Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

हम अपने अनुसंधान का समर्थन करने के लिए Touro विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया कॉलेज Osteopathic चिकित्सा के लिए धन्यवाद. हम प्रयोगशाला में पिछले छात्रों को स्वीकार करते हैं (एस्तेर वू, ग्रेगरी पेंग, Taegun जिन, जॉन लिम) जो हमारी प्रयोगशाला में इस microinctions तकनीक को लागू करने में मदद की. हम डॉ क्रिस्टीन होल्ट के आभारी हैं, जिनकी प्रयोगशाला में Xenopus भ्रूण में इस डीएनए microinction /

यहाँ वर्णित सभी तरीकों को ट्यूरो विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया (प्रोटोकॉल ] TUCA003TE01X के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. एक्स लेविस भ्रूण प्राप्त करना
<ol><li>म...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

इस लेख में, हम प्रदर्शित कैसे exogenous डीएनए ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एकल या छोटी संख्या में constructs व्यक्त करने के लिए और कैसे छवि के लिए व्यक्तिगत GFP ऑप्टिक axonal arbors बरकरार में सामान्य और बदल आणविक संकेतन के साथ व्यक्त ...

तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान, presynaptic न्यूरॉन्स के axons मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के माध्यम से नेविगेट करने के लिए अपने लक्ष्य क्षेत्रों तक पहुँचने. जब axons अपने लक्ष्य ऊतकों पर आक्रमण, वे postsynaptic लक्ष्य न्यूरॉन्स के साथ synaptic कनेक्शन स्थापित. कई प्रकार के न्यूरॉन्स में, एक्सॉन ्स्समें से वे टर्मिनल शाखाओं या आर्बोर्स 1 के विस्तार नेटवर्क द्वारा कर सकते हैं कि synaptic कनेक्शन की संख्या और स्थानिक सीमा में वृद्धि होतीहै। जलीय मेंढक Xenopus laevis के टैडपोल के रेटिनो-टेक्टल प्रक्षेपण टर्मिनल एक्सॉन आर्बोराइजेशन और synaptic कनेक्टिविटी2,3,4 अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी मॉडल है . व्यक्तिगत GFP सामान्य और बदल आणविक संकेत के साथ ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त बरकरार में सीधे देखा जा सकता है, रहने वाले Xenopus tadpoles5,6,7,8. अकेले या एक साथ ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में जीन की पूर्ण लंबाई या छोटा संस्करणों के साथ GFP व्यक्त करने के लिए, हम एक दिन पुराने Xenopus भ्रूण9की eyebuds में माइक्रोइंजेक्शन / 10.यह तकनीक मूल रूप से युवा Xenopus टैडपोल्स में ऑप्टिक एक्सॉन पथ खोज के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, और तब से हमारे और दूसरों के द्वारा लागू किया गया है सेल-स्वायत्त आणविक तंत्र ऑप्टिक एक्सॉन अंतर्निहित निर्धारित करने के लिए एक्सिनोपस टैडपोल्स5,6,7,8,9,10में वृक्षीकरण .
ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में exogenous जीन व्यक्त करने के लिए वैकल्पिक तकनीक अन्य मॉडल प्रजातियों में विकसित किया गया है, साथ ही एक्स laevisमें. तथापि, इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण एक्सनोपस भ्रूणों की आंखों में डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक के माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में चुनौतियां और सीमाएँ प्रस्तुत करता है। चूहों में, ट्रांसजेनेसिस का उपयोग ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में जीनों को व्यक्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी महंगा है और समय लेने वाली और ट्रांसजेनिक चूहों अक्सर अवांछनीय दुष्प्रभावों के साथ मौजूद11. ऑप्टिक न्यूरॉन्स में बहिर्जात जीनों को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक जेब्राफ़िश को प्रारंभिक क्लीवेज अवस्थाभ्रूणों मेंप्लाज्मिड इंजेक्शन लगाकर भी बनाया जा सकता है . हालांकि, इस प्रक्रिया के लिए एक विशिष्ट प्रमोटर की क्लोनिंग की आवश्यकता होती है जो जेब्राफिश लार्वा 12 में ऑप्टिक न्यूरॉन्स में मोज़ेक पैटर्न में जीनों को व्यक्त करताहै। ट्रांसजेनिक जेब्राफ़िश में ऑप्टिक न्यूरॉन्स में exogenous डीएनए की अभिव्यक्ति की आवृत्ति भी कुछ कम है ([lt;30%) Xenopus tadpoles की तुलना में है कि डीएनए के साथ microined थे/ ओवो इलेक्ट्रोपोट्रेशन में भी13चूजों में ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में जीनों को व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया गया है . हालांकि, इस प्रक्रिया को पूरी तरह से तंत्र है कि ऑप्टिक अनुमानों की स्थापना की विशेषता में विफल रहा है क्योंकि ऑप्टिक एक्सॉन arborization बरकरार, रहने वाले लड़की भ्रूण में छवि नहीं किया जा सकता है. अंत में, कई प्रयोगशालाओं ने जीनों को ट्रांसफेक्ट करने के लिए इलेक्ट्रोपोट्रेशन का उपयोग किया है जो कि एक्सिनोपस टैडपोल्स14,15में ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में होता है । फिर भी, इलेक्ट्रोपोरोनेशन के लिए उपकरणों और प्रोटोकॉलों (तरंग दालों के स्टिम्युलेटर, इलेक्ट्रोड, स्थानिक और अस्थायी पैटर्न) के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जिसका उपयोग Xenopus भ्रूणों की आंखों में डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक के माइक्रोइंजेक्शन के लिए किया जाता है।
हम और अन्य लोगों ने पहले एक्सनोपस भ्रूणों की आंखों में सूक्ष्म इंजेक्शन/लिपोफेक्शन की तकनीक का उपयोग सेल स्वायत्त संकेतन तंत्र का निर्धारण करने के लिए किया जो ऑप्टिक एक्सॉन आर्बोाइजेशन5,6, 7 , 8.हमने शुरू में इस दृष्टिकोण का उपयोग जेनोपस टैडपोल्स5,6में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोाइजेशन में कैदरिन और वंट एडेप्टर प्रोटीन के कार्यों को विभाजित करने के लिए किया था. एक अध्ययन में हमने यह दिखाया कि विवो5में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोजरों को आरंभ करने और उसे आकार देने के लिए क्रमशः जेड-कैटेनिन और पीडीजेड के लिए जेड-कैटेनिन के लिए बाध्यकारी होने की आवश्यकता है। दूसरी रिपोर्ट में हमने यह प्रदर्शित किया कि $-कैटिनिन तथा जीएसके-3 के लिए जेड-कैटिनन बाध्यकारी डोमेन, अधर ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स6के विपरीत रूप से मॉडुलेट प्रक्षेप पैटर्न। हाल ही में, हमने Xenopus tadpoles7में ऑप्टिक ऐक्सोनल आर्बोर्स की आकृतिक विशेषताओं को विनियमित करने में Wnt कारक, एडेनोमैटस पोलिपोसिस कोलाई (एपीसी) के लिए भूमिकाओं की पहचान की। APC के N-terminal और केंद्रीय डोमेन को सह-व्यक्त करके जो अलग-अलग ऑप्टिक न्यूरॉन्स में GFP के साथ-साथ जेड-कैटेनिन स्थिरता और माइक्रोट्युबल संगठन को मॉडुलित करते हैं, हमने शाखा संख्या पर इन एपीसी इंटरैक्शन डोमेन के लिए साझा और अलग-अलग भूमिकाएं निर्धारित की हैं, लंबाई, और विवो7में ऑप्टिक axonal arbors में कोण . एक अन्य प्रयोगशाला ने एक्सनपोस टैडपोल्स8में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स में बीडीएनएफ रिसेप्टर, टी.के.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी. रिसेप्टर द्वारा संकेतन के लिए सेल स्वायत्त भूमिकाओं का निर्धारण करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन/लिपोफेक्शन तकनीक का उपयोग किया। इस समूह ने यह दिखाया कि विवो8में व्यक्तिगत ऑप्टिक एक्सॉन आर्बोमेंस में एक प्रमुख-नकारात्मक TrkB क्षुब्ध शाखाकरण और synaptic परिपक्वता की अभिव्यक्ति. कुल मिलाकर, Xenopus में lipofection तकनीक पहले से ही देशी वातावरण में ऑप्टिक एक्सॉन शाखाओं में विभिन्न जीन की विशिष्ट भूमिकाओं को प्रकाशित किया है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

जलीय मेंढक Xenopus laevis के टैडपोल के प्राथमिक दृश्य प्रक्षेपण तंत्र है कि न्यूरॉन कनेक्टिविटी के विकास को विनियमित अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है. रेटिनो-टेक्टल प्रक्षेपण की स्थापना के दौरान, ऑप्टिक एक्सॉन आंखों से विस्तार करते हैं और अपने लक्ष्य ऊतक, ऑप्टिक टेकटम तक पहुंचने के लिए मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के माध्यम से नेविगेट करते हैं। एक बार ऑप्टिक एक्सॉन tectum में प्रवेश, वे टर्मिनल arbors कि कार्य synaptic कनेक्शन वे tectum में लक्ष्य interneurons के साथ कर सकते हैं की संख्या में वृद्धि करने के लिए विस्तृत. यहाँ, हम डीएनए एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए एक विधि का वर्णन, और लाभ- और हानि के समारोह जीन constructs, ऑप्टिक न्यूरॉन्स में (रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं) Xenopus भ्रूण में. हम बताते हैं कि एक दिन पुराने भ्रूणों की आंखों में संयुक्त डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक को माइक्रोइंजेक्ट कैसे करें ताकि बाह्य जीन ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एकल या छोटी संख्या में व्यक्त किए जा सकें। GFP के साथ जीन टैगिंग या सह एक GFP प्लाज्मिड के साथ इंजेक्शन द्वारा, बदल आणविक संकेतन के साथ व्यक्तिगत ऑप्टिक न्यूरॉन्स के टर्मिनल axonal arbors बरकरार के दिमाग में सीधे छवि बनाई जा सकती है, Xenopus tadpoles रहने वाले कई दिन बाद, और उनकी आकृति विज्ञान मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल सेल स्वायत्त आणविक तंत्र है कि विवो में ऑप्टिक एक्सॉन arborization के विकास underlie के निर्धारण के लिए अनुमति देता है.

इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल एक से दस ऑप्टिक axonal arbors में GFP (अलोन या एक अतिरिक्त डीएनए निर्माण के साथ) व्यक्त इंजेक्शन Xenopus भ्रूण के 30 डिग्री 60% की सफलता दर पैदावार. चित्रा 3 में, हम GFP के प्रतिनिधि conf...

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Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि एक दिन पुराने Xenopus लेविस भ्रूणों की आंखों में डीएनए/DOTAP मिश्रण को माइक्रोइंजेक्ट कैसे किया जाए, और कैसे व्यक्तिगत ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोडॉर्स को टेक्सटल मिडब्रेन में व्यक्त किया जाए और कैसे बनाएं। बरकरार, जीवित Xenopus tadpoles.

Xenopus laevis भ्रूण में Eyebuds में डीएनए का माइक्रोइंजेक्शन और GFP के इमेजिंग ऑप्टिक Axonal Arbors में बरकरार, रहने वाले Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

इस वीडियो में, हम प्रदर्शित करते हैं कि ऑप्टिक न्यूरॉन्स में एक्सोजेनस डीएनए निर्माण कैसे व्यक्त करें और व्यक्तिगत जीएफपी को कैसे छवि दें- ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स को अक्षुण्ण, जीवित ज़ेनोपस लेविस टैडपोल में व्यक्त करें। यह क्षणिक सेल-विशिष्ट ट्रांसजेनेसिस के लिए एक सस्ती, सरल प्रक्रिया है जो व्यक्तिगत ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स में सेल स्वायत्त जीन कार्य के निर्धारण की अनुमति देती है, जो एक जीवित कशेरुकी मॉडल प्रणाली में विकसित होती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन अपने आप को होगा, सोफिया डीएओ, अनुसंधान सहायक, और डॉ तामीरा Elul, प्रयोगशाला प्रमुख अन्वेषक ।शुरू करने के लिए, धीरे-धीरे एक खींचा हुआ ग्लास माइक्रो केशिका पिपेट की नोक को ठीक संदंश के साथ क्लिप करें। माइक्रोफिल का उपयोग करके खनिज तेल के साथ ग्लास माइक्रो कैपिलरी पिपेट को बैकफिल करें ताकि खनिज तेल की एक छोटी सी बूंद माइक्रो पिपेट के काटा गया टिप पर दिखाई दे। खनिज तेल के साथ आधे रास्ते ग्लास माइक्रो केशिका पिपेट भरें।एक इंजेक्टर में, प्लंजर को आधे रास्ते से बाहर निकालें और खींचे गए ग्लास माइक्रो केशिका पिपेट को इंजेक्शन धारक में लोड करें। फिर प्लंजर को पूरी हद तक विस्तारित करने के लिए पुष्टि करें कि माइक्रो केशिका पिपेट इंजेक्टर से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है और प्लंजर के विस्तार के साथ आगे नहीं बढ़ता है। डीएनए/DOTAP मिश्रण की एक तीन माइक्रोलीटर ड्रॉप पैराफिन पेपर की एक इंच वर्ग शीट पर स्थानांतरित करें ।एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, कांच माइक्रो केशिका पिपेट की नोक को डीएनए/DOTAP ड्रॉप में ले जाएं । इंजेक्शन उपकरण पर भरने के विकल्प का उपयोग करें, धीरे से ग्लास माइक्रो केशिका पिपेट में डीएनए/DOTAP ड्रॉप चूसना । डीएनए/DOTAP समाधान की मामूली अस्पष्टता के कारण खनिज तेल और डीएनए/DOTAP समाधान के बीच की सीमा ग्लास माइक्रो केशिका पिपेट में दिखाई देती है ।यदि आवश्यक हो, तो ग्लास माइक्रो केशिलरी पिपेट में दबाव को पुनः कैलिब्रेट करने की अनुमति देने के लिए समय-समय पर माइक्रो केशिका पिपेट भरना बंद कर दें। सबसे पहले, 0.1X एमएमआर से भरे 10 मिलीलीटर पेट्री डिश में, मैन्युअल रूप से 10 चरण 20 से 24 ज़ेनोपस भ्रूण ठीक संदंश के साथ डी-विटेललाइनाइज करें। भ्रूण को घायल करने से बचने के लिए कमर पर विटेललाइन लिफाफा पकड़ें।दोनों प्रयोगकर्ता के बाएं और दाएं हाथ में संदंश के साथ, विटेललाइन लिफाफे के बुलबुले पॉप और vitelline लिफाफे से भ्रूण जारी । विटेललाइन लिफाफा निकालते समय भ्रूण को घायल न करें, इसका ध्यान रखें। फिर 1X एमएमआर से भरे 10 मिलीलीटर पेट्री डिश में पांच से 10 डी-vitellinized स्टेज 22 से 24 भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक कट टिप के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें।एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, पेम्प्स के साथ पेट्री डिश में डी-विटेलिनाइज्ड भ्रूण में से एक को समझें और भ्रूण की व्यवस्था करें ताकि इसके पूर्वकाल ध्रुव को देखने के क्षेत्र में इंगित किया जा सके। फिर भ्रूण को उन्मुख करें ताकि यह पार्श्व में पड़ा रहे और इसकी बाईं से दाएं आंख की कलियों में से एक ऊपर की ओर आ रही है। प्रयोगकर्ता के गैर-घरेलू हाथ में संदंश के साथ भ्रूण को पकड़ें और प्रयोगकर्ता के प्रमुख हाथ से, आंखों की कली में एपिडर्मिस के ठीक नीचे वेंट्रल या पृष्ठीय पक्ष से ग्लास माइक्रो पिपेट की नोक पेश करें।डीएनए/DOTAP समाधान के ७० से २१० नैनोलीटर के बीच इंजेक्ट करें । फिर भ्रूण को चारों ओर घुमाएं और भ्रूण के कॉन्ट्रालेटरल साइड पर दूसरी आंख की कली में एक ही माइक्रो इंजेक्शन करें। प्रत्येक प्रयोग में छह से 10 भ्रूण की दोनों आंखों की कलियों को इंजेक्ट करें।माइक्रो इंजेक्शन के बाद, घाव भरने की सुविधा के लिए लगभग 30 मिनट के लिए 1X एमएमआर के साथ एक पेट्री डिश में भ्रूण स्टोर करें। 30 मिनट के बाद, इंजेक्शन भ्रूण को प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट के साथ 0.001% ब्लीचिंग एजेंट फिनेथियोकारबामाइड के साथ 0.1X एमएमआर समाधान में स्थानांतरित करें ताकि पिगमेंटेशन को कम किया जा सके। लगभग पांच दिनों के लिए भ्रूण संस्कृति के लिए एक ढक्कन के साथ पेट्री पकवान कवर जब तक भ्रूण चरणों में tadpoles में विकसित किया है ४६ से ४७ ।यह प्रोटोकॉल एक से 10 ऑप्टिक अक्षीय आर्बर में जीएफपी व्यक्त करने वाले इंजेक्शन ज़ेनोपस भ्रूण के 30 से 60% की सफलता दर देता है। जीएफपी के प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां अक्षुण्ण ज़ेनोपस टैडपोल में व्यक्त नियंत्रण और उत्परिवर्ती ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स दिखाती हैं। एपीसी, एपीपीसीटीआरएम और एपीबीबेटा-कैट के दो डोमेन म्यूटेंट को पीसी2 प्लाज्मिड्स में क्लोन किया गया था।जीएफपी नियंत्रण और एपीसी उत्परिवर्ती ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स की जेड-सीरीज छवियों को खंगाला गया। शाखाओं की संख्या, कुल आर्बर शाखा लंबाई, और मतलब शाखा लंबाई के भूखंड नियंत्रण और एपीसी उत्परिवर्ती के बीच देखे गए मतभेदों की पुष्टि करते हैं जो अक्षीय आर्बर व्यक्त करते हैं। प्रतिगमन लाइनों के साथ शाखाओं बनाम मतलब शाखा लंबाई की संख्या के अतिरिक्त स्कैटर भूखंड एपीसी डोमेन व्यक्त करते हुए इन मापदंडों और ऑप्टिक अक्षीय आर्बर्स के बीच विपरीत संबंध दिखाते हैं।माइक्रो केशिका पिपेट की नोक को आंखों की कली में बहुत सतही रूप से सही ढंग से डाला जाना चाहिए ताकि प्रत्येक माइक्रो इंजेक्शन के दौरान आंखों की कली को ऊंचा करने वाला ग्रे एपिडर्मिस फूल जाए। इस प्रक्रिया को इन ऑप्टिक न्यूरॉन्स से एक्सॉन की बढ़ती, लक्ष्यीकरण और शाखाओं में बंटी का आकलन करते समय ऑप्टिक न्यूरॉन्स में विशिष्ट आनुवंशिक कार्य को लेबल और बदलने दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस डीएनए माइक्रो इंजेक्शन और लिपोफेक्शन तकनीक ने विकासात्मक न्यूरोबायोलॉजी में शोधकर्ताओं को सेल स्वायत्त आणविक तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति दी है जो ऑप्टिक एक्सोन आर्बोराइजेशन को बरकरार, जीवित ज़ेनोपस लेविस टैडपोल में विनियमित करते हैं ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

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हेरफेर और<em&gt; इन विट्रो</emके&gt; परिपक्वता<em&gt; Xenopus laevis</emIntracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन द्वारा पीछा&gt; Oocytes, भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

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Chromatin नियामकों और अमेरिका में जीनोम चौड़ा स्नैपशॉट<em&gt; Xenopus</emचिप Seq द्वारा&gt; भ्रूण

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

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Confocal विश्लेषण का उपयोग करना<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt और श्श्श Morphogen ढ़ाल के Modulators जांच

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

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विकसित करने के लिए Microinjection लक्ष्य करने के लिए तकनीक<em&gt; Xenopus</em&gt; किडनी

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

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भ्रूणीय एंजियोजेनेसिस के विज़ुअलाइज़ेशन और क्वांटिटेटिव विश्लेषण<em&gt; ज़ीनोपस ट्रॉपिकलिस</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

रहने वाले मेंढक और ज़ेबराफिश भ्रूण में हाइपोक्सिया का प्रेरण

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

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फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग और उसके बाद सिटू संकरण में ज़ेनोपस लेवेइस में न्यूरोनल अग्रदूत लक्षण वर्णन के लिए

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor ÃƒÆ’Ã…Â¸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

विकास कारक को बदलने का विश्लेषण परिवार दरार उत्पादों Xenopus laevis भ्रूण के Blastocoele में गुप्त

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Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Exploring Retinal Regeneration Mechanisms in the Xenopus Frog (Video) | JoVE

ज़ेनोपस टैडपोल में रेटिना चोट मॉडल उत्पन्न करना

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...