Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

우리는 우리의 연구를 지원하기위한 정골 의학의 투로 대학 캘리포니아 대학 감사합니다. 우리는 우리 실험실에서이 미세 주입 기술을 구현하는 데 도움을 준 실험실 (에스더 우, 그레고리 펭, 진 태건 진, 존 림)의 이전 학생들을 인정합니다. 제노푸스 배아의 이 DNA 미세 주사/지질 검사 기술이 처음 개발된 크리스틴 홀트 박사에게 감사드립니다.

여기에 설명된 모든 방법은 투로 대학 캘리포니아의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 # TUCA003TE01X).
1. X. 래비스 배아 획득
<ol><li>인간 융모성 생식샘 자극호르몬(HCG)으로 프라이밍된 수컷 과 암컷 성개구리 쌍의 자연적인 짝짓기로 X. laevis 배아를 얻거나, HCG로 프라이밍된 여성 성인 개구리에서 흘린 난자의 체외 수정에 의?...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-and+C-terminal+domains+of+&#946;-catenin,+respectively,+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">N-and C-terminal domains of &#946;-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li><li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;+and+&#945;-catenin+binding+regions+of+&#946;-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection.">GSK-3&#946; and &#945;-catenin binding regions of &#946;-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li><li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number,+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo.">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System.">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li><li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zahn+drawings:+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development.">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li><li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

이 기사에서는 단일 또는 소수의 광학 뉴런에서 외인성 DNA 구조를 표현하는 방법과 개구리 X의 살아있는 올챙이에서 정상 적이고 변경 된 분자 신호로 광학 축색 아버를 표현하는 개별 GFP를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. . 라에비스. 우리는 또한 생체 내에서 캡처 한 이미지에서 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 형태를 재구성하고 정량화하는 방법에 대해설명합니다. 소수의 광학 뉴런...

신경계의 발달 도중, 시냅스 전 신경의 축세포는 그들의 표적 지역에 도달하기 위하여 두뇌의 다양한 지구를 통해서 탐색합니다. 축 삭 그들의 대상 조직을 침공 하는 때, 그들은 synaptic 대상 뉴런시 연결을 설정. 뉴런의 많은 모형에서, 축세포는 말단 가지 또는 아버1의정교하게 네트워크를 정교하게 하여 만들 수 있는 시냅스 연결의 수 그리고 공간 넓이 증가합니다. 수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 레티노 tectal 투영은 말단 축삭 수목화 및 시냅스 연결성2,3,4의 근본적인 메커니즘을 검사하기위한 강력한 척추 동물 모델입니다. . 정상 및 변경된 분자 신호로 광학 축색 아버를 발현하는 개별 GFP는 그대로 관찰할 수 있으며, 살아있는 제노푸스 올챙이5,6,7,8. GFP를 단독으로 또는 소수의 광학 뉴런에서 전체 길이 또는 잘린 유전자 버전과 함께 표현하기 위해, 우리는 1 일 오래 된 제노푸스 배아의 안구에 DNA의 미세 주입 / 지질 을 포함하는 기술을 사용합니다9, 10. 이 기술은 원래 젊은 제노푸스 올챙이에서 광학 축색 경로 발견의 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었으며, 이후 광학 축작의 기본 세포 자율 분자 메커니즘을 결정하기 위해 우리와 다른 사람에 의해 적용되었습니다 제노푸스 올챙이5,6 ,7,8,9,10의수료화 .
소수의 광학 뉴런에서 외인성 유전자를 발현하는 대체 기술은 X. laevis뿐만아니라 다른 모델 종에서도 개발되었다. 그러나, 이 접근의 각각은 제노푸스 태아의 안구부에서 DNA/lipofection 시약의 미세 주입과 비교될 때 도전과 한계를 제시합니다. 마우스에서, 트랜스제네시스는 소수의 광학 뉴런에서 유전자를 발현하는데 사용될 수 있지만, 형질전환 마우스의 생성은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리고 형질전환 마우스는 종종 바람직하지 않은부작용(11)으로존재한다. 광학 뉴런에서 외인성 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬는 또한 초기 절단 단계배아(12)에플라스미드를 주입함으로써 생성될 수 있다. 그러나, 이러한 과정은 제브라피쉬유충(12)에서광학 뉴런에서 모자이크 패턴으로 유전자를 발현하기 위해 특정 프로모터의 복제를 요구한다. 형질전환 제브라피시의 광학 뉴런에서 외인성 DNA의 발현 빈도도 다소 낮습니다(<30%). DNA/리포좀 시약(30−60%)으로 미세주입된 제노푸스 올챙이와비교하면 12. 오보에서 전기천공은 또한 병아리13에서소수의 광학 뉴런에서 유전자를 발현하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이 절차는 광학 축사 arborization가 살아있는 병아리 배아에서 상연될 수 없기 때문에 광학 투영을 설치하는 기계장치를 완전히 특성화하는 것을 실패했습니다. 마지막으로, 몇몇 실험실은 제노푸스 올챙이14,15에있는 소수의 광학 뉴런으로 유전자를 트랜스펙트하기 위하여 전기천기를 이용했습니다. 그러나 전기포공은 제노푸스 배아의 안구에 DNA/지방 흡입 시약을 미세 주입하는 데 사용되는 것 이상으로 장비 및 프로토콜(자극기, 전극, 공간 및 시간적 파펄스 패턴)의 최적화가 필요합니다.
우리와 다른 사람들은 이전에 광학 축세포 arborization5,6을설치하는 세포 자율 신호 메커니즘을 결정하기 위해 제노푸스 배아의 안구에 DNA의 미세 주입 / lipofection의 기술을사용했습니다. 7명 , 8. 우리는 처음에 제노푸스 올챙이5,6에서광학 축색 아버화에서 Cadherin 및 Wnt 어댑터 단백질 β-카테닌의 기능을 해부하기 위해이 방법을사용했다. 한 연구에서는, β-카테닌이 α-카테닌 및 PDZ에 결합하는 것을 각각 생체 내에서 광학 축삭 아버를 시작하고 형성하기 위해 필요하다는 것을 보여주었다5. 제2 보고에서, 우리는 α-카테닌 및 GSK-3β에 대한 β-카테닌 결합 도메인이 복부 광학 축삭 아버의 투영 패턴을 반대로 조절한다는 것을입증했다 6. 최근에는 제노푸스 올챙이7에서광학 축색 아버의 형태학적 특징을 조절하는 Wnt 요인, 선종성 poliposis coli (APC)에 대한 역할을 확인했습니다. 개별 광학 뉴런에서 GFP와 함께 β-카테닌 안정성 및 미세소관 조직을 조절하는 APC의 N-말단 및 중앙 도메인을 공동 표현함으로써, 우리는 분기 번호에서 이러한 APC 상호 작용 도메인에 대한 공유및 뚜렷한 역할을 결정했습니다. 길이, 및 생체 내 축축아의 각도7. 또 다른 실험실은 제노푸스 올챙이8의광학 축색 아버에서 BDNF 수용체, TrkB에 의한 신호에 대한 세포 자율적 역할을 결정하기 위해 미세 주입/지질 주입 기술을 사용했다. 이 그룹은 생체 내 개별 광학 축아에서 지배적 인 음의 TrkB 교란 분기 및 시냅스 성숙의 발현을 보여주었다8. 전반적으로, 제노푸스의 지질 기술은 이미 네이티브 환경에서 광학 축색 분지에서 다른 유전자의 특정 역할을 조명했다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 주요 시각적 투영은 신경 연결의 발달을 통제하는 기계장치를 공부하기위한 훌륭한 모델 시스템 역할을합니다. 레티노-tectal 투영의 설치 도중, 광학 축색은 눈에서 확장하고 그들의 표적 조직, 광학 tectum에 도달하기 위하여 두뇌의 별개의 지구를 통해서 탐색합니다. 일단 광학 축새가 tectum에 들어가면, 그(것)들은 tectum에 있는 표적 interneurons로 만들 수 있는 시냅스 연결의 수를 증가하기 위하여 기능하는 말단 아버를 정교하게 합니다. 여기서, 우리는 제노푸스 배아에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 DNA를 발현하는 방법, 및 이득-기능 상실 유전자 구성, 광뉴런(망막 신경절 세포)을 발현하는 방법을 설명한다. 우리는 외인성 유전자가 광학 뉴런의 단 하나 또는 작은 수에서 표현되는 그래야 1 일 오래된 태아의 안구에 결합된 DNA/lipofection 시약을 마이크로 주입하는 방법을 설명합니다. GFP와 유전자를 태그하거나 GFP 플라스미드와 공동 주입함으로써, 변형 된 분자 신호를 가진 개별 광학 뉴런의 말단 축삭 아버는 며칠 후 살아있는 제노푸스 올챙이, 그리고 그들의 형태에 따라 그대로 뇌에서 직접 이미지화 될 수 있습니다. 정량화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 광학 축색 아버라이드의 개발을 뒷받침하는 세포 자율 분자 메커니즘의 결정을 가능하게 합니다.

이 문서에 설명된 프로토콜은 GFP를 발현하는 주입된 제노푸스 배아의 30-60%의 성공률을 산출합니다(단독으로 또는 추가 DNA 구성과 함께) 1~10개의 광학 축색아수목. 도 3에서,우리는 우리의 최근 출판 된 연구7에서그대로 제노푸스 올챙이에서 제어 및 돌연변이 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 대표적인 공초점 이미지를 보여줍니다. 이 연구를 ?...

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Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles (Video) | JoVE

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

이 비디오에서는 시신경에서 외인성 DNA 구조를 표현하는 방법과 GFP를 표현하는 광학 축산 아보르를 그대로, 살아있는 제노푸스 라예비스 올챙이를 이미지하는 방법을 보여줍니다. 이것은 살아있는 척추동물 모형 시스템에서 발전하는 개별 적인 광학 축산 식에서 세포 자율 유전자 기능의 측정을 허용하는 일시적인 세포 특정 전염을 위한 저렴하고 간단한 절차입니다. 절차를 시연하는 것은 나 자신, 소피아 다오, 연구 조수, 박사 타미라 엘룰, 실험실 수석 연구원이 될 것입니다.시작하려면 당겨져 있는 유리 마이크로 모세관 파이펫 의 끝을 미세한 집게로 부드럽게 잘라냅니다. 마이크로필을 사용하여 미네랄 오일로 유리 마이크로 모세관 파이펫을 백필하여 마이크로 파이펫의 잘린 끝에 작은 미네랄 오일 방울이 나타납니다. 유리 마이크로 모세관 파이펫을 미네랄 오일로 반쯤 채웁니다.인젝터에서 플런저를 반쪽으로 배출하고 당겨진 유리 마이크로 모세관 파이펫을 주입 홀더에 적재합니다. 그런 다음 플런저를 전체 범위로 확장하여 마이크로 모세관 파이펫이 인젝터에 강하게 부착되어 플런저의 연장과 함께 움직이지 않는지 확인합니다. DNA/DOTAP 혼합물의 마이크로리터 드롭 3개를 파라핀 용지의 1인치 정사각형 시트에 전달합니다.스테레오 해부 현미경에서 유리 마이크로 모세관 파이펫의 끝을 DNA /DOTAP 드롭으로 이동합니다. 주사 장치에 충진 옵션을 사용하여 DNA/DOTAP 드롭을 유리 마이크로 모세관 파이펫에 천천히 빨아 넣습니다. 미네랄 오일과 DNA/DOTAP 용액 사이의 경계는 DNA/DOTAP 용액의 약간의 불투명도로 인해 유리 마이크로 모세관 파이펫에서 볼 수 있습니다.필요한 경우, 유리 마이크로 모세관 파이펫의 압력이 재보정할 수 있도록 주기적으로 마이크로 모세관 파이펫을 채우는 것을 중단하십시오. 첫째, 0.1X MMR로 채워진 10 밀리리터 페트리 접시에서 10단계 20~24개의 제노푸스 배아를 미세한 집게로 수동으로 비활성화합니다. 배아를 손상시키지 않도록 허리에 비텔린 봉투를 잡습니다.실험자의 좌우 양쪽에 집게를 사용하면 비텔린 봉투의 거품을 터뜨리고 진동 봉투에서 배아를 방출합니다. 비텔린 봉투를 제거할 때 배아를 다치게 하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 절단 팁이 있는 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 5~10개의 진동단계 22~24개의 배아를 1X MMR로 채워진 10밀리리터 페트리 접시로 옮길 수 있습니다.스테레오 현미경의 밑에, 포셉을 가진 페트리 접시에 있는 탈 유리화한 배아 의 한개를 붙잡고 그것의 전방 극이 시야에서 뾰족할 수 있도록 배아를 배열합니다. 그런 다음 배아를 우회적으로 거짓말을하고 왼쪽에서 오른쪽 눈 싹 중 하나가 위쪽으로 향하고 있도록 배아를 지향합니다. 실험자의 지배적인 손에 집게로 배아를 잡고 실험자의 지배적 인 손으로, 눈 싹에 표피 바로 아래 복부 또는 등쪽 에서 유리 마이크로 파이펫의 끝을 소개합니다.DNA/DOTAP 용액의 70~210나노리터를 주입한다. 그런 다음 배아를 돌리고 동일한 마이크로 주입을 배아의 모순된 쪽에 있는 다른 눈싹으로 수행합니다. 각 실험에서 6~10개의 배아의 눈싹을 모두 주입합니다.마이크로 주입 후, 상처 치유를 용이하게하기 위해 약 30 분 동안 1X MMR과 페트리 접시에 배아를 저장합니다. 30분 후, 주입된 배아를 플라스틱 이송 파이펫으로 0.1X MMR 용액으로 0.001%의 표백제 페닐티오카르바미드를 사용하여 색소 침착을 감소시게 한다. 태아가 46~47단계에서 올챙이로 발전할 때까지 약 5일 동안 배아를 배양하기 위해 뚜껑을 뚜껑으로 덮고 있습니다.이 프로토콜은 1-10 개의 광학 축산 식에서 GFP를 표현하는 주입 된 제노푸스 배아의 성공률을 30~ 60 %의 성공률을 산출합니다. GFP의 대표적인 공초점 이미지는 그대로 제노푸스 올챙이에서 표현 제어 및 돌연변이 광학 축산 식을 보여줍니다. APC, APCNTERM 및 APBbeta 고양이의 두 개의 도메인 돌연변이가 pCS2 플라스미드로 복제되었습니다.GFP 제어 및 APC 돌연변이 광학 축산식 소목의 Z 시리즈 이미지가 재구성되었습니다. 분기 수, 총 식목 분기 길이 및 평균 분기 길이의 플롯은 축축아를 표현하는 제어와 APC 돌연변이 사이의 관찰된 차이를 확인합니다. 회귀 선이 있는 평균 분기 길이에 비해 분기 수의 추가 분산 플롯은 APC 도메인을 표현하는 이러한 매개 변수와 광학 축산 식소 사이의 역 상관 관계를 보여 준다.마이크로 모세관 파이펫의 끝은 각 마이크로 주입 중에 눈싹을 덮치는 회색 표피가 팽창되도록 눈 싹에 매우 피상적으로 삽입해야합니다. 이 절차는 이러한 광학 뉴런에서 축축물의 성장, 타겟팅 및 분기를 평가하는 동안 시신경의 특정 유전 기능을 라벨과 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 이 DNA 미세 주입 및 지방 흡입 기술은 발달 신경생물학에 있는 연구원이 그대로, 살아있는 제노푸스 laevis 올챙이에 있는 광학 축소 절기를 통제하는 세포 자율 분자 기계장치를 연구하는 것을 허용했습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development (Video) | JoVE

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

연구

발생학

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq (Video) | JoVE

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients (Video) | JoVE

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney (Video) | JoVE

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis (Video) | JoVE

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos (Video) | JoVE

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish (Video) | JoVE

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis (Video) | JoVE

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor ÃƒÅ¸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Exploring Retinal Regeneration Mechanisms in the Xenopus Frog (Video) | JoVE

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...