Name: characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment
Uploaded: 2020-06-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment at JoVE.com

提交的作品得到了全国教育促进中心、全国教育与教育协会的支持。我们感谢BICeL-校园科学城设施获得仪器和技术建议。我们感谢让-帕斯卡尔·吉梅诺、苏莱曼·阿布卢亚德和伊莎贝尔·富尼耶为大众测量学援助。我们感谢塔尼娜·阿拉伯人、克里斯特尔·范坎普、弗朗索瓦丝·勒马雷克-克罗克、雅科波·维齐奥利和皮埃尔-埃里克·萨乌蒂埃对科学和技术发展所作的重大贡献。

1. 微胶质/巨噬细胞的主要文化
<ol><li>
微胶质的主要文化
	<ol>
<li>培养商业大鼠原生微胶质（2 x 106细胞）（见材料表）在Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）中补充10%无异体血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链球菌素和9.0克/L葡萄糖，37°C和5%CO2 。2</li>
		<li>收集48小时培养后的条件介质，然后进行 EV 隔离。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
巨噬细胞的主要培养
	<ol>
<li>?...

中枢神经系统（CNS）是一个复杂的组织，细胞到细胞的通信调节平衡所需的正常神经元功能30。EV现已被广泛研究，并被描述为细胞到细胞通信的重要分子货物31。他们特别向受体细胞提供一种调子鸡尾酒，从而影响其在健康和病理条件下的功能32。最近的研究表明，EV在中枢神经系统24、33、3433,34...

许多神经病理学与神经炎症状态有关，这是一种日益被考虑的复杂机制，但由于免疫过程多种多样，并且依赖于细胞环境，因此仍难以理解。事实上，中枢神经系统疾病没有系统地涉及相同的激活信号和免疫细胞群，因此亲炎反应很难作为病理的原因或后果来评价。大脑常驻巨噬细胞称为"微胶质"，似乎在神经和免疫系统之间的接口1。微胶质有一个骨髓起源，从原始造物病期间的蛋黄囊派生，以殖民大脑，而外周巨噬细胞从胎儿肝脏在决定性的造物形成过程中，成为外周巨噬细胞2。微胶质细胞与神经元和神经元衍生的胶质细胞（如星形细胞和寡核糖3）通信。最近的几项研究表明，微胶质在中枢神经系统发育和成人组织平衡过程中，以及与神经退行性疾病44、55相关的炎症状态中，都涉及神经元可塑性。否则，血脑屏障的完整性可能会在其他中枢神经系统疾病中受损。免疫反应，特别是在胶质细胞瘤多肠癌中，不仅由微胶质细胞支持，因为血脑屏障通过血管生成过程和淋巴血管的存在6，77重组。因此，在整个肿瘤依赖性血管生成机制8中，脑肿瘤中出现了一个大的骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）。癌细胞对渗透的BMDM有显著影响，导致免疫抑制特性和肿瘤生长9。因此，由于细胞起源和激活信号多种多样，免疫细胞与其大脑微环境之间的通信是难以理解的。因此，在生理条件下，对免疫细胞相关分子特征的功能进行鉴定是很有趣的。在这方面，通过释放细胞外囊泡（EV），可以研究免疫细胞和细胞微环境之间的细胞-细胞通信。
在调节健康及病理状况的,免疫功能方面，EV正研究得越来越多。可以考虑两个种群，外体和微囊。它们呈现不同的生物发生和大小范围。外泌体是直径±30~150nm的囊泡，由内体系统生成，在多孔体（MVB）与等离子膜融合期间分泌。微囊直径约为100~1000纳米，由细胞等离子膜14外萌芽产生。由于外泌体与微囊歧视仍难以根据大小和分子模式来实现，因此本文仅使用"EV"一词。CNS的EV相关通信代表了一种祖先机制，因为研究表明它们与无脊椎动物物种（包括线虫、昆虫或阴叶15、16）,16有牵连。此外，结果显示，EV可以与不同物种的细胞通信，表明这种机制是一个关键锁系统，首先基于囊泡和受体细胞之间的表面分子识别，然后允许接受调子16，17。16,事实上，EV含有许多分子，如蛋白质（如酶、信号转导、生物成因）、脂质（如神经酰胺、胆固醇）或核酸（例如DNA、mRNA或miRNA），作为受体细胞活动的直接或间接调节剂14。这就是为什么方法学研究也进行免疫细胞分离EV和充分表征他们的蛋白质特征18，19。18,
最早的研究表明，在Wnt3a-或血清素依赖活化20，21,21之后，从原培养大鼠微胶质中释放外体是一种诱导机制。在CNS的功能中，微胶质衍生的EV调节突触神经质释放通过神经元的预显终端促进神经元兴奋性控制22，23。22,微胶衍生的EV也可以传播细胞因子介导的炎症反应在大大脑区域24，25。24,重要的是，收费型受体家族的多样化配体可能会激活微胶质26中特定EV的生产。例如，体外研究表明，LPS激活的微胶质BV2细胞系产生微分EV含量，包括亲炎细胞因子27。因此，通过自身的EV种群，包括EV对受体细胞的影响和EV内容的识别，可以评估中枢神经系统中免疫细胞亚群的功能多样性、微胶质和渗透性BMDM。
我们之前描述了在微胶质和BMDM衍生的EV分离16，19,19后的功能特性的方法。在本报告中，我们建议独立评估微胶质衍生的EV对神经质外生长的影响，以及巨噬细胞衍生的EV对胶质瘤细胞聚合控制的影响。本研究还提出了对EV分数进行广泛的蛋白质组分析，以验证EV分离程序，并识别生物活性蛋白特征。EV内容的有益效果和分子破译可以帮助它们可能操纵，并作为脑疾病的治疗剂使用。

<table>
<tbody>
<tr>
<td>12% Mini-PROTEAN&nbsp;TGX Precast Protein Gels</td>
<td>Bio-rad</td>
<td>4561045EDU</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>A955-1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon 50 kDa centrifugal filter</td>
<td>Merck</td>
<td>UFC505024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>9830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>HSP90 &alpha;/&beta; antibody (RRID: AB_675659)</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-13119</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>B27 Plus supplement</td>
<td>Gibco</td>
<td>A3582801</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>BenchMixer V2 Vortex Mixer</td>
<td>Benchmark Scientific</td>
<td>BV1003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>5000006</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C18 ZipTips</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>ZTC18S096</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>C6 rat glioma cell</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CCL-107</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Canonical tubes</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62.554.002</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5804000010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>CO2 Incubator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Confocal microscope LSM880</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>LSM880</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>Marienfeld</td>
<td>111580</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture Dish (60 mm)</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43819</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Gibco</td>
<td>41966029</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Electron microscope JEM-2100</td>
<td>JEOL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>03777-10G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>ED-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Exo-FBS</td>
<td>Ozyme</td>
<td>EXO-FBS-50A-1</td>
<td>Exosome depleted FBS</td>
</tr>
<tr>
<td>ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.exocarta.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Gibco</td>
<td>16140071</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Horse Serum</td>
<td>Biowest</td>
<td>S0960-500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtropur S 0.2</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1826.001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fisherbrand&nbsp;Q500 Sonicator with Probe</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>12893543</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>FlexAnalysis</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence mounting medium</td>
<td>Agilent</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic Acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>695076</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Formvar-carbon coated copper grids</td>
<td>Agar scientific Ltd</td>
<td>AGS162-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>340855</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Euromedex</td>
<td>17535-AAT</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Idoacetamide</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td>
<td>Expedeon</td>
<td>ISB1L</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Invert light microscope CKX53</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-024</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>LabTek II 8 wells</td>
<td>&nbsp;Nunc</td>
<td>154534</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laemmli 2X</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1610737</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>Corning</td>
<td>354232</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MaxQuant software (proteins identification software)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/maxquant/</td>
</tr>
<tr>
<td>MBT Polish stell</td>
<td>Brucker</td>
<td>8268711</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MEM 10X</td>
<td>Gibco</td>
<td>21090-022</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylcellulose</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M6385-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MiliQ water</td>
<td>Merck Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Milk</td>
<td>Regilait</td>
<td>REGILAIT300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1658000FC</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>MonoP FPLC column</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Nanosight NS300</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>NS300</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight NTA software v3.2</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoSight syringe pump</td>
<td>Malvern Panalytical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitrocellulose membrane</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>10600007</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>Fluka</td>
<td>56741</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunc multidish 24 wells</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>82.1473</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Electro microscopy Science</td>
<td>15713</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PC-12 cell line</td>
<td>ATCC</td>
<td>ATCC CRL-1721</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide calibration mix</td>
<td>LaserBio Labs</td>
<td>C101</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>115-035-003</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Perseus software (Processing of identified proteins)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://maxquant.net/perseus/</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate</td>
<td>Santa-cruz</td>
<td>sc-362065</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>78830</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Saline</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190094</td>
<td>no calcium, no magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>pluriStrainer M/ 60 &micro;m</td>
<td>pluriSelect</td>
<td>43-50060</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6407</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>355651</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830-20TAB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>PureCol</td>
<td>Cell Systems</td>
<td>5005</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Q-Exactive mass spectrometer</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>rapifleX mass spectrometer</td>
<td>Brucker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat cortical neurons</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R882N-20</td>
<td>Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Macrophage &amp; Microglia Culture Medium</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R620K-100</td>
<td>Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary macrophages</td>
<td>Cell Applications</td>
<td>R8818-10a</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat primary microglia</td>
<td>Lonza</td>
<td>RG535</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sepharose CL-2B</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17014001</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>Dustsher</td>
<td>100204</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Scharlau</td>
<td>SO0227</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L3771</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Fluoride</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7920-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hydroxide</td>
<td>Scharlab</td>
<td>SO0420005P</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyrophosphate</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S6422-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>String software (functional protein association networks)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>https://string-db.org/</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperSignal West Dura extended Duration Substrate</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>34075</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe 1.0 mL</td>
<td>Terumo</td>
<td>8SS01H1</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>1703940</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Interchim</td>
<td>UP031657</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-Glycine</td>
<td>Euromedex</td>
<td>EU0550</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2287</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>A95765</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>342184</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Uranyl acetate</td>
<td>Agar Scientific Ltd</td>
<td>AGR1260A</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>WHA10347510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>&alpha;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C2020-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

characterization of immune cell-derived extracellular vesicles and studying functional impact on cell environment

中枢神经系统（CNS）的神经炎状态在生理和病理状况中起着关键作用。微胶质，大脑中的常驻免疫细胞，有时渗入骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM），调节其微环境在中枢神经系统的炎症特征。现在人们承认，免疫细胞的细胞外囊泡（EV）种群充当免疫中介。因此，它们的收集和隔离对于识别其内容，但也评估其对受体细胞的生物影响也很重要。本数据强调了从微胶质细胞或血液巨噬细胞（包括超中心化和大小排除色谱（SEC）步骤中分离EV的时间顺序要求。非靶向蛋白组分析允许将蛋白质特征验证为EV标记，并特征为生物活性EV含量。微胶质衍生的EV也功能地用于神经元的主要培养，以评估它们作为中微子生长中免疫中介的重要性。结果表明，微胶质衍生的EV有助于促进体外微子的生长。同时，血液巨噬细胞衍生的EV在C6胶质瘤细胞的球体培养物中作为免疫中介器，结果表明这些EV在体外控制胶质瘤细胞入侵。本报告强调了评估EV介导免疫细胞功能的可能性，但也了解这种通信的分子基础。这种破译可以促进使用天然囊泡和/或体外制备治疗性囊泡，以模仿中枢神经系统病理学微环境中的免疫特性。

将生物效应归因于细胞外囊泡 （EV） 的主要挑战之一是能够将 EV 与整个培养介质隔离开来。在本报告中，我们提出了一种使用超中心（UC）和大小排除色谱（SEC）的方法，该方法与蛋白质特征的大规模分析相结合，以验证EV标记物并识别生物活性化合物。巨噬细胞或微胶质衍生的EV分别在24小时或48小时培养后与条件介质分离（图1）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment at JoVE.com

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

本报告强调了从微胶质或血液巨噬细胞分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。微胶质衍生的EV被评价为神经外生长的调节器，而血液巨噬细胞衍生的EV在体外检测中控制C6胶质瘤细胞入侵时被研究。目标是更好地了解这些EV功能作为免疫中介器在特定微环境中。

免疫细胞衍生细胞外囊泡的表征及研究功能对细胞环境的影响

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

该协议使得有可能保证细胞外囊泡的分离和 EBDF 蛋白数量的增加的通知。与其他隔离技术相比，这种技术认为它更完整，更垂直活动。电动汽车在LC和病理条件下的研究也越来越多。此方法可应用于我们选择描述和研究 EV 的任何系统。对于该内容或生物伦理，在跟踪电动汽车时需要特别注意，如在培养中导致以下实验。视觉演示对于承载特定设备（如自制尺寸排除色谱柱）以及纳米粒子计数器和质谱仪的参与至关重要。帮助证明这个程序将是安东内拉拉福罗梅罗，一个从实验室。首先从条件介质中预隔离细胞外囊泡或 EV。将条件从微胶质或巨噬细胞培养物转移到培养基中，并将其在1，200次G下离心10分钟，以粒粒细胞。将上流液转移到新的锥形管中，并再将离心机转移20分钟，以消除凋亡体。然后将上一液转移到10.4毫升聚碳酸酯管中。将管子放入 70.1 TI 转子中，在 100，000 次 G 下将超离心机放入 4 摄氏度下 90 分钟，以对 EV 进行颗粒。离心后，丢弃上清液，将颗粒重新在 200 微升 0.2 微米过滤 PBS 中。要隔离 EV，请通过清洗和消毒玻璃色谱柱，并在底部放置 60 微升过滤器，准备自制尺寸排除色谱柱。将柱子与交链接的阿加罗斯凝胶过滤基层堆叠在一起，形成直径为 0.6 厘米、高度为 20 厘米的固定相。然后用 50 毫升 0.2 微米过滤 PBS 冲洗相。如有必要，请将柱存放在摄氏四度，供以后使用。将重新暂停的 EV 颗粒放在固定相的顶部，收集 250 微升的 20 个连续分数，同时继续将 PBS 添加到固定相的顶部。分数可以储存在零下20摄氏度。要执行纳米颗粒跟踪分析，用 0.2 微米过滤 PBS 稀释每个分数，并涡旋以消除聚集体。将溶液放入一毫升注射器中，并放入自动注射器泵中。接下来，将摄像机设置调整为适当的屏幕增益级别和摄像机级别，然后单击"运行"。将样品加载到分析室中，输液速率为 1000 15 秒。然后减少并稳定视频录制的速度流，以 25 的输液速率 15 秒。连续捕获三个 60 秒的粒子流视频。然后在视频分析之前调整摄像机电平和检测阈值。单击"设置确定"以开始分析，并在完成时单击"导出"。用一毫升 0.2 微米过滤 PBS 清洗系统。如果执行电子显微镜分析，使用50千吨离心滤波器来浓缩感兴趣的大小排除色谱分数。对于蛋白质提取，将50微升RIPA缓冲液与EV样品混合5分钟。在500瓦和20千赫下对样品进行三次声波化，5秒钟。然后在摄氏4度下以2万次G离心10分钟，清除车辆碎屑。隔离蛋白质后，在12%聚丙烯凝胶的堆叠凝胶中执行蛋白质迁移。在室温下将凝胶中的蛋白质与库马西蓝混合20分钟。然后切除每块彩色凝胶，并切成小块。如手稿中所述，将凝胶片通过一系列连续洗涤。然后用真空浓缩器完全干燥。干燥后，在56摄氏度下，用100微升100毫摩尔碳酸氢铵，含有10毫摩尔二十二醇，减少蛋白质一小时。接下来，用含有50毫摩尔碘多乙酰胺的100微升100毫摩尔碳酸氢钠进行蛋白烷化，在黑暗中45分钟。根据手稿说明清洗凝胶片，并在真空浓缩器上完全干燥。在37摄氏度的碳酸氢铵中用50微升的三聚液进行蛋白质消化。第二天，用50微升100%ACN从凝胶中提取消化的蛋白质，在37摄氏度下30分钟，然后在室温下15分钟连续搅拌。然后在20毫摩尔碳酸氢铵中用50微升5%TFA的50微升提取蛋白质两次，同时连续搅拌20分钟。加入 100 微升的 ACN，继续搅拌 10 分钟。之后，干燥蛋白质，并在20微升0.1%TFA中重新暂停。使用带 C 18 反向相介质的 10 微升移液器尖端对样品进行脱盐和浓缩肽。然后用ACN和0.1%的甲酸洗。使用真空浓缩器完全干燥样品，并在 20 微升 ACN 和 0.1% 甲酸中重新泵化，用于液相色谱串联质谱法（LC-MS）。将消化的肽加载到仪器中，并进行样品分析。为了确认EV隔离，每个SCC分数都经过纳米粒子跟踪分析。粒子数在分数五、六和七中显著增加。这些分数被汇集到一个样本2F-EV阳性，并与EV负数分数，1F-EV阴性和3F-EV阴性进行比较，使用西方印迹分析。结果表明，在EV阳性样品和细胞酸盐控制中存在热休克蛋白90。EV 阳性样本的电子显微镜显示 EV 的尺寸范围约为 100 纳米和 400 纳米。为了识别EV阴性样品中的污染物蛋白，并描述EV的蛋白质含量，进行了蛋白质组学分析。在1F-EV阴性样本和2F-EV阳性样本之间，以及2F-EV阳性样本和3F-EV阴性样本之间，对已识别的蛋白质进行比较。使用这种非靶向方法，将536种蛋白质的池提交给ExoCarta数据库，并导致86个EV相关蛋白质的识别。此外，该池还允许识别蛋白质相互作用及其相关的生物功能。研究发现，EV阳性样本中的蛋白质在免疫和神经保护途径中发挥作用。用PC 12细胞和大鼠原发神经元对神经素产生的影响进行了评价。与控制相比，在电动汽车下观察到显著增长。对胶质瘤细胞入侵进行了巨噬细胞衍生的电动汽车评价。研究发现，EV损害了胶质瘤球体的生长和入侵。要记住的最重要的事情是真正小心地丢弃超离心步骤的上清液，以防止在此过程中丢失 EV。我们赞成采用大规模和非靶向的方法，关注整个蛋白质含量，然后关注电动汽车的垂直效应。因此，核酸中的内容可以通过分析来关联。通过这种方法，从初级培养，我们能够区分EV蛋白和自由蛋白，是品种之外。因此，问题仍然是，这种凝固是神器还是一些其他真正的

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

使用扩频萧条的情节和慢性偏头痛的神经免疫信号建模<em在体外</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

科研

神经科学

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

生物神经毒素在茎的网络文化功能评估细胞衍生的中枢神经系统神经元

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

用线性琼脂糖渠道研究<em&gt;果蝇</em&gt;幼虫爬行行为

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

利用干细胞衍生脑 Organoids体外培养人脑组织 Zika 病毒感染的模拟研究

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

渗透胁迫对分泌性囊泡和胞吐作用的监测作用

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

幼虫斑马鱼外系头发细胞的活体钙成像

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

预组装塑料微流体芯片中人类干细胞衍生神经元的分段化

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

人类干细胞衍生内皮细胞和GABAergic神经元的迁移、化学吸引和共培养测定

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

猫大型动物模型中人类胚胎干细胞来源的视网膜组织的视网膜下移植

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

胎儿和成体神经干细胞衍生少突胶质细胞前体细胞培养物的高内涵筛选分化与成熟分析

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...