRNA製剤の詳細についてはセクション6を参照)。</li>
</ol>2. マウスにおけるTNBS線維症およびラパマイシン治療の誘導
<ol><li>機関によって承認された動物研究プロトコルに従って動物研究を行う。</li>
	<li>真皮暴露を介してTNBSに事前感光するために首の周りに成体マウスを剃る。綿棒にTNBSを浸し、マウスの首の剃毛領域にTNBSを適用します。 注:プレ感光は、TNBS媒介性炎症を開始するために遅延過敏応答を改善するので、非常に重要なステップです。</li>
	<li>8日目の感化後、直腸内投与により大腸炎を6週間にわたり6週間誘導する。3.5フランスのポリウレタンカテーテルに取り付けられた1mLシリンジを介して100 μL浣腸を用いて4mgのTNBS(25%エタノール)を塗布し、25%エタノールのみの対照マウスに100μLを与える。<ol>
<li>ペントバルビタール(25mg/kgの精米腔内)でマウスを麻酔するか、TNBS投与中に酸素の1 L/minと共に2.5%のイソフルランにさらします。つま先をそっとつまみ、反射がないか探して麻酔を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスが麻酔下にある間、乾燥を防ぐために目に獣医の歯を使用してください。</li>
	<li>ラパマイシンを2mg/kg/日または車両(5%Tween-20および4%エタノール)で平日3〜6週間、経皮内、コントロールおよびTNBS処理マウスの両方に注入する。</li>
	<li>組織学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティングおよびRNA抽出を含む細胞外アッセイを分析するために6週間のTNBS後処理マウス腸を使用してください。臓器を収穫するには、CO2吸入を用いてマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼で安楽死を確認する。<ol>
<li>臓器を収穫するには、CO2吸入を用いてマウスを安楽死させ、子宮頸部脱臼で安楽死を確認する。安楽死後、外科グレードのはさみと鉗子を使用して、その腹部側のマウスを縦方向に開きます。直腸から末端イリウム領域に結腸全体を取り除きます。コロンを氷冷1x HBSSに素早く移し、同じバッファーを使用してコロンを洗浄します。</li>
		<li>対照およびTNBS処理マウスの結腸長を測定および比較する。細胞死を避けるために、コロンから乾燥を避けるために、できるだけ速くこの手順を行います。</li>
		<li>コロンを小片に切り、将来の目的のために-80 °Cに保ちます(RNA/ウェスタンブロット分析)。FACS 分析には、コロンの別の部分を使用します。</li>
		<li>コントロールとTNBS処理動物の両方の結腸の類似した領域から大腸組織サンプルを切断し、収集してください。 注:TNBS接種では10%~20%の死亡率が期待されますが、経験を積んで死亡率を大幅に低下させることができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 腸線維症の免疫組織病理学的評価
<ol><li>ヒトおよび/またはマウスの組織を4%パラホルムアルデヒドで48時間固定し、16時間70%エタノールに移します。 注:パラホルムアルデヒドは神経毒性の化学物質ですので、吸入を避ける;フェイスマスクを使用する場合。</li>
	<li>パラフィンは、固定大腸組織を埋め込み、5 μmの厚さにスライスし、組織学のためのガラススライドに直接組織を置きます。</li>
	<li>コラーゲンを検出するメーカーの指示に従ってH&Eとトリクロムブルーの染色を行います。<ol>
<li>簡単に言えば、最初に各チャンバーで5分間キシレンの2つのチャンバーにセクションを含むスライドを水没させて断面を脱パラフィン化する。</li>
		<li>100%アルコールでスライドを1分間すすいで下す。この手順を 3 回繰り返します。水道水でもう一度1分間すすいでください。</li>
		<li>その後、56°Cで予熱されたBouinの溶液に60分間スライドを浸す. ブインの溶液は外観が黄色です。Bouinの溶液からスライドを水道水で3分間、またはスライドが無色になるまで洗います。</li>
		<li>変更されたメイヤーのヘマトキシリン溶液に7分間、室温でスライドを浸します。</li>
		<li>5-8分間トリクロム染色に浸漬することにより、スライディングスライドを5〜10sの流水ですすいで、余分なトリクロム汚れを除去します。</li>
		<li>100%アルコールでスライドを1分間脱水し、この手順を3回繰り返します。</li>
		<li>1分間キシレンでスライドをクリアし、ステップ3xを繰り返します。</li>
		<li>取り付けメディア付きスライド(材料のテーブル)を取り付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>鉗子で一方の端にカバースリップを慎重に保持し、気泡を持たずにセクション全体をカバーします。いくつかの気泡がある場合は、カバースリップをタップしてすぐに気泡を削除します。</li>
	<li>免疫染色を使用してαSMAを検出します。<ol>
<li>ブロックバッファー内の大腸切片(0.2%トリトンX-100および5%正常なヤギ血清1x PBS)を室温で1時間ブロックする。</li>
		<li>スライド溶液上のαSMA(材料表)用希釈一次抗体の100μLを100μLでインキュベートし(1x PBSで0.2%トリトンX-100および3%正常ヤギ血清、抗αSMA 1:200)を一晩4°Cでインキュベートする。</li>
		<li>1x PBSでセクションを3回洗います。</li>
		<li>ヤギの抗マウスIgG(H +L)をAlexa Fluor 488(材料の表)と共役に使用し、室温で2時間の二次抗体として使用します。</li>
		<li>1x PBSでセクションを3回洗います。</li>
		<li>DAPI を使用して、5 分間核を反染します。</li>
		<li>1x PBSでセクションを3回洗います。</li>
		<li>蛍光取り付け媒体(材料の表)が付いているスライドを取付け、マニキュアを使用してカバースリップとシールする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LSM 880共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、顕微鏡ソフトウェアを用いて画像を処理します。</li>
	<li>ImageJ と同じセクションで複数の選択した領域の平均を取り込んで画像を定量化します。</li>
</ol>4. 腸内線体プロプリの分離とCx3Cr1+単核性ファゴサイトの精製
<ol><li>氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS;材料の表)同じバッファーでコロンを洗浄します。</li>
	<li>HBSSの無菌はさみを使用して、約5cmの小さな大腸組織を切ります。</li>
	<li>消化前バッファーの10 mLを含む50 mL円錐管に小さな大腸組織片を移管し(5%FBS、5mM EDTAおよび1 mM DTTTを有する1x HBSS)、および37°Cインキュベーター11で100rpmで20分間振る。 注:100rpmの揺れ条件で37°Cの大腸組織のインキュベーションは、効率的なコラゲナーゼ組織の消化と生存細胞の高収率を可能にします。</li>
	<li>40 μmの細胞ストレーナーを通過することにより、切り離された大腸上皮を破棄します。</li>
	<li>ストレーナーから残りの組織を回収し、100rpmで37°Cで20分間5%FBSで1x HBSSでコラーゲナーゼタイプIVおよびDNase I(材料の表)を含む消化バッファーでそれらをさらに消化します。</li>
	<li>約20秒の消化組織を渦にし、40μmの細胞ストレーナーを通過して、ラミナプロプリリア画分を得る。</li>
	<li>4°Cで700 x gで細胞をペレットにするラミナプロプリリア画を遠心分離</li>
	<li>ラミナプロプリアから死んだ細胞を除外するには、密度勾配(材料の表)を使用します。 注:ここで使用される密度勾配媒体(材料の表)は、単核細胞の損失を引き起こす可能性があります。しかし、それは全体的に純度を増加させる調製物から死んだ細胞を大幅に除去します。<ol>
<li>30% および 70% の密度グラデーション メディア ソリューションをそれぞれ 100 mL にします。得られた細胞を30%溶液の10mLで再懸濁し、15mLチューブで70%溶液の5mLの上にオーバーレイする。</li>
		<li>ブレーキのない状態で勾配を 1,000 x gと室温で遠心分離します。30%と70%の勾配層の間になるラミナプロプリアリンパ球を含む白色リング相を収集します。</li>
	</ol></li>
	<li>得られた細胞を500xg、20°C、FACS(蛍光活性化細胞選別)バッファー(PBS、pH 7.4、1%BSAおよび2mM EDTA)で10分間再中断して、氷冷HBSSおよび遠心分離機で再中断して洗浄する。 </li>
	<li>磁気ビーズやFACS選別を用いて、採取した細胞精製から単核性ファゴサイトを精製します。<ol>
<li>磁気精製<ol>
<li>抗体による染色に先立ち、氷上で15分間抗マウスCD16/CD32 Fc遮断薬でインキュベートすることにより、ラミナプロプリア細胞の細胞表面をブロックする。</li>
			<li>抗Cx3Cr1-PE(フィコエリスリン)抗体と抗PEマイクロビーズ(材料表)を氷上で30分間インキュベートし、結合細胞を捕捉する。FACSバッファでセルを洗浄します。</li>
			<li>磁場内の磁気活性化細胞選別カラムを通して抗体/ビーズ結合細胞を通過させ、結合のない細胞を除去します。FACSバッファで3回洗浄します。磁場からカラムを取り外し、カラム内のプランジャーを押してビーズ結合セルを生成します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>FACS の並べ替え 注:FACSの選別は磁気精製の代わりに使用することができる。磁気精製は簡単で費用対効果の高い方法ですが、細胞の亜集団ではなく、単一の細胞を精製することに限定されます。したがって、細胞の亜集団を単離するために、FACSソート法は、単一細胞ならびに細胞の亜集団をソートする効果的な方法である。<ol>
<li>抗マウスCD16/CD32 Fcブロッカー(材料表)でラミナプロプリア細胞をブロックします。</li>
			<li>抗CD64、CD11c、CD11b、Cx3Cr1、Ly6C、およびMHCII抗体をインキュベートして細胞を染色する。</li>
			<li>FACSフローサイトメーターを使用してソートし、CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- CX3Cr1(P3 + P4)母集団を精製するセル。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>溶解細胞を全RNA調製し、サイトカインおよび線維マーカーを検出する(RNAおよびcDNA調製についてはセクション6を参照)。</li>
	<li>磁気精製から単一細胞懸濁液から線維マーカーおよび炎症性サイトカイン分析のmRNA発現を分析する。</li>
	<li>FACS分析では、表面または細胞内マーカーに対する抗体で染色する前に、抗マウスCD16/CD32 Fc遮断薬(材料表)で細胞をブロックします。</li>
</ol>5. フローサイトメトリー分析
<ol><li>細胞表面染色と分析<ol>
<li>5-10×105 FACSバッファーの50mLで単離されたラミナプロプリア細胞を再中断する(1%BSA、PBSで2mM EDTA、pH 7.4)。</li>
		<li>抗マウスCD16/CD32(材料表)で細胞を1:50希釈して、氷上のFc受容体を10分間遮断します。</li>
		<li>500 μLの氷冷FACSバッファーで細胞を洗浄し、細胞表面染色の前に非結合抗CD16/CD32を除去します。</li>
		<li>表面染色大腸単細胞懸濁液(106細胞/50mL)を蛍光標識抗体で1:100希釈した氷上で30分間希釈し、コロニー性ラミナプロプリアを評価した。</li>
		<li>500 μLの氷冷FACSバッファーで標識された細胞を2回洗浄し、結合されていない抗体を除去します。</li>
		<li>フローサイトメトリーにより標識された単核細胞を分析します。ライブ用ゲート、FSC+SSC+その後に CD11b+ Cx3Cr1+が続き、MHCII、CD80、CD86、CD40 を含む他のマクロファージアクティベーション マーカーを分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞内サイトカイン染色と分析<ol>
<li>細胞内サイトカイン染色の場合は、固定/透過化ソリューションキット(材料の表)を使用して表面染色細胞を固定し、透過化します。詳細な手順については、製造元の指示に従ってください。</li>
		<li>ライブのためのゲートラミナプロプリア細胞、その後、FSC+SSC+続いてCD11b+ Cx3Cr1+IL23 + IL23+ IL11b+ Cx3Cr1+IL1β+IL1βサイトカインの細胞内レベルを検出する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>αSMA染色と分析<ol>
<li>200 x gと4 °Cで5分間遠心分離してFACSバッファーで細胞を2回洗浄し、余分な固定バッファーを除去します。</li>
		<li>αSMAレベルを決定するには、固定/透過化ソリューションキット(材料の表)で細胞を透過します。</li>
		<li>抗αSMA-AF488抗体(材料表)を用いて細胞を30分間氷上で1:1,000希釈してインキュベートします。</li>
		<li>細胞を2回洗浄し、FACS分析を行います。ライブ用ゲート、FSC+SSC+に続いて、結腸細胞におけるαSMA+細胞の検出が続く。 </li>
	</ol>
</li>
</ol>6. RNA絶縁、RT-PCR、リアルタイムPCR
<ol><li>抽出試薬(材料の表)でそれらを均質化することにより、MACSまたはFACS精製細胞または大腸切除組織からRNAを分離する。 注:肺および皮膚刺激性であるこの試薬を使用する場合は、安全ゴーグルおよびその他のラボ保護具を使用してください。フードの中で安全に作業してください。</li>
	<li>イソプロパノールでRNAを沈殿させる前に、20 μg/mLグリコーゲンストック溶液(材料表)からRNaseフリーグリコーゲンの0.5 μLを添加します。</li>
	<li>RNAペレットを50μLのRNase自由水(材料表)で再濁し、55°Cで5分間インキュベートし、RNA口蓋を完全に溶解させます。</li>
	<li>260 nmの分光光度計を使用してRNA濃度を読み取ります。</li>
	<li>総RNAの1μgと逆転転写合成キット(材料の表)を用いてcDNAを合成する。</li>
	<li>2μLのcDNAをリアルタイムPCRを用いて遺伝子発現を解析する。96ウェルPCRプレートqPCRマスターミックスキット(材料の表)を使用してください。CT 値を使用して、GAPDH/HPRT 値を正規化した後の RNA の倍率変化を計算します。</li>
</ol>7. 西洋ブロッティング
<ol><li>RIPAリシスバッファー(1%NP40)を用いて大腸組織をライスする。</li>
	<li>8%のビストリスゲルでタンパク質リサートを80Vの一定電圧で解決します。</li>
	<li>ゲルタンパク質をニトロセルロース膜に移し、4°Cで2時間50mAの定電流で走るコールドトランスファーバッファーに移す。</li>
	<li>TBST(25 mMトリス-HCl、pH 7.4、1.5 M NaCl、0.05%トゥエン-20)を室温で少なくとも1時間の間、5%の非脂肪乳を使用してタンパク質転移膜上の非特異的領域をブロックします。</li>
	<li>αSMAレベルを検出するには、一晩4°CでαSMA一次検出抗体を用いて膜をインキュベートする。</li>
	<li>15分間隔でTBSTを使用して膜を3〜4回洗浄する。</li>
	<li>TBSTの5%非脂肪乳でHRP結合二次抗体(1:10,000)でインキュベートします。</li>
	<li>ECL開発キットを用いて膜を開発する。</li>
	<li>密度分析の負荷制御としてGAPDHを用いるタンパク質信号強度を正規化する。</li>
</ol>8. 統計分析
<ol><li>野生の種類とKO動物を比較して、選択したデータ解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。</li>
	<li>P 値 <0.05 を有意なものと考えてください (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)。</li>
	<li>学生のt検定を使用して、2つのグループと分散分析の違いをテストし、2つ以上のグループ間の分析を行います。</li>
</ol>

<ol>
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競合する利益: 著者は競合する利益を宣言しません。

創傷治癒または組織修復は、厳密に調整された生物学的プロセス17である。化学的、機械的および感染状態を伴う組織損傷の間、炎症反応は組織修復プロセスを引き起こす。しかし、調節不頚および病理学的炎症反応は瘢痕化または線維性反応を発症させ、組織修復機能9、18、19を損なう可能性がある。ここでは、ヒトクローン病と病態生理学を有意に共有するTNBS誘発線維症動物モデルの手順を示す。マウス上皮を損傷するTNBS化学暴露の連続接種は、深い潰瘍を引き起こし、線維症の発症を誘発する。信頼性が高く、低コストで、疾患発症の迅速な誘導により、この方法は、組織損傷、経壁の炎症および腸脳軸の研究に関与する複数の研究グループによって広く受け入れられている。
TNBS線維化モデルを正常に実装するには、いくつかの重要な手順があります。例えば、TNBS投与の適切な投与量およびタイミングは非常に重要である。6-8週間のTNBS接種は深部組織潰瘍を可能にし、慢性線維性研究のために強く推奨される。マウスからの出てくる便と接種されたTNBSの逆行反射は2つの主要な問題であり、これはマウスに可変用量の送達をもたらす可能性がある。マウス直腸付近の穏やかな圧力は、TNBS投与前に便を放出するのに役立つ可能性がある。動物の頭部を数秒間押し下げ、TNBSの逆逆逆流を止めるのに役立ちます。マウスをケージに入れ、ケージをヒートパッドに置き、ナパ蜜をマウスに与えることも、高い死亡率を防ぐのに役立つ戦略となり得る。
ここでは、TNBS線維症中の腸の炎症と線維性応答への影響についても議論する。mTOR/オートファジーの役割は、腸恒常性およびIBD病因20,21に広く関与している。我々は、MTOR/オートファジーシグナル伝達が、Cx3Cr1+単核性ファゴサイトからのIL-23およびIL1βサイトカインからのプロ炎症反応を調節するために重要であることを同定した。.それにより、免疫プロファイリングおよび遺伝子発現のための単一のCx3Cr1+単核細胞を精製することは、モデルの重要なステップである。我々は、ラミナプロプリアを単化するためのプロトコルを詳細に議論し、磁気ビーズを用いたCx3Cr1+単核細胞の精製手順を提供する。
まとめると、クローン病の遺伝的および自発的モデルの存在にもかかわらず、TNBS-大腸炎はCDの免疫病因を研究するための強力なツールであり、クローンの線維症治療を評価する可能性を有する。TNBSのような化学的に誘導された線維化モデルを使用する主な制限は、ユーザー間の変動性が高く、データの外れ値が生じ得る可能性です。より大きいユーザーエクスペリエンスと共にグループごとの5-8動物のサンプルサイズはモデルの一貫性を高めることができる。しかし、自発的なクローン線維症を引き起こす適切な遺伝モデルを見つけることは、常に保証されます。

腸内の免疫恒常性の調節不調は病原性炎症を引き起こし、炎症性腸疾患(IBD)1、2を引き起こすことが広く知られている。腸線維症は、クローン病(CD)3などの炎症性腸疾患(IBD)の慢性的な結果である。CDの不可逆的な病態生理学には、治療選択肢を制限する線維症の腸の狭窄または狭窄が含まれており、現在利用可能な薬はなく、唯一の治療は手術である。最終的には、不適切な炎症に対抗する効果的な治療法の開発がCDのメカニズムを研究するために必要であり、これに一歩近づくでしょう。
様々な遺伝子マウスモデルは、IL10 KO、SAMP/Yitおよび採用CD45+RB高細胞移植を含むIBDを研究するために利用可能である4,5,6.ここでは、ヒトクローン線維症の病理に匹敵するCDのマウスモデルにおけるTNBS媒介線維症の手順を示す。TNBS誘発モデルには一定の利点があります。このモデルは技術的に単純です。疾患発症は迅速で安価であり、異なる動物(例えば、マウス、ラットおよびモルモット7)で広く使用することができる。エタノールとTNBS(2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸)の共投与は、腸関門を突然損傷し、大腸組織タンパク質をTNBSに暴露し、実質的な免疫応答8,9を引き出す。TNBSの繰り返し暴露は、炎症や損傷に反応する過反応性の修復プロセスにつながり、腸内の線維性反応を発症する。したがって、TNBS誘発線維症モデルは、クローン関連腸線維症を研究する非常に説得力のあるモデルとなる。
さらに、単核食細胞は、腸内の病因および損傷に対する自然免疫応答を仲裁する一次細胞である10,11,12,13である。細胞機構を解明し、TNBS線維化モデルにおけるCx3Cr1+単核ファゴサイトの役割を確立するために、単核性ファゴサイトを精製する手順を示す。Cx3Cr1+細胞の分析は、炎症マーカーを評価し、腸線維症の併用メカニズムを決定するために不可欠なステップです。まとめて、TNBS線維症のこの詳細な手順は、腸線維症の細胞機構を説明するのに役立ちます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>53-9760-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>149760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>101226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse purified CD16/32 Fc block</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>14-9760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-105-639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-isdn</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D263-5vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 40&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td><a href="http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software Inc</td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>HXMMHPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percol</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA/Ionomycin salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A25777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>LC LABORATORIES</td>
			<td>1003799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>92823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichorme staining kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>STOSTBPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black 2.1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue lite 2.3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin

腸線維症の効果的な管理を理解するために重要な研究が行われています。.しかし、線維症のより良い知識の欠如は、予防薬の開発を妨げている。主に、適切な動物モデルを見つけることは、クローンの関連する腸線維症病理のメカニズムを理解する上で困難である。ここでは、TNBS化学的にマウス直腸への曝露が実質的に深い潰瘍や慢性炎症を引き起こし、マウスが腸線維症を慢性的に発症する有効な方法を採用した。また、ラパマイシン注射がマウスモデルにおけるTNBS媒介線維症に対する阻害効果を示す技術についても述べる。線維化の根本的なメカニズムを評価するために、TNBS処理および制御マウスのラミナプロプリアからCx3Cr1+細胞を精製する手順を系統的に議論する。この詳細なプロトコルは、線維化のメカニズムを研究している研究者に役立ち、クローン関連腸線維症のためのより良い治療発明を見つけるために道を開きます。

腸管線維症の基礎となるメカニズムを研究し解明するために、TNBS大腸炎マウスモデルを採用した。ここでは、TNBS媒介性大腸炎の詳細な時間コース研究を行い、TNBSを週次的に野生型マウスに対して概略的に表すように最大6週間管理した(図1A)。TNBS治療の6週間後、我々は、TNBS処理の過程で、結腸の長さがTNBS群の平均5±0.5cmからTNBS群の3±0.5cmに徐々に短くなることに気づいた。このようなコロン長の定量分析は、結腸長の非常に明らかな減少を表す(図1B)。TNBSクローン病モデルがヒトクローン線維化モデルに匹敵し、方法論に関連する人工物ではないことを確認するために、野生型へのTNBS注射のための詳細な時間コース研究において、複数のレベルで線維性マーカーを分析した。.粘膜下層内のα平滑筋アクチン(αSMA)陽性細胞およびコラーゲン沈着の蓄積は、線維化発生率のほとんどにおいて報告されており、線維性事象14の特徴とみなされている。αSMAで染色したTNBS処理マウスの結腸切片は、αSMAで陽性染色された大腸粘膜層の4〜6倍の増加を示した(図1C)。また、これらのセクションのトリクロムブルー染色はまた、2〜4倍の増加を示し、重度の腸線維症を検証する有意なコラーゲン沈着を示唆した(図1D)。さらに、TNBS処理マウス結腸におけるFACS分析によりαSMA陽性細胞を検出することにより筋線維芽細胞の活性化を評価し、αSMA陽性染色の有意な蓄積を見出した(図1E)。さらに、TNBS処理マウスにおけるqPCR分析により測定されたαSMA、Col-I、およびCol-IIIの発現において実質的な誘導を見出した(図1F)。ウェスタンブロット解析におけるαSMAタンパク質の発現の増加は、線維化の増加を明らかにした(図1G)。全体的に、TNBS運動学治療は、CD慢性相状態を密接に模倣し、線維化の発症に不可欠である慢性状態における推定免疫応答にアクセスする機会を提供する。
TNBS線維症とクローン関連線維症を比較するために、活性CDまたは寛解下の患者の回腸から新鮮な組織生検における線維化マーカーおよびサイトカインの発現を分析した。顕著に、αSMA陽性層の増粘の顕著な誘導と活性CD切片におけるトリクロム染色によって検出されたコラーゲン沈着の増加が見られた(図2A)。また、ウェスタンブロット解析を行い、活性CD試料におけるαSMA発現の誘導を確認した(図2B)。また、qPCR分析により検出されたαSMA、Col1を含む線維化マーカーの有意誘導を観察した(図2C)。
次に、TNBS線維症を制限するメカニズムを決定するために、mTOR活性15,16の薬理学的阻害剤であるラパマイシンの効果を評価した。そこで、TNBSとラパマイシンの両方でマウスを処理し、結腸内視図におけるαSMAおよびコラーゲンレベルを分析し、密度測定プロットにおけるαSMAおよびコラーゲンの定量測定を示した(図3A)。我々のデータは、ラパマイシンが粘膜下層におけるαSMA陽性染色を減少させ、コラーゲン沈着を減少させることを示唆している。線維性応答をさらに検証・定量化するために、qPCRによるαSMA、コラーゲンおよびTGFβ式、およびTNBS処理結腸におけるフローサイトメトリーによるαSMA発現(図3B,3C)を決定した。我々はまた、Cx3Cr1+単核性のファゴサイトが傷害9に対する炎症性免疫応答を誘発することを示した。したがって、TNBS処理マウスにおけるラパマイシンの投与が炎症および線維効果を逆転させることができるかどうかを調べたかった。そこで、磁気マイクロビーズを用いて、Cx3Cr1+常駐単核ファゴサイトをコロニー単細胞懸濁液から精製した(図3D)。TNBS処理マウスからのウェスタンブロット分析によりCx3Cr1+常駐単核食細胞におけるp-p70およびp-S6の増加レベルが見出され、このレベルはラパマイシンによって遮断された(図3E)。また、ラパマイシン処理は、TNBS処理群におけるIL-23およびIL-1βを低下させることがわかった(図3F)。さらに、これらの知見は、TNBS線維症の誘導に関与する有効なメカニズムを解明し、ラパマイシンが線維症の誘導を減衰することを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig1.jpg"> 図1:TNBS投与の成功は、マウスにおける腸線維症の発症につながる。野生型マウスに与えられた毎週のTNBS治療の概略図図。B.結腸画像およびTNBS処理マウスからの結腸長の測定は、週0、2、4、および6ポストTNSB処理で収穫した。C -Dコロナセクションの組織学的分析は、コラーゲンのための筋線維芽細胞およびトリクロムブルー染色の活性化のための抗αSMA抗体で染色された;スケールバー 100 μm. E.FACS分析は、結腸中のαSMA陽性細胞を同定し、αSMA陽性細胞を定量した。F.線維性マーカーおよびサイトカインはqPCRによって検出された。G.TNBS処理および対照マウスの結腸ライサートからのαSMAのウェスタンブロット分析。この修正された図は、Mucosal免疫学、2019年のMuthur et al.の以前の出版物9の許可を受けて再利用<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig1large.jpg" target="_blank">されています。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig2.jpg"> 図2:TNBS線維症はクローン関連腸線維症に匹敵する。A.コントロールの大腸生検の代表的な画像は、粘膜下層におけるトリクロム青色染色およびαSMA陽性染色の有意な増加を示す活性CD、スケールバー50μm.B. αSMA発現および定量のウェスタンブロット分析線維性マーカーおよびサイトカインのC.qPCR分析この修正された図は、Mucosal免疫学、2019年のMuthur et al.の以前の出版物9の許可を受けて再利用<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig2large.jpg" target="_blank">されています。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig3.jpg"> 図3:ラパマイシン治療はTNBS誘発線維症を効果的に改善する。A.結腸組織学的分析 - 抗αSMA抗体とコラーゲン染色による筋線維芽細胞染色の代表的な画像とトリクロムブルー、スケールバー100 μm. B.コントロール/TNBS処理マウスコロン。コントロール/TNBSで処理したマウス結腸からの単一細胞懸濁液中のαSMAのFACS分析D. Cx3Cr1+細胞のコロニック・ラミナ・プロプリア画分および精製細胞のFACS分析のための回路図。E. TNBSおよび/またはラパマイシンで処置したマウスからの精製Cx3Cr1+単核食細胞におけるp-p70およびp-S6レベルのウェスタンブロット分析。精製されたCx3Cr1+単核性ファゴサイトにおける発現のF.qPCR分析は、IL-23およびIL-1βを産生する。この修正された図は、Mucosal免疫学、2019年のMuthur et al.の以前の出版物9の許可を受けて再利用<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig3large.jpg" target="_blank">されています。</a>

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Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

本研究では、クローン線維症に匹敵する病態生理学を示すTNBS媒介腸線維症の詳細な手順について述べる。我々はまた、ラパマイシンが腸線維症に対する阻害作用を促進したことを考慮して、このアプローチについて議論する。

TNBS媒介性腸線維症の発症に関する機械的洞察とラパマイシンの阻害効果の評価

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

このプロトコルは、クローンのヒト線維症の非常に比較可能な病態生理学を示し、また、腸線維症に対するラパマイシン媒介阻害作用について議論する。このプロトコルの主な利点は、腸線維症の発症を4〜8週間の間に非常に短い時間で記述し、組織修復と組織再生を研究する機会を与えてくれる点です。このプロトコルは、線維症のメカニズムを取得するために急いでいる研究者に役立ちます, そしてクローンの関連する腸線維症の介入を予測するためのより良い技術を見つけるのに役立ちます.この手順を開始するには、真皮暴露を介してTNBSに予感性を与えるために、首の領域の周りに成体マウスを剃る。その後、TNBSでコトン綿棒を浸し、マウスの首の剃った領域に適用します。感作後8日間、週1回、6週間の間、直腸内投与により大腸炎を誘発する。これを行うには、鋼のガベージ針に取り付けられた1ミリリットルの注射器を介して100マイクロリットルの浣腸を使用して25%エタノールにTNBSの4ミリグラムを適用する。コントロールマウスに25%エタノールの100マイクロリットルを与える。マウスを麻酔した後、腹腔内にラパマイシンを1日当たり2ミリグラムで注入するか、または車両、またはその両方を、毎週平日に3〜6週間、対照およびTNBS処置マウスの両方に注入する。この後、細胞外アッセイを分析するために6週間のTNBS後処理されたマウス腸を使用する。まず、氷冷HBSSで結腸を縦方向に開き、HBSSで結腸を洗浄する。滅菌はさみを使用して、HBSSで約5センチメートルの小片にコロンをカットします。小さな結腸組織片を、10ミリリットルの消化前バッファーを含む15ミリリットルの円錐管に移します。37°Cのインキュベーターで100 RPMでチューブを20分間振ります。次に、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して懸濁液を通過させ、付着した大腸上皮を廃棄する。ストレーナーから残りの組織を収集し、100 RPMで振りながら37°Cのインキュベーターで5%FBSで1X HBSSのコラゲナーゼタイプIV型とDNASE1を含む消化バッファーでさらに消化します。この後、消化した組織を約20秒間渦化させ、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通過して層のプロプリア画を得る。薄層プロプリア分画を700倍Gで、摂氏4度で細胞をペレット状に遠心する。その後、30%と70%の両方の濃度勾配培地溶液の100ミリリットルを作ります。得られた細胞を30%溶液の10ミリリットルで再懸濁し、これを15ミリリットルチューブ内の70%溶液の5ミリリットルの上に重ね合わせます。Gと室温の1,000倍の破断条件で勾配を遠心分離する。30%と70%の勾配層の間になる層のプロプリアリンパ球を含む白い環相を収集します。得られた細胞を氷冷HBSSで再懸濁し、500倍Gと摂氏10度で10分間遠心分離して洗浄します。次に、FACS バッファ内のセルを再中断します。抗体染色の前に、まず氷上の32FCブロッカーで抗マウスCD16で15分間インキュベートすることにより、層状プロプリア細胞の細胞表面をブロックする。次に、抗CX3CR1 PE抗体と氷上の抗PEマイクロビーズを30分間インキュベートし、結合細胞を捕捉し、次にFACSバッファーで細胞を洗浄します。抗体とビーズ結合細胞を磁界の磁気活性化細胞選別カラムを通して通過させ、非結合細胞を除去します。FACSバッファーで細胞を3回洗浄します。この後、磁場からカラムを取り出し、カラムのプランジャーを押してビーズ結合セルを生成します。まず、氷の上に32FCブロッカーによって抗マウスCD16で層状のプロプリア細胞をブロックします。抗CD64、CD11c、CD11b、CX3CR1、Ly6CおよびMHCクラスII抗体を用いて細胞をインキュベートすることによって細胞を歪み、次に、テキストプロトコルに概説されているようにFACSフローサイトメーターを使用して細胞をソートする。全RNA調製のために選別された細胞をリセし、サイトカインおよび線維性マーカーを検出する。単離した単一細胞懸濁液から、磁気精製から線維化マーカーおよび炎症性サイトカイン解析のmRNA発現を解析する。細胞表面染色および分析を開始するには、FACSバッファーの15ミリリットルで500,000と100万の単層プロリア細胞の間で再懸濁します。氷上で1~50の希釈で32抗体を用いて、抗CD16で細胞を10分間インキュベートします。この後、500マイクロリットルの氷冷FACSバッファーで細胞を洗浄し、非結合抗体を除去します。表面染色大腸単細胞懸濁液は、氷上で1〜100の希釈時に蛍光標識抗体を30分間用いた。標識された細胞を2回洗浄し、洗浄ごとに500マイクロリットルの氷冷FACSバッファーを使用して非結合抗体を除去します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、フローサイトメーターによって標識された単核細胞を分析する。細胞内サイトカインの染色と分析を開始するには、固定パーメアビライゼーションソリューションキットを使用して、メーカーの指示に従って表面染色された細胞を固定および透過させます。テキストプロトコルに概説されているように、薄層プロプリア細胞をゲートし、IL-1ベータサイトカインの細胞内レベルを検出します。次に、FACSバッファーと遠心分離機をGの200倍と摂氏4度で5分間加えて細胞を洗浄し、余分な固定バッファーを除去します。この洗浄を一度繰り返します。α平滑筋アクチンレベルを決定するために、まず、パーメアビライゼーション溶液キットの固定で細胞を透過させる。氷上で1~1000の希釈で抗アルファSMAアレクサFluor 488抗体を30分間インキュベートします。その後、FACSバッファーと遠心分離機をGの200倍と摂氏4度で5分間加えて細胞を洗浄し、余分な固定バッファーを取り除きます。この洗浄を一度繰り返します。FACS 解析を実行し、テキスト プロトコルで説明されているようにセルをゲートします。本研究では、TNBS大腸炎マウスモデルを採用し、腸線維症の基礎機構を解明する研究を行っています。6週間のTNBS治療の後、TNBS治療の過程で大腸長が対照群の約5センチメートルからTNBS群で約3センチメートルに徐々に短くなっていることが分かる。TNBSクローン病モデルがヒトクローンの線維症モデルに匹敵し、方法論に関連するアーティファクトではないことを保証するために、線維性マーカーは詳細なタイムコース研究で複数のレベルで分析される。線維症の発生率の大部分でアルファ平滑筋アクチン陽性細胞およびコラーゲン沈着の蓄積が報告されており、TNBS線維症をクローンの関連線維症と比較する線維性事象の特徴と見なされ、線維症マーカーおよびサイトカインの発現は、活性CDまたはリミッション下の患者のイリウムからの新鮮な組織生検で分析される。驚くべきことに、顕著な誘導は、α平滑筋アクチン陽性層の肥厚と活性CD切片におけるコラーゲン沈着の増加の見られる。ウエスタンブロット分析は、活性CDサンプルにおけるα平滑筋アクチン発現の誘導を確認するために行われる。さらに、線維化マーカーの有意な誘導は、qPCR分析によって検出される。ラパマイシンの効果は、M4活性の薬理学的阻害剤であり、次いで評価され、TNBS線維症を制限するメカニズムを決定する。マウスはTNBSとラパマイシンの両方で処理され、大腸神学におけるα平滑筋アクチンおよびコラーゲンのレベルが分析される。細胞の生存率を維持するだけでなく、細胞の生存率を維持するだけでなく、細胞の損失を避けるために、各マウスに同じ量のTNBSを接種し、できるだけ早く単離された層状細胞を処理することを覚えておくことが重要です。TNBS線維化と線維化の寛解に関するプロトコルの詳細と同様に線維化形成におけるラパマイシンの抑制因子。他の研究者は、線維症や大腸癌のためのより良い薬物標的を見つけるために、この技術を使用することに興味があるかもしれません.TNBSは皮膚刺激性であり、ラボコートは皮膚接触を避けるために取り扱い中に着用する必要があることを覚えておいてください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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