Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

We bedanken Touro University California College voor osteopathische geneeskunde voor het ondersteunen van ons onderzoek. We erkennen eerdere studenten in het laboratorium (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) die geholpen hebben bij de implementatie van deze micro Injection-techniek in ons laboratorium. We zijn dankbaar voor Dr. Christine Holt, in wiens laboratorium deze DNA-Microinjection/lipofection-techniek in Xenopus -embryo's voor het eerst werd ontwikkeld.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Touro University California (protocol # TUCA003TE01X).
1. het verkrijgen van embryo's van X. laevis
<ol><li>Verkrijgen van X. laevis embryo's door natuurlijke paring van paren van mannelijke en vrouwelijke volwassen kikkers gevuld met humaan choriongonadotrofine (HCG), door in vitro fertilisatie van eieren schuur van vrouwelijke volwassen kikkers die met hCG zij...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

In dit artikel laten we zien hoe u exogene DNA-constructies in enkele of kleine aantallen optische neuronen uitdrukt en hoe u afzonderlijke GFP-uitbeeldende optische axonale Arbors met normale en veranderde moleculaire signalering in intact, levende kikkers van de kikker X . laevis. We leggen ook uit hoe we de morfologie van GFP, die optische axonale Arbors uitdrukt, van beelden die in vivo zijn vastgelegd, kunnen reconstrueren en kwantificeren. Om exogene DNA-plasmiden uit te drukken in een klein aantal optisch...

Tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel navigeren axonen van presynaptische neuronen door verschillende hersengebieden om hun doelgebieden te bereiken. Wanneer axonen hun doelweefsels binnendringen, vestigen ze synaptische verbindingen met postsynaptische doel neuronen. In vele soorten neuronen, axonen verhogen het aantal en ruimtelijke omvang van synaptische verbindingen die ze kunnen maken door het uitwerken van netwerken van Terminal takken of Arbors1. De retino-tectal projectie van kikkers van de aquatische kikker Xenopus laevis is een krachtig gewervelde model voor het onderzoeken van mechanismen onderliggende terminale axon-arboriisatie en synaptische connectiviteit2,3,4 . Individuele GFP uitdrukken optische axonale Arbors met normale en veranderde moleculaire signalering kan direct worden waargenomen in intact, levende Xenopus kikkers5,6,7,8. Om GFP alleen of in combinatie met volledige of afgeknotte versies van genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken, gebruiken we een techniek waarbij Microinjection/lipofectie van DNA wordt gebruikt in eyebuds van een dag oude Xenopus -embryo's9, 10. deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld om mechanismen van optische axon padvinden te bestuderen in jonge Xenopus tadpoles, en is sindsdien door ons en anderen toegepast om cel-autonome moleculaire mechanismen onderliggende optische axon te bepalen arborisatie in Xenopus kikkers5,6,7,8,9,10.
Alternatieve technieken om exogene genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken zijn ontwikkeld in andere model soorten, evenals in X. laevis. Echter, elk van deze benaderingen presenteert uitdagingen en beperkingen in vergelijking met micro injectie van DNA/lipofection reagens in de oogtoppen van Xenopus embryo's. Bij muizen kan Transgenese worden gebruikt om genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken, maar de generatie van transgene muizen is duur en tijdrovend en transgene muizen zijn vaak aanwezig met ongewenste neveneffecten11. Transgene zebravis die exogene genen in optische neuronen uitdrukken, kan ook worden gecreëerd door plasmiden te injecteren in vroeg splijter stadium embryo's12. Dit proces vereist echter klonen van een specifieke promotor om genen uit te drukken in een mozaïek patroon in oogzenuw cellen in larven van zebravis12. De frequentie van expressie van exogeen DNA in optische neuronen in transgene zebravis is ook iets lager (< 30%) vergeleken met Xenopus kikkers die microgeïnjecteerd waren met DNA/liposomaal reagens (30 − 60%)12. In OVO is elektroporation ook gebruikt om genen in kleine aantallen optische neuronen in kuikens13uit te drukken. Echter, deze procedure is niet volledig karakteriseren mechanismen die optische projecties vast te stellen, omdat optiek axon arborization niet kan worden afgebeeld in intact, levende Chick embryo's. Tot slot hebben verschillende laboratoria elektroporation gebruikt om genen te transfect in een klein aantal optische neuronen in Xenopus kikkers14,15. Toch vereist elektroporation optimalisatie van apparatuur en protocollen (stimulator, elektroden, ruimtelijke en temporele patronen van Golf pulsen) dan die gebruikt voor micro injectie van DNA/lipofection reagens in de oogtoppen van Xenopus embryo's.
Wij en anderen gebruikten eerder de techniek van Microinjection/lipofectie van DNA in de eyebuds van Xenopus -embryo's om cel autonome signalerings mechanismen te bepalen die optische axon-arborization5,6, 7 , 8. in eerste instantie gebruikten we deze aanpak om de functies van de cadherin en WNT adaptor proteïne β-bovenarm in de optische axonale arboriisatie in Xenopus kikkers5,6te ontleden. In een studie toonden we aan dat β-bovendeel binding aan α-bovendeel en aan PDZ respectievelijk vereist is voor het initiëren en vorm geven van optische axonale Arbors in vivo5. In een tweede rapport lieten we zien dat de β-Bovenkabel in bindings gebieden voor α-bovendeel en GSK-3β-tegengesteld moduleren projectie patronen van ventrale optische axonale Arbors6. Meer recentelijk, we geïdentificeerd rollen voor de Wnt factor, adenomateuze poliposis coli (APC), bij het reguleren van de morfologische kenmerken van optische axonale Arbors in Xenopus kikkers7. Door de N-Terminal en de centrale domeinen van de APC, die β-bovenlijnen in stabiliteit en microtubulus samen met GFP in individuele optiek neuronen moduleren, gezamenlijk uit te drukken, hebben we gedeelde en duidelijke rollen vastgesteld voor deze APC-interactie domeinen op het filiaalnummer, lengte en hoek in optische axonale Arbors in vivo7. Een ander laboratorium gebruikt de Microinjection/lipofection-techniek om cel autonome rollen te bepalen voor signalering door de BDNF-receptor, trkb, in optische axonale Arbors in Xenopus kikkers8. Deze groep toonde aan dat expressie van een dominante-negatieve trkb verontrust vertakkingen en synaptische rijping in individuele optische axon Arbors in vivo8. Over het algemeen heeft de lipofection-techniek in Xenopus al de specifieke rollen van verschillende genen in optiek axon vertakkingen in de inheemse omgeving verlicht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

De primaire visuele projectie van kikkers van de aquatische kikker Xenopus laevis fungeert als een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van mechanismen die de ontwikkeling van neuronale connectiviteit reguleren. Tijdens de oprichting van de retino-tectal projectie, strekken de optische axonen zich uit het oog en navigeren door verschillende hersengebieden om hun doelweefsel, de optiek Tectum, te bereiken. Zodra de optiek axonen het Tectum betreden, werken ze met Terminal Arbors die functioneren om het aantal synaptische verbindingen te verhogen dat ze kunnen maken met doel-interneuronen in het Tectum. Hier beschrijven we een methode voor het uitdrukken van DNA-codering groene fluorescerende eiwitten (GFP), en winst-en verlies-van-functie-genconstructies, in optische neuronen (retinale ganglioncellen) in Xenopus -embryo's. We leggen uit hoe een gecombineerd DNA/lipofection-reagens microinjecteert in de oogtoppen van een dag oude embryo's, zodat exogene genen worden uitgedrukt in enkele of kleine aantallen optische neuronen. Door genen te taggen met GFP of co-injecteren met een GFP plasmide, kunnen terminale axonale Arbors van individuele optische neuronen met veranderde moleculaire signalering direct worden afgebeeld in de hersenen van intact, levende Xenopus kikkers enkele dagen later, en hun morfologie kunnen worden gekwantificeerd. Dit protocol maakt het mogelijk om cel-autonome moleculaire mechanismen te bepalen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van optische axon-arboriisatie in vivo.

Het in dit artikel beschreven protocol levert een slagingspercentage op van 30 − 60% van de geïnjecteerde Xenopus -embryo's die GFP (alleen of samen met een extra DNA-constructie) in één tot tien optische axonale Arbors uitdrukken. In Figuur 3tonen we representatieve confocale beelden van GFP uitdrukken van controle en Mutant optische axonale Arbors in intact Xenopus kikkers uit onze onlangs gepubliceerde studie7. Voor deze studie hebben we twee...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

In deze video laten we zien hoe exogene DNA-constructies kunnen worden uit te drukken in optische neuronen en hoe individuele GFP-uitdrukkende axonale arbors in intacte, levende Xenopus laevis kikkervisjes kunnen worden afgebeeld. Dit is een goedkope, eenvoudige procedure voor voorbijgaande celspecifieke transgenese die het mogelijk maakt celautonoome genfunctie in individuele optische axonale prieel arbors, ontwikkelen in een levend gewerveld modelsysteem. Het demonstreren van de procedure zal ik zijn, Sophia Dao, Research Assistant, en Dr. Tamira Elul, Lab Principal Investigator.Om te beginnen, voorzichtig clip de punt van een getrokken glazen micro capillaire pipet met fijne tangen. Vul de glazen micro capillaire pipet met minerale olie met behulp van een MICROFIL zodanig dat een kleine druppel minerale olie verschijnt op de afgeknipte punt van de micro pipet. Vul de glazen micro capillaire pipet halverwege met minerale olie.In een injector, uitwerpen van de zuiger halverwege en laad de getrokken glazen micro capillaire pipet in de injectiehouder. Breid vervolgens de zuiger volledig uit om te bevestigen dat de micro capillaire pipet sterk aan de injector is bevestigd en niet beweegt met de uitbreiding van de zuiger. Breng een drie microliter druppel van het DNA / DOTAP mengsel op een een centimeter vierkant vel paraffine papier.Onder een stereo ontleden microscoop, verplaats de punt van de glazen micro capillaire pipet in de DNA / DOTAP drop. Gebruik de vuloptie op het injectieapparaat, zuig langzaam de DNA/DOTAP-druppel in de glazen micro capillaire pipet. De grens tussen de minerale olie en de DNA/DOTAP-oplossing is zichtbaar in de glazen micro capillaire pipet door de lichte dekking van de DNA/DOTAP-oplossing.Stop indien nodig met het periodiek vullen van de micro capillaire pipet om de druk in de glazen micro capillaire pipet opnieuw te kunnen kalibreren. Ten eerste, in een 10 milliliter petrischaal gevuld met 0,1X MMR, handmatig de-vitellinize 10 fase 20 tot 24 Xenopus embryo's met fijne tangen. Pak de vitelline envelop in de taille om te voorkomen dat het verwonden van de embryo's.Met tangen in zowel de linker- als rechterhand van de onderzoeker, pop de bel van de vitelline envelop en laat het embryo uit de vitelline envelop. Zorg ervoor dat u de embryo's niet verwondt bij het verwijderen van de vitelline envelop. Gebruik vervolgens een plastic transfer pipet met een cut tip om vijf tot 10 gede-vitellinized fase 22 tot 24 embryo's over te brengen naar een 10 milliliter petrischaal gevuld met 1X MMR.Grijp onder een stereomicroscoop een van de gede-vitellinized embryo's in de Petrischaal met tangen en schik het embryo zo dat de voorste paal in het gezichtsveld wordt gericht. Oriënteer het embryo dan zodat het zijwaarts ligt en een van de oogknoppen van links naar rechts naar boven kijkt. Houd het embryo met de tang in de niet-dominante hand van de experimentator en met de dominante hand van de onderzoeker, introduceer de punt van de glazen micropipet van de ventrale of dorsale kant net onder de opperhuid in de oogknop.Injecteer tussen de 70 en 210 nanoliters van de DNA/DOTAP oplossing. Draai vervolgens het embryo om en voer dezelfde micro-injectie uit in de andere oogknop aan de contralaterale kant van het embryo. Injecteer beide oogknoppen van zes tot tien embryo's in elk experiment.Na micro-injectie, bewaar embryo's in een petrischaaltje met 1X MMR gedurende ongeveer 30 minuten om wondgenezing te vergemakkelijken. Breng na 30 minuten de geïnjecteerde embryo's met een plastic transferpipet over in een 0,1X MMR-oplossing met 0,001% bleekmiddel fenylthiocarbamide om pigmentatie te verminderen. Bedek de petrischaal met een deksel om de embryo's ongeveer vijf dagen te verkassen totdat de embryo's zich in de stadia 46 tot 47 tot kikkervisjes hebben ontwikkeld.Dit protocol levert een slagingspercentage op van 30 tot 60% van de geïnjecteerde Xenopus embryo's die GFP uitdrukken in één tot 10 optische axonale prieel arbors. Representatieve confocale beelden van GFP tonen de uitdrukkende controle en gemuteerde axonale prieel arbors in de intacte Xenopus kikkervisjes. Twee domeinmutanten van APC, APCNTERM en APBbeta-cat werden gekloond tot pCS2 plasmiden.Z-serie beelden van GFP controle en APC mutant axonale prieel arbors werden gereconstrueerd. Percelen van het aantal takken, de totale duur van de prieeltak en de gemiddelde taklengte bevestigen waargenomen verschillen tussen controle en APC-mutant die axonale prieelverbramen uitdrukken. Extra spreidingspercelen van het aantal vertakkingen versus gemiddelde taklengte met regressielijnen vertonen omgekeerde correlatie tussen deze parameters en optische axonale prieel arbors die APC-domeinen uitdrukken.De punt van de micro capillaire pipet moet correct zeer oppervlakkig in de oogknop worden ingebracht, zodat de grijze opperhuid die de oogknop boven de oogknop opzwelt tijdens elke micro-injectie. Deze procedure kan worden gebruikt om zowel label en verandering specifieke genetische functie in optische neuronen, terwijl de beoordeling van de groeiende, targeting, en vertakking van axonen van deze optische neuronen. Deze DNA micro-injectie en lipofection techniek heeft onderzoekers in ontwikkelingsneurobiologie toegestaan om cel autonome moleculaire mechanismen die optische axon arborization reguleren in intacte, levende Xenopus laevis kikkervisjes te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inductie van hypoxie in levende kikker en zebravis embryo&#39;s

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor ÃƒÆ’Ã…Â¸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analyse van transformerende groeifactor ß familiesplitsingsproducten uitgescheiden in de blastocoele van Xenopus laevis-embryo's

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Exploring Retinal Regeneration Mechanisms in the Xenopus Frog (Video) | JoVE

Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...