Name: mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin
Uploaded: 2019-09-12T14:45:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la concesión NIH R01NS093045 (Y.H.), la beca NIH K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), y The Crohn's & Colitis Foundation of America research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).

<ol>
	<li>Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostasis+and+inflammation+in+the+intestine.">Homeostasis and inflammation in the intestine.</a> Cell. 140, 859-870 (2010).</li><li>Park, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+regulatory+cells+maintain+intestinal+homeostasis+by+suppressing+gammadelta+T+cells.">T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells.</a> Immunity. 33, 791-803 (2010).</li><li>Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+intestinal+fibrosis.">Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).</li><li>Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multihit+Model:+Colitis+Lessons+from+the+Interleukin-10-deficient+Mouse.">A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse.</a> Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).</li><li>Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SAMP1/Yit+mouse:+another+step+closer+to+modeling+human+inflammatory+bowel+disease.">The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).</li><li>Ostanin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+transfer+model+of+chronic+colitis:+concepts,+considerations,+and+tricks+of+the+trade.">T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade.</a> American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).</li><li>Antoniou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TNBS-induced+colitis+animal+model:+An+overview.">The TNBS-induced colitis animal model: An overview.</a> Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).</li><li>Loeuillard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,4,6-trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+chronic+colitis+with+fibrosis+and+modulation+of+TGF-beta1+signaling.">2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).</li><li>Mathur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+in+Cx3cr1(+)+mononuclear+cells+limits+IL-23/IL-22+axis-mediated+intestinal+fibrosis.">Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis.</a> Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).</li><li>Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+functions+of+intestinal+mononuclear+phagocytes.">Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes.</a> Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).</li><li>Mathur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Salmonella+typhi+infection.">A mouse model of Salmonella typhi infection.</a> Cell. 151, 590-602 (2012).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninflammatory+Changes+of+Microglia+Are+Sufficient+to+Cause+Epilepsy.">Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy.</a> Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).</li><li>Murugaiyan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-21+promotes+Th17+differentiation+and+mediates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).</li><li>Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-smooth+muscle+actin+expression+upregulates+fibroblast+contractile+activity.">Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+Inhibition+of+mTOR+Reduces+Levels+of+the+Na+/H++Exchanger+3+in+Intestines+of+Mice+and+Humans,+Leading+to+Diarrhea.">Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea.</a> Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).</li><li>Mutalib, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sirolimus+(rapamycin)+in+the+management+of+refractory+inflammatory+bowel+disease+in+children.">The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children.</a> Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).</li><li>Shaw, T. J., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+at+a+glance.">Wound repair at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).</li><li>Paul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17-driven+intestinal+fibrosis+is+inhibited+by+Itch-mediated+ubiquitination+of+HIC-5.">IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5.</a> Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).</li><li>Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Inflammatory+Risk+Factors+in+the+Pathogenesis+of+Streptococcus+pneumoniae.">Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae.</a> Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).</li><li>Laplante, M., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signaling+in+growth+control+and+disease.">mTOR signaling in growth control and disease.</a> Cell. 149, 274-293 (2012).</li><li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease.">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448, 427-434 (2007).</li></ol>

Intereses en competencia: Los autores no declaran intereses competidores.

La cicatrización de heridas o reparación de tejidos es un proceso biológico estrechamente regulado17. Durante la lesión tisular con una condición química, mecánica y de infección, una respuesta inflamatoria desencadena el proceso de reparación del tejido. Sin embargo, una respuesta inflamatoria desregulada y patológica conduce al desarrollo de cicatrices o una reacción fibrosa, que podría afectar la función de reparación del tejido9,18,19. Aquí, mostramos el procedimiento para el modelo animal de fibrosis inducido por TNBS, que comparte significativamente la fisiopatología con la enfermedad humana de Crohn. La inoculación sucesiva de la exposición química de TNBS para dañar el epitelio del ratón causa ulceraciones profundas e induce el desarrollo de fibrosis. Con una inducción fiable, de bajo costo y rápida de la aparición de la enfermedad, este método es ampliamente aceptado por múltiples grupos de investigación involucrados en estudios para lesiones tisulares, inflamación transmural y el eje intestino-cerebro.
Para implementar con éxito el modelo de fibrosis TNBS, hay varios pasos esenciales. Por ejemplo, dosis adecuada y tiempo de administración de TNBS son muy importantes. Una inoculación TNBS de 6-8 semanas permite ulceración de tejido profundo y es muy recomendable para estudios fibrosos crónicos. Las heces que salen de ratones y el reflejo retrógrado de la TNBS inoculada son dos problemas principales, que podrían resultar en la administración de dosis variables a ratones. Una presión suave cerca del recto de los ratones puede ayudar a liberar las heces antes de la administración de TNBS. Mantener la cabeza del animal hacia abajo durante unos segundos ayuda dramáticamente a detener el reflujo inverso de TNBS. Mantener a los ratones en una jaula, colocar la jaula en una almohadilla de calor y proporcionar a los ratones con néctar Napa también podría ser una estrategia útil para prevenir la alta mortalidad.
Aquí, también discutimos la inflamación intestinal durante la fibrosis TNBS y su impacto en la respuesta fibrosa. El papel de mTOR/autofagia está ampliamente implicado en la homeostasis intestinal y en la patogénesis de la EII20,21. Identificamos que la señalización mTOR/autofagia es fundamental para modular las respuestas proinflamatorias de las citoquinas IL-23 e IL1 de Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares que afectan al eje PRO-fibrosico IL-23/IL-22(Figura 3A9 ) . De este modo, la purificación de células mononucleares Cx3Cr1+ para inmunoperfilado y expresión génica es un paso crítico del modelo. Discutimos en detalle el protocolo para aislar lapropería de láminas y proporcionamos el procedimiento de purificación para cx3Cr1+ células mononucleares utilizando cuentas magnéticas.
En conjunto, a pesar de la presencia de modelos genéticos y espontáneos para la enfermedad de Crohn, la tnBS-colitis sigue siendo una herramienta potente para estudiar la inmunopatogénesis de la CD y tiene el potencial de evaluar los tratamientos de fibrosis de Crohn. La principal limitación del uso de modelos de fibrosis inducidas químicamente como TNBS es la posibilidad de una alta variabilidad de usuario a usuario y la posibilidad de valores atípicos en los datos. Un tamaño de muestra de 5-8 animales por grupo junto con una mayor experiencia de usuario puede aumentar la consistencia del modelo. Sin embargo, encontrar un modelo genético adecuado que cause fibrosis espontánea de Crohn es y siempre estará justificado.

La desregulación de la homeostasis inmune en el intestino conduce a la inflamación patógena y ha sido ampliamente conocida por causar enfermedad inflamatoria intestinal (EII)1,2. La fibrosis intestinal es una consecuencia crónica de las enfermedades inflamatorias intestinales (ECD), como la enfermedad de Crohn (CD)3. La fisiopatología irreversible de la CD incluye estenosis intestinal o estenosis de la fibrosis, que limita las opciones de tratamiento, y sin medicamentos disponibles actualmente, el único tratamiento es la cirugía. En última instancia, el desarrollo de terapias eficaces para contrarrestar la inflamación inapropiada es muy necesario para estudiar el mecanismo de la CD, y esto nos llevará un paso más cerca de eso.
Una variedad de modelos genéticos de ratón están disponibles para estudiar IBD incluyendo IL10 KO, SAMP/Yit y transferencia de células altas CD45+RB adoptiva a ratones SCID4,5,6. Aquí, mostramos el procedimiento para la fibrosis mediada por TNBS en el modelo de ratón de CD, que es comparable a la patología de la fibrosis humana de Crohn. El modelo inducido por TNBS tiene ciertas ventajas. Este modelo es técnicamente simple; la aparición de la enfermedad es rápida, barata y podría utilizarse ampliamente en diferentes animales (por ejemplo, ratón, rata y conejillo de indias7). La administración conjunta de etanol y TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfónico) daña abruptamente la barrera intestinal y expone la proteína del tejido de colon a la TNBS y genera respuestas inmunológicas sustanciales8,9. La exposición repetida de TNBS conduce a un proceso de reparación hiperreactivo que responde a la inflamación y lesión, y desarrolla una reacción fibrosa en el intestino. Por lo tanto, el modelo de fibrosis inducida por TNBS sirve para ser un modelo muy convincente para estudiar la fibrosis intestinal asociada a Crohn.
Además, los fagocitos mononucleares son las células primarias que arbitra la respuesta inmune innata a la patogénesis y lesión en el intestino10,11,12,13. Para dilucidar el mecanismo celular y establecer el papel de Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares en el modelo de fibrosis TNBS, mostramos el procedimiento de purificación de los fagocitos mononucleares. El análisis de Cx3Cr1+ células es un paso esencial para evaluar los marcadores inflamatorios y determinar el mecanismo concomitante para la fibrosis intestinal. Colectivamente, este procedimiento detallado para la fibrosis TNBS será útil para explicar los mecanismos celulares de la fibrosis intestinal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>53-9760-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>149760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>101226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse purified CD16/32 Fc block</td>
			<td>Biolegend Inc</td>
			<td>14-9760-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-105-639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-isdn</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D263-5vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 40&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td><a href="http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>e-bioscience</td>
			<td>5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software Inc</td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>HXMMHPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percol</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA/Ionomycin salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A25777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>LC LABORATORIES</td>
			<td>1003799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>92823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichorme staining kit</td>
			<td>American Mastertech Kit</td>
			<td>STOSTBPT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verso cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black 2.1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue lite 2.3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="http://www.zeis.com/">www.zeis.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanistic insight into the development of tnbs-mediated intestinal fibrosis and evaluating the inhibitory effects of rapamycin

Se han realizado estudios significativos para comprender el manejo eficaz de la fibrosis intestinal. Sin embargo, la falta de un mejor conocimiento de la fibrosis ha obstaculizado el desarrollo de un medicamento preventivo. Principalmente, encontrar un modelo animal adecuado es un reto en la comprensión del mecanismo de la patología de la fibrosis intestinal asociada a Crohn. Aquí, adoptamos un método eficaz donde la exposición química de TNBS a los rectos de los ratones produce ulceración sustancialmente profunda e inflamación crónica, y los ratones luego desarrollan crónicamente fibrosis intestinal. También, describimos una técnica donde una inyección de rapamicina muestra efectos inhibitorios sobre la fibrosis mediada por TNBS en el modelo de ratón. Para evaluar el mecanismo subyacente de la fibrosis, medimetóicamente un procedimiento para purificar las células Cx3Cr1+ a partir de la propria de lamina de ratones tratados con TNBS y de control. Este protocolo detallado será útil para los investigadores que están investigando el mecanismo de la fibrosis y allanan el camino para encontrar una mejor invención terapéutica para la fibrosis intestinal asociada a Crohn.

Adoptamos el modelo de ratón de colitis TNBS para estudiar y dilucidar los mecanismos subyacentes de la fibrosis intestinal8. Aquí, realizamos un estudio detallado del curso de tiempo de la colitis mediada por TNBS, donde TNBS se administró rectalmente a ratones de tipo salvaje durante un máximo de seis semanas como se representa esquemáticamente(Figura 1A). Después de seis semanas de tratamiento con TNBS, notamos que las longitudes colónicas se acortan progresivamente en el transcurso del tratamiento con TNBS, de una media de 5 x 0,5 cm en el grupo de control a 3 x 0,5 cm en el grupo TNBS; tal análisis cuantitativo de la longitud de dos puntos representa una reducción muy aparente de la longitud de dos puntos(Figura 1B). Para asegurarnos de que el modelo de enfermedad de TNBS Crohn es comparable al modelo de fibrosis de Crohn humano y no era un artefacto relacionado con la metodología, analizamos los marcadores fibroticos en múltiples niveles en un estudio detallado del curso de tiempo para la inyección de TNBS al tipo salvaje . La acumulación de células positivas de actina muscular alfa-suave (SMA) y la deposición de colágeno dentro de las capas submucosas se han notificado en la mayoría de las incidencias de fibrosis y se considera un sello distintivo para los eventos fibrosas14. Encontramos que las secciones de dos puntos de ratones tratados con TNBS que estaban manchadas con la AMA mostraron un aumento de 4-6 veces en la capa de la submucosa colónica manchada positivamente con la AMA(Figura 1C). Además, la tinción azul tricroma para estas secciones también mostró un aumento de 2-4 veces, lo que sugiere una deposición significativa de colágeno, que valida la fibrosis intestinal grave(Figura 1D). Evaluamos además la activación de los miofibroblastos mediante la detección de células positivas de SMA mediante el análisis de FACS en ratones tratados con TNBS en el colon de ratones tratados con TNBS y encontramos una acumulación significativa de tinción positiva de La AMA(Figura 1E). Además, encontramos una inducción sustancial en la expresión de las s.s. SMA, Col-I y Col-III medida por el análisis qPCR en ratones tratados con TNBS(Figura 1F). El aumento de la expresión de la proteína SMA en el análisis de manchas occidentales reveló un aumento de la fibrosis(Figura 1G). En general, el tratamiento cinético de TNBS ofrece la oportunidad de acceder a la respuesta inmune putativa en condiciones crónicas, que imita de cerca la condición de fase crónica de la CD y es esencial para el desarrollo de la fibrosis.
Para comparar la fibrosis TNBS con la fibrosis asociada de Crohn, analizamos la expresión de marcadores de fibrosis y citoquinas en biopsia de tejido fresco del íleon de pacientes con CD activo o bajo remisión. Sorprendentemente, encontramos una marcada inducción del engrosamiento de las capas positivas de la AMA y el aumento de la deposición de colágeno detectado por la tinción tricroma en secciones de CD activas(Figura 2A). También realizamos análisis de manchas occidentales y confirmamos la inducción de la expresión ssMA en muestras de CD activas(Figura 2B). Además, observamos una inducción significativa de los marcadores de fibrosis, incluyendo la AMA, Col1, detectada por el análisis qPCR(Figura 2C).
A continuación, para determinar un mecanismo para limitar la fibrosis TNBS evaluamos los efectos de la rapamicina, un inhibidor farmacológico de la actividad mTOR15,16. En consecuencia, tratamos a ratones con TNBS y rapamicina y analizamos el nivel de SMA y colágeno en histología del colon y hemos mostrado la medición cuantitativa de la A.S.M. y el colágeno en la gráfica de densitometría(Figura 3A). Nuestros datos sugieren que la rapamicina reduce la tinción positiva de la AMA en la capa submucosa y disminuye la deposición de colágeno. Para validar y cuantificar aún más las respuestas fibrosas, determinamos las expresiones sSMA, colágeno y TGF por qPCR, y la expresión de SMA por citometría de flujo en dos puntos tratados con TNBS(Figura 3B, 3C). También hemos demostrado Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares inducen una respuesta inmune inflamatoria a la lesión9. Por lo tanto, queríamos ver si la administración de rapamicina en ratones tratados con TNBS podría revertir los efectos inflamatorios y fibroticos. Por lo tanto, purificamos Cx3Cr1+ phagocitos mononucleares residentes de suspensiones de una sola célula colónica mediante el uso de microperlas magnéticas(Figura 3D). Encontramos un mayor nivel de p-p70 y p-S6 en Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares residentes por análisis de manchas occidentales de ratones tratados con TNBS, y este nivel fue bloqueado por rapamicina (Figura 3E). Además, encontramos que el tratamiento con rapamicina amortigua la IL-23 y la IL-1 en el grupo tratado con TNBS(Figura 3F). Además, estos hallazgos aclaran el mecanismo eficaz implicado en la inducción de la TNBS-fibrosis y han demostrado que la rapamicina atenúa la inducción de la fibrosis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig1.jpg"> Figura 1: La administración exitosa de TNBS conduce al desarrollo de fibrosis intestinal en ratones. A. Representación del diagrama esquemático del tratamiento semanal de TNBS dado a ratones de tipo salvaje. B. Imágenes de colon y medición de longitudes de colon de ratones tratados con TNBS, cosechadas en las semanas 0, 2, 4 y 6 tratamiento post-TNSB. C-D. Análisis histológico de las secciones de colon manchado con anticuerpo anti-SMA para la activación de miofibroblastos y tinción azul tricroma para colágeno; barra de escala 100 m. E. Análisis facS para identificar células positivas en el colon y cuantificación de células positivas de La AMA. F. Marcadores fibrosos y citoquinas detectados por qPCR. G. Análisis de manchas occidentales de la A-SMA a partir del lisato de colon de ratones tratados con TNBS y de control. Esta cifra modificada está siendo reutilizada con el permiso de la publicación anterior9 en Mucosal Immunology, 2019 por Mathur et al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig2.jpg"> Figura 2: La fibrosis TNBS es comparable a la fibrosis intestinal asociada a Crohn. A. Imágenes representativas de biopsias de colon de control, CD activo que muestra un aumento significativo de la tinción azul tricroma y tinción positiva de la AMA en capas submucosas, barra de escala 50 m. B. Análisis de manchas occidentales de la expresión y cuantificación de la A- SMA. C. análisis qPCR de marcadores fibroticos y citoquinas. Esta cifra modificada está siendo reutilizada con el permiso de la publicación anterior9 en Mucosal Immunology, 2019 por Mathur et al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60067/60067fig3.jpg"> Figura 3: El tratamiento con rapamicina mejora eficazmente la fibrosis inducida por TNBS. A. Análisis histológico de colon - imágenes representativas de la tinción de miofibroblastos con anticuerpos anti-SMA y tinción de colágeno con azul tricroma, barra de escala 100 m. B. análisis qPCR de la expresión de La AMA, colágeno y TGF en Control/ Dos puntos de ratón tratados con TNBS. C. Análisis FACS de la AIMA en suspensión de una sola célula del colon del ratón tratado con Control/TNBS. D. Esquema para la purificación de Cx3Cr1+ células de fracción de propria de lamina colónica y análisis FACS de células purificadas. E. Análisis de manchas occidentales de los niveles de p-p70 y p-S6 en fagocitos mononucleares cx3Cr1+ purificados de ratones tratados con TNBS y/o rapamicina. F. qPCR análisis de la expresión en fagocitos mononucleares cx3Cr1+ purificados, que produce IL-23 e IL-1. Esta cifra modificada está siendo reutilizada con el permiso de la publicación anterior9 en Mucosal Immunology, 2019 por Mathur et al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60067/60067fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

En este estudio, describimos un procedimiento detallado de fibrosis intestinal mediada por TNBS, que exhibe fisiopatología comparable a la fibrosis de Crohn. También discutimos este enfoque a la luz de los efectos inhibidores facilitados por la rapamicina sobre la fibrosis intestinal.

Perspicacia mecanicista sobre el desarrollo de la fibrosis intestinal mediada por TNBS y la evaluación de los efectos inhibidores de la rapamicina

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

Este protocolo exhibe una fisiopatología muy comparable de la fibrosis de Crohn en humanos y también analiza los efectos inhibitorios mediados por la rapamicina en la fibrosis intestinal. La principal ventaja de este protocolo es que describe el desarrollo de la fibrosis intestinal en muy poco tiempo que varía de cuatro a ocho semanas, lo que nos da la oportunidad de estudiar la reparación de tejidos y la regeneración tisular. Este protocolo será útil para los investigadores que tienen prisa por conseguir el mecanismo de la fibrosis, y ayudar a encontrar una mejor tecnología para predecir la intervención para la fibrosis intestinal asociada de Crohn.Para comenzar este procedimiento, afeite ratones adultos alrededor de la zona del cuello con el fin de pre-sensibilizarlos a TNBS a través de la exposición dérmica. A continuación, remoje un hisopo de coton con TNBS y aplíquelo en la zona afeitada del cuello del ratón. Ocho días después de la sensibilización, inducir la colitis por administración intrarectal una vez a la semana, durante seis semanas.Para ello, aplique cuatro miligramos de TNBS en 25% de etanol utilizando un enema de 100 microlitros a través de una jeringa de un mililitro unida a una aguja de gavage de acero. Dar a los ratones de control 100 microlitros de 25% de etanol solamente. Después de anestesiar a los ratones, inyecte por vía intraperitoneal ya sea rapamicina a dos miligramos por kilogramo por día, o un vehículo, o ambos, todos los días de la semana durante tres a seis semanas para el control y ratones tratados con TNBS.Después de esto, utilice los intestinos de ratones post-tratados de TNBS de seis semanas para analizar los ensayos extracelulares. Primero, abra el colon longitudinalmente en HBSS helado y lave el colon en HBSS. Usando tijeras estériles, corte el colon en trozos pequeños que estén aproximadamente cinco centímetros en HBSS.Transfiera las piezas pequeñas del tejido del colon a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón antes de la digestión. Agitar el tubo a 100 RPM en una incubadora a 37 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, pase la suspensión a través de un colador celular de 40 micrómetros y deseche el epitelio colonico adjunto.Recoger el tejido restante del colador y digerirlo aún más en el tampón de digestión que contiene colagenasa Tipo IV y DNASE1 en 1X HBSS con 5%FBS durante 20 minutos en una incubadora a 37 grados Celsius mientras se agita a 100 RPM. Después de esto, vórtice los tejidos digeridos durante aproximadamente 20 segundos y pasarlo a través de un colador celular de 40 micrómetros para obtener fracciones de lámina propria. Centrifugar las fracciones de lamina propria a 700 veces G y cuatro grados Celsius para reducir las células.A continuación, haga 100 mililitros de soluciones de medios de gradiente de 30% y 70% de densidad. Resuspender las células obtenidas en 10 mililitros de la solución del 30% y superponer esto encima de cinco mililitros de la solución del 70% en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el gradiente en estado libre de rotura a 1.000 veces G y temperatura ambiente.Recoger la fase de anillo blanco que contiene los linfocitos de lamina propria, que estará entre las capas de 30% y 70% gradiente. Lavar las células obtenidas resuspendándolas en HBSS helado y centrifugando a 500 veces G y 10 grados Celsius durante 10 minutos. Luego resuspend las células en el buffer FACS.Antes de la tinción de anticuerpos, primero bloquee la superficie celular de las células de lamina propria incubando con un bloqueador CD16 por 32FC en hielo durante 15 minutos. A continuación, incubar las células con anticuerpos anti-CX3CR1 PE junto con microperlas anti-PE en hielo durante 30 minutos para capturar las células enlazadas, luego lavar las células con tampón FACS. Pase el anticuerpo y las células unidas a cuentas a través de una columna de clasificación de células activadas magnéticas en un campo magnético para eliminar las celdas no enlazadas.Lave las células tres veces con el tampón FACS. Después de esto, retire la columna del campo magnético y empuje el émbolo en la columna para producir las celdas unidas al cordón. Primero, bloquee las células de lamina propria con el bloqueador CD16 por 32FC antiratón sobre hielo.Tensar las células incubando con anticuerpos anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C y MHC Clase II Luego clasif sino un citómetro de flujo FACS como se describe en el protocolo de texto. Lyse las células ordenadas para la preparación total del ARN y detectar citoquinas y marcadores fibrosos. Analizar la expresión de ARNm de marcadores fibrosos y análisis de citoquinas inflamatorias a partir de suspensiones aisladas de una sola célula a partir de purificación magnética.Para comenzar la tinción y el análisis de la superficie celular, resuspendir entre 500,000 y 1 millón de células aisladas de lámina propria en 15 mililitros de tampón FACS. Incubar las células con anticuerpos anti-CD16 por 32 a una dilución de 1 a 50 en hielo durante 10 minutos. Después de esto, lave las células con 500 microlitros de tampón FACS helado para eliminar los anticuerpos no unidos.Suspensión de una sola célula colónica de manchas superficiales con anticuerpos con etiqueta fluorescente a una dilución de 1 a 100 sobre hielo durante 30 minutos. Lave las células etiquetadas dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos utilizando 500 microlitros de tampón FACS helado para cada lavado. A continuación, analice las celdas mononucleares etiquetadas por citómetro de flujo como se describe en el protocolo de texto.Para comenzar la tinción y el análisis de la citoquina intracelular, utilice un kit de solución de permeabilización de fijación para fijar y permeabilizar las células manchadas de superficie de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Puerta de las células de lamina propria como se describe en el protocolo de texto para detectar el nivel intracelular de citoquinas beta IL-1. A continuación, lave las células añadiendo el búfer FACS y centrifugando a 200 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para eliminar el exceso de búfer fijador.Repita este lavado una vez. Para determinar el nivel de actina muscular lisa alfa, primero permeabilizar las células con el kit de solución de permeabilización de fijación. Incubar las células con anticuerpos anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 a una dilución de 1 a 1000 en hielo durante 30 minutos.Luego lave las células agregando el búfer FACS y centrifugando a 200 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para eliminar el exceso de búfer fijador. Repita este lavado una vez. Realice el análisis FACS y a compona las celdas como se describe en el protocolo de texto.En este estudio se adopta el modelo de colitis ratón TNBS para estudiar y dilucidar los mecanismos subyacentes de la fibrosis intestinal. Después de seis semanas de tratamiento con TNBS, se puede observar que la longitud del colon se acortó progresivamente en el transcurso del tratamiento con TNBS de aproximadamente cinco centímetros en el grupo de control a aproximadamente tres centímetros en el grupo TNBS. Para garantizar que el modelo de la enfermedad de TNBS Crohn sea comparable al modelo de fibrosis humana de Crohn y no sea un artefacto relacionado con la metodología, los marcadores fibrosos se analizan a varios niveles en un estudio detallado del curso.La acumulación de células positivas de actina de músculo liso alfa y la deposición de colágeno dentro de las capas submucosas se han notificado en la mayoría de las incidencias de fibrosis y se considera como un sello distintivo para los eventos fibrosos Para comparar la fibrosis TNBS con la fibrosis asociada de Crohn, la expresión de marcadores de fibrosis y citoquinas se analiza en biopsia de tejido fresco del íleon de pacientes con CD activo o bajo remisión. Sorprendentemente, inducción marcada se observa del engrosamiento de las capas positivas de músculo liso alfa y aumento de la deposición de colágeno en secciones activas de CD. El análisis de manchas occidentales se realiza para confirmar la inducción de la expresión de actina de músculo liso alfa en muestras de CD activas.Además, el análisis qPCR detecta una inducción significativa de marcadores de fibrosis. A continuación, se evalúan los efectos de la rapamicina, un inhibidor farmacológico de la actividad M4 para determinar un mecanismo para limitar la fibrosis TNBS. Los ratones son tratados con TNBS y rapamicina y se analizan los niveles de actina muscular lisa alfa y colágeno en la histología del colon.Es importante recordar inocular la misma cantidad de TNBS a cada ratón y procesar células aisladas de lamina propria tan pronto como sea posible para evitar la pérdida celular, así como para mantener la viabilidad celular. Nuestros detalles del protocolo sobre la fibrosis TNBS y la remisión de la fibrosis, así como el factor inhibitorio de la rapamicina en la formación de fibrosis. Otro investigador puede estar interesado en el uso de esta técnica para encontrar un mejor objetivo de medicamentos para la fibrosis y el cáncer de colon.Recuerde que TNBS es un irritante para la piel y se deben usar batas de laboratorio durante la manipulación para evitar el contacto con la piel.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

Desarrollo de una<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudiar la interacción de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE con su receptor de alta afinidad Fc RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Análisis de citometría de flujo de partículas unida a Bet v 1 de alérgenos en el MP10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

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The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...