Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Vi takker Touro University California College for osteopatisk medicin for at støtte vores forskning. Vi anerkender tidligere studerende i laboratoriet (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John lim), der hjalp med at implementere denne mikroinjektionsteknik i vores laboratorium. Vi er taknemmelig for Dr. Christine Holt, i hvis laboratorium denne DNA mikroinjektion/lipofection teknik i Xenopus embryoner blev først udviklet.

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Touro University California (protokol # TUCA003TE01X).
1. opnåelse af X. laevis embryoner
<ol><li>Opnå X. laevis embryoner ved naturlig parring af par af mandlige og kvindelige voksne frøer primet med humant choriongonadotropin (HCG), ved in vitro befrugtning af æg udgydt fra kvindelige voksne frøer PRIMET med HCG, eller ved at bestille direkte (<str...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

I denne artikel demonstrerer vi, hvordan man udtrykker eksogene DNA-konstruktioner i enkelt eller lille antal optiske neuroner, og hvordan man billede individuelle gfp udtrykker optiske axonal Dorne med normal og ændret Molekylær signalering i intakte, levende tadpoler af frøen X . laevis. Vi forklarer også, hvordan man rekonstruere og kvantificere morfologien af gfp udtrykker optiske axonal Dorne fra billeder fanget in vivo. For at udtrykke eksogene DNA-plasmider i et lille antal optiske neuroner, mikroinji...

Under udviklingen af nervesystemet, axoner af præsynaptiske neuroner navigere gennem forskellige regioner i hjernen til at nå deres mål områder. Når axoner invaderer deres målvæv, de etablerer synaptiske forbindelser med postsynaptiske Target neuroner. I mange typer af neuroner øger axoner antallet og den rumlige udstrækning af synaptiske forbindelser, de kan gøre ved at udarbejde netværk af Terminal grene eller Dorne1. Retino-tectal projektion af tadpoler af vand frøen xenopus laevis er en stærk hvirveldyr model for undersøgelse af mekanismer underliggende Terminal Axon arborization og synaptisk tilslutningsmuligheder2,3,4 . Individuelle gfp udtrykker optiske axonal Dorne med normal og ændret Molekylær signalering kan observeres direkte i intakt, levende xenopus haletudser5,6,7,8. For at udtrykke GFP alene eller sammen med fuld længde eller trunkerede versioner af gener i et lille antal optiske neuroner, bruger vi en teknik, der involverer mikroinjektion/lipofection af DNA i eyebuds af en dag gamle Xenopus embryoner9, 10. denne teknik blev oprindeligt udviklet til at studere mekanismer af optisk Axon pathfinding i unge xenopus Tadpoles, og er siden blevet anvendt af os og andre til at bestemme celle-autonome molekylære mekanismer underliggende optisk Axon arborisering i xenopus haletudser5,6,7,8,9,10.
Alternative teknikker til at udtrykke eksogene gener i et lille antal optiske neuroner er blevet udviklet i andre model arter, samt i X. laevis. Men hver af disse tilgange præsenterer udfordringer og begrænsninger i forhold til mikroinjektion af DNA/lipofection reagens i øjen knopper af Xenopus embryoner. I mus kan transgenese bruges til at udtrykke gener i et lille antal optiske neuroner, men genereringen af Transgene mus er bekostelig og tidskrævende og Transgene mus ofte til stede med uønskede bivirkninger11. Transgene zebra, der udtrykker eksogene gener i optiske neuroner kan også skabes ved at injicere plasmider i tidlige kavaler stadiet embryoner12. Denne proces kræver imidlertid kloning af en specifik promotor for at udtrykke gener i et mosaik mønster i optiske neuroner i Zebra larver12. Hyppigheden af ekspression af eksogen DNA i optiske neuroner i transgene Zebra er også noget lavere (< 30%) sammenlignet med xenopus haletudser, der blev mikroinjiceret med DNA/liposomal reagens (30 − 60%)12. I ovo elektroporation er også blevet brugt til at udtrykke gener i et lille antal optiske neuroner i kyllinger13. Men denne procedure har undladt fuldt ud at karakterisere mekanismer, der etablerer optiske fremskrivninger, fordi optisk Axon arborization ikke kan afbildet i intakt, levende chick embryoner. Endelig har flere laboratorier brugt elektroporation til transficere gener i et lille antal optiske neuroner i xenopus haletudser14,15. Men elektro poration kræver optimering af udstyr og protokoller (stimulator, elektroder, rumlige og tidsmæssige mønstre af bølge impulser) ud over, der anvendes til mikroinjektion af DNA/lipofection reagens i øjen knopper af Xenopus embryoner.
Vi og andre tidligere brugte teknikken med mikroinjektion/lipofection af DNA i øjen knopper af xenopus embryoner til at bestemme celle autonome signalerings mekanismer, der etablerer optisk Axon arborization5,6, 7 , 8. vi brugte oprindeligt denne fremgangsmåde til at dissekere funktionerne i cadherin og WNT adapter protein β-køreledning i optisk axonal arborisering i xenopus haletudser5,6. I en undersøgelse viste vi, at β-køreledning i binding til α-køreledning i og til PDZ er påkrævet for henholdsvis at initiere og forme optiske axonal Dorne in vivo5. I en anden rapport demonstrerede vi, at β-køreledningen i bindende domæner for α-køreledning i og GSK-3β i modsætning hertil modulerede projektions mønstre af ventrale optiske axonal Dorne6. For nylig, vi identificerede roller for WNT faktor, adenomatøs poliposis coli (APC), i reguleringen morfologiske funktioner af optiske axonal Dorne i xenopus haletudser7. Ved at co-udtrykke N-terminalen og centrale domæner i APC, at moduere β-køreledning i stabilitet og mikrotubulus organisation sammen med gfp i individuelle optiske neuroner, vi fastsatte delte og særskilte roller for disse APC interaktion domæner på filial nummer, længde, og vinkel i optiske axonal Dorne in vivo7. Et andet laboratorium anvendte mikroinjektion/lipofection teknik til at bestemme celle autonome roller for signalering af BDNF receptor, TrkB, i optiske axonal Dorne i xenopus haletudser8. Denne gruppe viste, at udtryk for en dominerende-negativ TrkB rystet forgrening og synaptisk modning i individuelle optiske Axon Dorne in vivo8. Samlet set har lipofection-teknikken i Xenopus allerede belyst de specifikke roller for forskellige gener i optisk Axon-forgrenings forgrening i det indfødte miljø.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

Den primære visuelle projektion af haletudser af vand frøen xenopus laevis fungerer som et glimrende model system til at studere mekanismer, der regulerer udviklingen af neuronal konnektivitet. Under etableringen af Retino-tectal projektion, optiske axoner strækker sig fra øjet og navigere gennem forskellige regioner i hjernen til at nå deres mål væv, optisk tectum. Når optiske axoner ind i tectum, de udførlige Terminal Dorne at funktion til at øge antallet af synaptisk forbindelser, de kan gøre med Target interneuroner i tectum. Her beskriver vi en metode til at udtrykke DNA-kodning grøn fluorescerende protein (GFP), og gevinst-og tab-af-funktion gen konstruktioner, i optiske neuroner (retinal ganglion celler) i Xenopus embryoner. Vi forklarer, hvordan man microinjicere et kombineret DNA/lipofection reagens i øjen knopper af en dag gamle embryoner, således at eksogene gener udtrykkes i enkelt eller lille antal optiske neuroner. Ved at tagge gener med gfp eller co-indsprøjtning med en gfp plasmid, kan Terminal axonal Dorne af individuelle optiske neuroner med ændret Molekylær signalering imælges direkte i hjerner af intakt, levende xenopus haletudser flere dage senere, og deres morfologi kan kvantificeres. Denne protokol giver mulighed for bestemmelse af celle-autonome molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af optisk Axon arborization in vivo.

Den protokol, der er beskrevet i denne artikel, giver en succesrate på 30 − 60% af de injicerede Xenopus -embryoner, der udtrykker gfp (alene eller sammen med yderligere DNA-konstruktioner) i en til ti optiske axonal Arbors. I figur 3viser vi repræsentative konfokale billeder af gfp udtrykke kontrol og mutant optiske axonal Dorne i intakt xenopus haletudser fra vores nyligt offentliggjorte studie7. Til denne undersøgelse klonede vi to domæne mu...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles (Video) | JoVE

Denne protokol har til formål at demonstrere, hvordan man mikroinjicere en DNA/dotap blanding i eyebuds af en dag gamle xenopus laevis embryoner, og hvordan man billede og rekonstruere individuelle grønne fluorescerende protein (gfp) udtrykker optiske axonal Dorne i tectal midhjerner af intakt, levende Xenopus Tadpoles.

Mikroinjektion af DNA i øjen knopper i xenopus laevis embryoner og billeddannelse af Gfp udtrykker optiske Axonal Arbors i intakt, levende xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

I denne video demonstrerer vi, hvordan man udtrykker udefrakommende DNA-konstruktioner i optiske neuroner, og hvordan man afbilder individuelle GFP-udtrykkeroptiske aksonale arbors i intakte, levende Xenopus laevis tadpoler. Dette er en billig, enkel procedure for forbigående celle-specifik transgenese, der giver mulighed for bestemmelse af celle autonome genfunktion i de enkelte optiske axonale arbors, udvikle sig i en levende hvirveldyr model system. Demonstration af proceduren vil være mig selv, Sophia Dao, Research Assistant, og Dr.Tamira Elul, Lab Principal Investigator.Til at begynde, forsigtigt klip spidsen af en trukket glas mikro kapillær pipette med fine kraftbecer. Opfyld glas mikro kapillær pipette med mineralsk olie ved hjælp af en MICROFIL sådan, at en lille dråbe mineralsk olie vises på klippet spidsen af mikropipettet. Fyld glas mikro kapillær pipette halvvejs med mineralsk olie.I en injektor skubbes stemplet ud halvvejs, og mikrokapillærpipetet i det trækkede glas ind i injektionsholderen. Træk derefter stemplet i fuldt omfang for at bekræfte, at mikrokapillærpipetten er stærkt fastgjort til injektoren og ikke bevæger sig med forlængelsen af stemplet. Overfør en tre mikroliter dråbe af DNA / DOTAP blandingen på en en tomme kvadratisk ark paraffin papir.Under et stereodekermikroskop skal du flytte spidsen af glasmikrokapillærpipettet ind i DNA/DOTAP-dråben. Brug fyldindstillingen på injektionsapparatet, sug langsomt DNA/DOTAP-dråben ind i glasmikrokapillærpipettet. Grænsen mellem mineralolien og DNA/DOTAP-opløsningen er synlig i glasmikrokapillærpipettet på grund af dna/DOTAP-opløsningens lille opacitet.Hvis det er nødvendigt, skal du stoppe med at fylde mikrokapillærpipetten med jævne mellemrum, så trykket i glasmikrokapillærpipetten kan kalibrere. Først i en 10 milliliter Petri skål fyldt med 0,1 X MMR, manuelt de-vitellinize 10 trin 20 til 24 Xenopus embryoner med fine fakkel. Tag fat i vitelline kuvert i taljen for at undgå at skade embryoner.Med snævninger i både eksperimentatorens venstre og højre hånd, pop boblen af vitelline kuvert og slip fosteret fra vitelline kuvert. Pas på ikke at skade embryonerne, når vitelline-konvolutten fjernes. Brug derefter en plastoverførselspipette med en afskåret spids til at overføre fem til 10 af-vitellinized fase 22 til 24 embryoner til en 10 milliliter petriskål fyldt med 1X MMR.Under et stereomikroskop skal du forstå et af de afglaserede embryoner i petriskålen med hæcener og arrangere fosteret, så dets forreste pol peger op i synsfeltet. Derefter orientere fosteret, så det ligger side om side, og en af dets venstre mod højre øjenknopper vender opad. Hold fosteret med snækkerierne i eksperimentatorens ikke-dominerende hånd, og indfør med eksperimentatorens dominerende hånd, før spidsen af glasmikropipetten fra ventral- eller dorsalsiden lige under epidermisen ind i øjenknoppen.Injicer mellem 70 og 210 nanoliter af DNA/DOTAP-opløsningen. Vend derefter embryonet rundt og udføre den samme mikro injektion i den anden øjenknoop på den kontralaterale side af fosteret. Injicer begge øjenknopper på seks til 10 embryoner i hvert eksperiment.Efter mikroinjektion opbevares embryoner i en petriskål med 1X MMR i ca. 30 minutter for at lette sårheling. Efter 30 minutter overføres de injicerede embryoner med en plastoverførselspipette til en 0,1 X MMR-opløsning med 0,001% blegemiddel phenylthiocarbamid for at reducere pigmentering. Petriskålen dækkes med låg til at dyrke embryonerne i ca. fem dage, indtil embryonerne har udviklet sig til tadpoler på trin 46 til 47.Denne protokol giver en succesrate på 30 til 60% af injicerede Xenopus embryoner udtrykke GFP i en til 10 optiske axonale arbors. Repræsentative konfokale billeder af GFP viser de udtrykkelige kontrol og mutantoptiske axonale arbors i de intakte Xenopus tadpoler. To domæne mutanter af APC, APCNTERM, og APBbeta-kat blev klonet i pCS2 plasmider.Z-serie billeder af GFP kontrol og APC mutant optisk axonal arbors blev rekonstrueret. Parceller af antallet af grene, total arbor gren længde, og gennemsnitlige gren længde bekræfte observerede forskelle mellem kontrol og APC mutant udtrykke axonal arbors. Yderligere scatter plots af antallet af grene versus gennemsnitlig gren længde med regression linjer viser omvendt korrelation mellem disse parametre og optiske axonal arbors udtrykke APC domæner.Spidsen af mikrokapillær pipetten skal indsættes meget overfladisk i øjenknoppen, så den grå epidermis overliggende øjet knoppen svulmer under hver mikro injektion. Denne procedure kan bruges til både at mærke og ændre specifikke genetiske funktion i optiske neuroner samtidig vurdere den voksende, målretning, og forgrening af axoner fra disse optiske neuroner. Denne DNA mikro injektion og lipofection teknik har gjort det muligt for forskere i udviklingsmæssige neurobiologi at studere celle autonome molekylære mekanismer, der regulerer optisk axon arborization i intakt, levende Xenopus laevis tadpoler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development (Video) | JoVE

Manipulation og<em&gt; In vitro</em&gt; Modning af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocytter, efterfulgt af ICSI, for at studere fosterudviklingen

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq (Video) | JoVE

Genom-dækkende Snapshot af Chromatin Regulators og stater i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoner af Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients (Video) | JoVE

Brug af Konfokal Analyse af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; At Undersøg Modulatorer af Wnt og Shh Morfogen Gradienter

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney (Video) | JoVE

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis (Video) | JoVE

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos (Video) | JoVE

Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish (Video) | JoVE

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis (Video) | JoVE

Fluorescerende calciumimaging og efterfølgende In Situ Hybridisering for neuronal precursor karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor ÃƒÅ¸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

Analyse af Transforming Growth Factor ß Familie kavalergang produkter udskilles i Blastocoele af Xenopus laevis embryoner

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Exploring Retinal Regeneration Mechanisms in the Xenopus Frog (Video) | JoVE

Generering af retinale skademodeller i Xenopus haletudser

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...