Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

אנו מודים Touro אוניברסיטת קליפורניה המכללה לרפואה אוסטאופתי על תמיכה במחקר שלנו. אנו מכירים את התלמידים הקודמים במעבדה (אסתר וו, גרגורי פנג, Taegun Jin, ג'ון סלים) שסייעו ליישם את טכניקת המיקרוהזרקה הזאת במעבדה שלנו. אנו אסירי תודה לד ר כריסטין הולט, שבמעבדאת הטכניקה הזאת, מיקרופיפוס ה-DNA וטכניקת הליפסד בעוברים התפתחו לראשונה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת טורו קליפורניה (פרוטוקול TUCA003TE01X).
1. השגת X. זריזה עוברים
<ol><li>השג X. זריזה העוברים על ידי ההזדווגות הטבעית של זוגות של זכר ונקבה צפרדעים מבוגרים מוכן גונדוטרופין כוריוני אנושי (HC...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לבטא במבנים DNA אקסוגני במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים וכיצד התמונה בודדים gfp המבטא האופטית סוכת עם איתות רגיל ומשתנה מולקולרית בשלמותו, החיים ראשנים של הצפרדע X . . אני מבין. אנו גם מסבירים כיצד לשחזר ולכמת את המבנה של gfp המבטא האופטית סוכת מתמונות שנתפסו...

במהלך הפיתוח של מערכת העצבים, אקסונים של נוירונים טרום סינפטיות לנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע לאזורי היעד שלהם. כאשר אקסונים לפלוש רקמות היעד שלהם, הם לבסס קשרים סינפטית עם היעד הפוסט נוירונים. בסוגים רבים של נוירונים, אקסונים להגדיל את המספר ואת ההיקף המרחבי של חיבורי סינפטית הם יכולים לעשות על ידי הגברת רשתות של סניפי מסופים או סוכת1. ההקרנה retino-tectal של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה הוא מודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור בדיקת מנגנונים בבסיס מסוף אקסון arborization קישוריות סינפטית2,3,4 . בודדים gfp ביטוי סוכת אופטיים עם איתות מולקולרי נורמלי ושונה ניתן לצפות ישירות בתוך שלמים, חי xenopus ראשנים5,6,7,8. כדי לבטא GFP בלבד או ביחד עם גירסאות באורך מלא או מקוצר של גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים, אנו משתמשים בטכניקה הכוללת מיקרוהזרקה/ליפופישל דנ א לתוך eyebuds של עוברי יום אחד עוברים9, 10. טכניקה זו פותחה במקור כדי לחקור מנגנונים של אקסון האופטי מציאת הצעיר xenopus tadpoles, והוא כבר הוחל על ידינו ואחרים כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים סלולריים בבסיס האקסון האופטי , הארבוריזציה בקספוס העמודים5,6,7,8,9,10
טכניקות חלופיות כדי לבטא גנים אקסוגני במספר קטן של נוירונים אופטיים פותחו במינים מודל אחרים, כמו גם ב -X זריזה. עם זאת, כל אחת מגישות אלה מציגה אתגרים ומגבלות בהשוואה למיקרו הזרקת דנ א/ליפופישל מגיב בeyebuds של עוברי קסנפוס . בעכברים, הטרנסגנזה יכולה לשמש כדי לבטא גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים, אבל הדור של עכברים טרנסגניים הוא יקר, עכברים הזמן לארוך ולעתים קרובות להציג עם תופעות לוואי לא רצויות11. בנוסף ניתן ליצור על ידי הזרקת פלסטלינה לתוך השלב המוקדםשל עוברימחשוף בעלי הצבע האופטי בנוירונים. עם זאת, תהליך זה דורש שיבוט של מיזם מסוים כדי לבטא גנים בתבנית פסיפס בנוירונים אופטיים בזחלים של דג הרימות12. תדירות הביטוי של דנ א אקסוגני בנוירונים אופטיים ב-דג זברה הוא גם נמוך במקצת (< 30%) שהיו מוזרקים באמצעות מגיב DNA/ליפוזומלי (30-60%) בשנת אלקטרופורציה שימש גם לבטא גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים באפרוחים13. עם זאת, הליך זה נכשל באפיון מלא של מנגנונים הקובעים הקרנות אופטיות, מכיוון שאין אפשרות ליצור תמונה של מנגנוני הראייה האופטיים ללא שינוי, עוברים בחורות חיות. בסופו של דבר, מספר מעבדות השתמשו באלקטרופורציה לגנים שונים למספר קטן של נוירונים אופטיים בקספוס טתרנים14,15. עם זאת, האלקטרופורציה דורשת אופטימיזציה של ציוד ופרוטוקולים (מלקחיים, אלקטרודות, דפוסים מרחביים ומרחבי של פולסים בגלי גל) מעבר לכך ששימשו להזרקות של דנ א/ליפופיציה מגיב לעיניים של עוברי קספוס .
אנחנו ואחרים בעבר השתמשנו בטכניקה של מיקרוהזרקה/ליפושל ה-DNA לתוך eyebuds של עוברי xenopus כדי לקבוע מנגנוני איתות אוטונומי האוטונומית הקמת אקסון אופטי5,6, מיכל סבן , 8. בתחילה השתמשנו בגישה זו כדי לנתח את הפונקציות של מתאם הקדהרין ו-wnt חלבון β-catenin בארבוריזציה אופטיתב- xenopus ראשנים עמודים 5,6. במחקר אחד, הראנו כי β-catenin קשירה ל α-catenin ו pdz נדרש, בהתאמה, עבור ייזום ועיצוב סוכת אופטיים בvivo5. בדו ח השני, הדגמנו כי התחומים β-catenin קשירה עבור α-catenin ו GSK-3β הקרנה לווסת את דפוסי ההקרנה של הפלבטים אופטיים הגחותיים6. לאחרונה, זיהינו תפקידים לגורם wnt, מאפייני פוליפוזיס coli (APC), בוויסות תכונות מורפולוגיות של סוכת אופטיים בתוך xenopus ראשנים7. על ידי שיתוף הביטוי את N-terminal ואת התחומים המרכזיים של APC לווסת יציבות β-catenin וארגון מיקרוכדורית יחד עם GFP בנוירונים בודדים אופטיים, החלטנו תפקידים משותפים וייחודיים עבור אלה תחומים האינטראקציה APC על מספר הסניף, אורך, וזווית בתוך סוכת אופטיים ב vivo7. מעבדה נוספת השתמשה בטכניקת המיקרוהזרקה/ליפוחות כדי לקבוע את תפקידי האוטונומית של התא עבור איתות על-ידי קולטן bdnf, trkb, ב-סיבי אופטיים ב- xenopus ראשנים8. קבוצה זו הראתה כי הביטוי של הסתעפות מודאג שלילי-TrkB המוני והתבגרות סינפטית בתוך האקסון האופטי הבודד ב vivo8. באופן כללי, טכניקת הליפיפוס ב- Xenopus כבר הרחיבה את התפקידים הספציפיים של גנים שונים בעלת הסתעפות אופטית בסביבה הטבעית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

ההקרנה החזותית העיקרית של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה משמש מערכת מודל מעולה למחקר מנגנונים המסדירים את ההתפתחות של קישוריות עצבית. במהלך הקמתה של ההקרנה retino-tectal, מרחיבים אופטיים להאריך מן העין ולנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע רקמת היעד שלהם, tectal אופטי. לאחר אקסונים אופטיים להיכנס tectum, הם מורכבים סוכת הטרמינל כי הפונקציה להגדיל את מספר הקשרים סינפטית הם יכולים לעשות עם היעד interneurons ב tectum. כאן, אנו מתארים שיטה לבטא קידוד ה-DNA חלבון פלורסנט ירוק (GFP), ו-להשיג ואובדן של פונקציה מבנים גנים, ב נוירונים אופטיים (בתאי גנגליון הרשתית) ב העוברים Xenopus . אנו מסבירים כיצד להחדיר מיקרו DNA/ליפופיהזיהום מגיב לתוך eyebuds של עוברים הישן יום אחד כגון גנים אקסוגני מבוטא במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים. על-ידי תיוג גנים עם gfp או שיתוף הזרקת עם gfp פלאבאמצע, הטרמינל סיבי סוכת של נוירונים בודדים אופטיים עם איתות מולקולרי שונה ניתן לדימות ישירות במוח של שלמים, חי xenopus ראשנים מספר ימים לאחר מכן, ואת מורפולוגיה שלהם ניתן לכמת. פרוטוקול זה מאפשר לקבוע את המנגנון המולקולרי האוטונומי התאי הנמצא בתוך הvivo.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מניב שיעור הצלחה של 30 ל-60% של מוזרקים העוברים ביטוי gfp (לבד או ביחד עם מבנים DNA נוספים) באחד עד עשר arbors אופטיים. באיור 3, אנו מציגים הנציג מיקוד תמונות של בקרת הביטוי gfp ו-מוטציה אופטיים מוטנטים בתוך שלמים של xenopus ראשנים מן המחקר שפורסם לאחרונ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles (Video) | JoVE

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של קסנופוס

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לבטא מבני דנ"א אקסוגניים בנוירונים אופטיים וכיצד לדמיין ארברים אקסונאליים אופטיים מבטאים GFP בודדים בערימות קסנופוס לאבס שלמות וחיות. זהו הליך זול ופשוט עבור transgenesis תאים ארעיים ספציפיים המאפשר קביעת תפקוד גנים אוטונומיים התא arbors אקסונאלי אופטי בודדים, פיתוח במערכת מודל בעלי חוליות חיים. בהדגמת ההליך יהיו אני, סופיה דאו, עוזרת מחקר, וד"ר טמירה אלול, חוקרת מעבדה.כדי להתחיל, בעדינות קליפ קצה של פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך עם מדפים עדין. למלא את פיפטה מיקרו נימי זכוכית עם שמן מינרלי באמצעות MICROFIL כך טיפה זעירה של שמן מינרלי מופיע בקצה קצוץ של פיפטה מיקרו. מלאו את פיגט המיקרו נימי הזכוכית באמצע הדרך בשמן מינרלי.במזרק, להוציא את הבוכנה באמצע הדרך ולטעון את פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך לתוך מחזיק ההזרקה. לאחר מכן להאריך את הבוכנה במידה המלאה כדי לאשר כי פיפטה נימי מיקרו מחובר בחוזקה מזרק ולא זז עם הרחבת הבוכנה. מעבירים טיפת מיקרוליטר של תערובת הדנ"א/DOTAP לגיליון ריבועי של נייר פרפין.תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, הזז את קצה פיפטה נימי מיקרו זכוכית לתוך טיפת DNA / DOTAP. השתמש באפשרות המילוי על מנגנון ההזרקה, למצוץ לאט את ה-DNA / DOTAP טיפה לתוך פיפטה נימי מיקרו זכוכית. הגבול בין השמן המינרלי לבין פתרון הדנ"א/DOTAP נראה בפיפיט המיקרו נימי הזכוכית בשל האטימות הקלה של תותב הדנ"א/DOTAP.במידת הצורך, להפסיק למלא את פיפטה נימי מיקרו מעת לעת כדי לאפשר את הלחץ פיפטה נימי מיקרו זכוכית לכייל מחדש. ראשית, בצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 0.1X MMR, ידנית de-vitellinize 10 שלב 20 כדי 24 עוברי קסנופוס עם ממטרים בסדר. אחוז במעטפת הויטליין במותניים כדי להימנע מפגיעה בעוברים.עם מטליות ביד שמאל ובימין של הניסוי, פופ הבועה של מעטפת vitelline ולשחרר את העובר מן המעטפה vitelline. יש לדאוג לא לפגוע בעוברים בעת הסרת מעטפת הויטלין. לאחר מכן השתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך להעביר חמישה עד 10 de-vitellinized שלב 22 כדי 24 עוברים לצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 1X MMR.תחת מיקרוסקופ סטריאו, לתפוס את אחד העוברים de-vitellinized בצלחת פטרי עם מטליות ולסדר את העובר, כך מוט anterior שלה הוא הצביע בשדה המבט. לאחר מכן לכוון את העובר כך שהוא שוכב באופן מאוחר ואחד ניצני העין משמאל לימין פונה כלפי מעלה. החזק את העובר עם המעצורים ביד הלא דומיננטית של הניסוי ועם היד הדומיננטית של הניסוי, להציג את קצה פיפטה מיקרו זכוכית מהצד הגחוני או הגבי ממש מתחת לאפידרמיס לתוך ניצן העין.להזריק בין 70 ל 210 nanoliters של פתרון DNA / DOTAP. ואז להפוך את העובר סביב ולבצע את אותה הזרקת מיקרו לתוך ניצן העין השני בצד ההפוך של העובר. להזריק את שני ניצני העין של שישה עד 10 עוברים בכל ניסוי.לאחר הזרקת מיקרו, לאחסן עוברים בצלחת פטרי עם 1X MMR במשך כ 30 דקות כדי להקל על ריפוי הפצע. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים מוזרק עם פיפטה העברת פלסטיק לתוך פתרון MMR 0.1X עם 0.001% הלבנת סוכן phenylthiocarbamide כדי להפחית פיגמנטציה. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה לתרבות העוברים במשך כחמישה ימים עד העוברים התפתחו ראשנים בשלבים 46 עד 47.פרוטוקול זה מניב שיעור הצלחה של 30 עד 60% של עוברי קסנופוס מוזרקים המבטאים GFP באחד עד 10 ארבורים אקסונאליים אופטיים. תמונות קונפוקליות מייצגות של GFP מראות את השליטה המביעים ואת ארברים אקסונאליים אופטיים מוטנטים בחלקי ראשן קסנופוס שלמים. שני מוטציות דומיין של APC, APCNTERM ו- APBbeta-cat משובטים לפלסמידים pCS2.תמונות מסדרת Z של בקרת GFP ו- APC מוטנטים אופטיים axonal arbors שוחזרו. חלקות של מספר ענפים, אורך ענף ארבור כולל, ואורך ענף ממוצע מאשרים הבדלים שנצפו בין שליטה לבין מוטנט APC המבטא ארברים אקסונאליים. חלקות פיזור נוספות של מספר ענפים לעומת אורך ענף ממוצע עם קווי רגרסיה מראות מתאם הפוך בין פרמטרים אלה לבין arbors אקסונאלי אופטי המבטאים תחומי APC.הקצה של פיפטה נימי מיקרו חייב להיות מוכנס כראוי באופן שטחי מאוד לתוך ניצן העין, כך האפידרמיס האפור overlying ניצן העין מתנפח במהלך כל הזרקת מיקרו. הליך זה יכול לשמש הן תווית ולשנות תפקוד גנטי ספציפי נוירונים אופטיים תוך הערכת גידול, מיקוד, הסתעפות של אקסונים מתאי עצב אופטיים אלה. הזרקת מיקרו DNA זו וטכניקת ליפוקציה אפשרה לחוקרים בנוירוביולוגיה התפתחותית לחקור מנגנונים מולקולריים אוטונומיים של תאים המווסתים את ארבוריזציה של אקסון אופטי בערימות קסנופוס לאביס שלמות וחיות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development (Video) | JoVE

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq (Video) | JoVE

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients (Video) | JoVE

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney (Video) | JoVE

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis (Video) | JoVE

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos (Video) | JoVE

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish (Video) | JoVE

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis (Video) | JoVE

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor ÃƒÅ¸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Exploring Retinal Regeneration Mechanisms in the Xenopus Frog (Video) | JoVE

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...