Name: microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles at JoVE.com

Agradecemos ao touro University California College da Medicina Osteopática por apoiar a nossa pesquisa. Reconhecemos os alunos anteriores no laboratório (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) que ajudaram a implementar esta técnica de microinjeção em nosso laboratório. Estamos gratos ao Dr. Christine Holt, em cujo laboratório esta microinjeção de DNA/técnica de lipofection em embriões Xenopus foi desenvolvida pela primeira vez.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade touro Califórnia (protocolo n º TUCA003TE01X).
1. obtenção de embriões X. laevis
<ol><li>Obtenha embriões de X. laevis pelo acoplamento natural dos pares de râs adultas masculinas e fêmeas aprontado com a gonadotropina coriónica humana (HCG), pela fertilização in vitro dos ovos derramados das râs adultas fêmeas APRONTADO com HCG, ou re...

<ol>
	<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li><li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo:+dynamics+and+modulation+by+BDNF.">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li><li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+axons+with+and+without+their+somata,+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos:+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo.">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li><li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system:+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations.">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li><li>Elul, T. 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I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development.">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li><li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency.">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li><li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms.">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li><li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2&#948;+in+developing+retina:+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing.">Ectopic expression of transcription factor AP-2&#948; in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo.">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li><li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation.">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li><li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System.">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).</li><li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons.">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li></ol>

Neste artigo, Nós demonstramos como expressar construções exógenas do ADN no único ou em números pequenos de neurônios óticos e como a imagem GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada em girinos intactos, vivos da râ X . a laevis. Também explicamos como reconstruir e quantificar a morfologia da GFP expressando mandris axonais ópticos a partir de imagens capturadas in vivo. Para expressar os plasmídios exógenos do ADN no número pequeno de neurô...

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, axônios de neurônios pré-sinápticos navegar através de diversas regiões do cérebro para alcançar suas áreas-alvo. Quando os axônios invadem seus tecidos-alvo, eles estabelecem conexões sinápticas com neurônios-alvo pós-sinápticos. Em muitos tipos de neurônios, os axônios aumentam o número e a extensão espacial das conexões sinápticas que eles podem fazer elaborando redes de ramos terminais ou mandris1. A projeção retino-tectal de girinos da rã aquática Xenopus laevis é um poderoso modelo de vertebrados para o exame de mecanismos subjacentes à arborização do AXON terminal e à conectividade sináptica2,3,4 . O GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada pode ser observado diretamente em girinos intactos, vivos de Xenopus 5,6,7,8. Para expressar a GFP isoladamente ou em conjunto com versões completas ou truncadas de genes em pequeno número de neurônios ópticos, utilizamos uma técnica envolvendo microinjeção/lipofection de DNA em oculares de embriões de um dia de idade Xenopus 9, a técnica 10. this foi desenvolvida originalmente para estudar mecanismos do pathfinding ótico do AXON em Tadpoles novos de Xenopus , e tem sido aplicada desde que nós e outro para determinar os mecanismos moleculars pilha-autônomos que subjacentes o AXON ótico arborização em Xenopus girinos5,6,7,8,9,10.
Técnicas alternativas para expressar genes exógenos em um pequeno número de neurônios ópticos foram desenvolvidas em outras espécies-modelo, bem como em X. laevis. No entanto, cada uma dessas abordagens apresenta desafios e limitações quando comparada à microinjeção de DNA/reagente de lipofection em olhos de embriões Xenopus . Em camundongos, a transgênese pode ser usada para expressar genes em um pequeno número de neurônios ópticos, mas a geração de camundongos transgênicos é dispendiosa e os camundongos transgênicos e demorados frequentemente apresentam efeitos colaterais indesejáveis11. O zebrafish transgenic que expressa genes exógenos em neurônios óticos pode igualmente ser criado injetando plasmídeos em embriões adiantados12da fase da segmentação. No entanto, este processo requer a clonagem de um promotor específico para expressar genes em um padrão de mosaico em neurônios ópticos em larvas de zebrafish12. A frequência de expressão de DNA exógeno em neurônios ópticos em zebrafish transgênico também é um pouco menor (< 30%) comparado aos girinos Xenopus que foram microinjetados com reagente de DNA/Liposomal (30 − 60%)12. No ovo o electroporation tem sido usado igualmente para expressar genes no pequeno número de neurônios óticos nos pintainhos13. Entretanto, este procedimento não caracterizou inteiramente os mecanismos que estabelecem projeções óticas porque o arborização ótico do AXON não pode ser imaged em embriões intactos, vivos do pintainho. Finalmente, vários laboratórios usaram eletroporação para transfecção genes em pequeno número de neurônios ópticos em Xenopus girinos14,15. Ainda, o electroporation exige a optimização dos equipamentos e dos protocolos (stimulator, elétrodos, padrões espaciais e temporais de pulsos da onda) Além daquele usado para o microinjection do reagente do ADN/lipofection em ocular de embriões de Xenopus .
Nós e outros usamos previamente a técnica da microinjeção/lipofection do ADN em eyebuds de embriões do Xenopus para determinar os mecanismos autônomos da sinalização da pilha que estabelecem o arborização ótico5,6 do AXON 7 anos de , 8. inicialmenteutilizamos esta abordagem para dissecar as funções da proteína do adaptador de caderina e WNT β-catenina na arborização axonal óptica em Xenopus girinos5,6. Em um estudo, nós mostramos que a ligação β-catenina à α-catenina e ao PDZ é necessária, respectivamente, para iniciar e moldar os mandris axonais ópticos in vivo5. Em um segundo relato, demonstramos que os domínios de ligação β-catenina para α-catenina e GSK-3β modulam de forma oposta os padrões de projeção dos mandris axonais ópticos ventrais6. Mais recentemente, identificamos papéis para o fator WNT, polipose adenomatosa coli (APC), na regulação das características morfológicas de mandris axonais ópticos em Xenopus girinos7. Ao coexpressar o N-terminal e os domínios centrais da APC que modulam a estabilidade da β-catenina e a organização dos microtúnios em conjunto com a GFP em neurônios ópticos individuais, determinamos papéis compartilhados e distintos para esses domínios de interação APC no número de filiais, comprimento e ângulo em mandris axonais ópticos in vivo7. Outro laboratório utilizou a técnica de microinjeção/lipofecção para determinar papéis autônomos de células para sinalização pelo receptor BDNF, TrkB, em mandris axonais ópticos em Xenopus girinos8. Este grupo mostrou que a expressão de um TrkB dominante-negativo perturbou a ramificação e a maturação sináptica em mandris óticos individuais do AXON in vivo8. Globalmente, a técnica de lipofecção no Xenopus já iluminou os papéis específicos de diferentes genes na ramificação do axão óptico no ambiente nativo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3.5&#34; Micropipettes</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203 - G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-manager software (Version )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td>CFW-1312 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td>
			<td>AtoZ Vet Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11202375001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td>
			<td>GIMP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Version 1.46r)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF 34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator with universal adaptor and support base</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-025-SB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3-000-024-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized z-stage</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MFC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpoint (Version 15.31)</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus laevis embryos</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>LM00490</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of dna into eyebuds in xenopus laevis embryos and imaging of gfp expressing optic axonal arbors in intact, living xenopus tadpoles

A projeção Visual preliminar dos girinos da rã aquática Xenopus laevis sere como um sistema modelo excelente para estudar os mecanismos que regulam o desenvolvimento da conectividade neuronal. Durante o estabelecimento da projeção retino-tectal, os axônios óticos estendem do olho e navegam através das regiões distintas do cérebro para alcangar seu tecido do alvo, o Tectum ótico. Uma vez que os axônios óticos entram no Tectum, elaboram os mandris terminais que funcionam para aumentar o número de conexões sináptica que podem fazer com os interneurônios do alvo no Tectum. Aqui, nós descrevemos um método para expressar o ADN que codifica a proteína fluorescente verde (GFP), e o ganho-e construções do gene da perda--função, em neurônios óticos (pilhas retinal do gânglio) em embriões de Xenopus . Nós explicamos como microinjeção um reagente combinado do ADN/lipofection nos ocular de uns embriões velhos do dia tais que os genes exógenos são expressos no único ou em números pequenos de neurônios óticos. Marcando genes com GFP ou coinjetando com um plasmídeo de GFP, os mandris axonal terminais de neurônios óticos individuais com sinalização molecular alterada podem ser imaged diretamente nos cérebros de girinos intactos, vivos de Xenopus diversos dias mais tarde, e sua morfologia pode ser quantificada. Este protocolo permite a determinação de mecanismos moleculares Cell-Autonomous que fundamentam o desenvolvimento do arborização ótico do AXON in vivo.

O protocolo descrito neste artigo rende uma taxa do sucesso de 30 − 60% de embriões injetados de Xenopus que expressam GFP (sozinho ou junto com uns construtores adicionais do ADN) em um a dez mandris axonal óticos. Na Figura 3, mostramos imagens confocais representativas de GFP expressando controle e mandris axonais ópticos mutantes em girinos Xenopus intactos do nosso estudo publicado recentemente7. Para este estudo, nós clonamos dois mutante...

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Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles (Video) | JoVE

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Neste vídeo, demonstramos como expressar construções de DNA exógeno em neurônios ópticos e como imaginar arbores axonais ópticas expressivas individuais em girinos xenopus laevis intactos e vivos. Trata-se de um procedimento simples e barato para transgênese transitória específica de células que permite a determinação da função genética autônoma celular em arbores axonais ópticas individuais, desenvolvendo-se em um sistema modelo vertebrado vivo. Demonstrando o procedimento, serei eu, Sophia Dao, Assistente de Pesquisa, e a Dra.Para começar, corte suavemente a ponta de uma pipeta micro capilar de vidro puxada com fórceps finos. Enchimento de vidro a pipeta micro capilar de vidro com óleo mineral usando um MICROFIL de tal forma que uma pequena gota de óleo mineral aparece na ponta cortada da micro pipeta. Encha a pipeta micro capilar de vidro no meio do caminho com óleo mineral.Em um injetor, ejete o êmbolo no meio do caminho e carregue a pipeta micro capilar de vidro puxada no suporte de injeção. Em seguida, estenda o êmbolo até a extensão máxima para confirmar que a pipeta micro capilar está fortemente presa ao injetor e não se move com a extensão do êmbolo. Transfira uma gota de três microliter da mistura DNA/DOTAP em uma folha quadrada de papel parafina de uma polegada.Sob um microscópio de dissecação estéreo, mova a ponta da pipeta micro capilar de vidro para a gota de DNA/DOTAP. Use a opção de preenchimento no aparelho de injeção, suga lentamente a gota de DNA/DOTAP na pipeta micro capilar de vidro. A fronteira entre o óleo mineral e a solução DNA/DOTAP é visível na pipeta micro capilar de vidro devido à ligeira opacidade da solução DNA/DOTAP.Se necessário, pare de encher a pipeta micro capilar periodicamente para permitir que a pressão na pipeta micro capilar de vidro se recalibrar. Primeiro, em uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 0,1X MMR, manualmente desvitellinize 10 estágio 20 a 24 embriões xenopus com fórceps finos. Segure o envelope vitelline na cintura para evitar ferir os embriões.Com fórceps tanto na mão esquerda quanto na direita do experimentador, estoure a bolha do envelope vitelino e solte o embrião do envelope vitelino. Tome cuidado para não ferir os embriões ao remover o envelope vitelline. Em seguida, use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta de corte para transferir de cinco a 10 estágio desvitélite 22 a 24 embriões para uma placa de Petri de 10 mililitros cheia de 1X MMR.Sob um microscópio estéreo, segure um dos embriões desvitellinizados na placa de Petri com fórceps e organize o embrião para que seu polo anterior seja apontado para cima no campo de visão. Em seguida, oriente o embrião para que ele esteja deitado lateralmente e um de seus botões oculares da esquerda para a direita está voltado para cima. Segure o embrião com as fórceps na mão nondominante do experimentador e com a mão dominante do experimentador, introduza a ponta da micro pipeta de vidro do lado ventral ou dorsal logo abaixo da epiderme no botão do olho.Injete entre 70 a 210 nanoliters da solução DNA/DOTAP. Em seguida, gire o embrião e realize a mesma micro injeção no outro olho no lado contralateral do embrião. Injete ambos os botões oculares de seis a 10 embriões em cada experimento.Após a micro injeção, armazene embriões em uma placa de Petri com 1X MMR por aproximadamente 30 minutos para facilitar a cicatrização da ferida. Após 30 minutos, transfira os embriões injetados com uma pipeta de transferência plástica para uma solução mmr de 0,1X com fenilthiocarbamida de agente de branqueamento de 0,001% para reduzir a pigmentação. Cubra a placa de Petri com uma tampa para cultivar os embriões por aproximadamente cinco dias até que os embriões tenham se desenvolvido em girinos nos estágios 46 a 47.Este protocolo produz uma taxa de sucesso de 30 a 60% dos embriões xenopus injetados expressando GFP em um a 10 arbores axonais ópticos. Imagens confocais representativas da GFP mostram o controle expresso e as arbores axonais ópticas mutantes nos girinos Xenopus intactos. Dois mutantes de domínio de APC, APCNTERM e APBbeta-cat foram clonados em plasmídeos pCS2.Imagens da série Z do controle GFP e arbores axonal mutantes APC foram reconstruídas. Parcelas de número de ramos, comprimento total do ramo arbor e comprimento médio do ramo confirmam diferenças observadas entre controle e mutante APC expressando arbors axonais. Gráficos de dispersão adicionais de número de ramos versus comprimento médio do ramo com linhas de regressão mostram correlação inversa entre esses parâmetros e arbores axonais ópticas expressando domínios APC.A ponta da pipeta micro capilar deve ser corretamente inserida superficialmente no broto ocular para que a epiderme cinza sobrevoando o broto do olho incha durante cada micro injeção. Este procedimento pode ser usado tanto para rotular e alterar a função genética específica em neurônios ópticos, enquanto avalia o crescimento, direcionamento e ramificação de axônios a partir desses neurônios ópticos. Esta microinjeção de DNA e técnica de lipofecção permitiram aos pesquisadores da neurobiologia do desenvolvimento estudar mecanismos moleculares autônomos celulares que regulam a arborização do axônio óptico em girinos xenopus laevis intactos e vivos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development (Video) | JoVE

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Biologia do Desenvolvimento

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq (Video) | JoVE

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients (Video) | JoVE

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney (Video) | JoVE

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis (Video) | JoVE

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos (Video) | JoVE

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish (Video) | JoVE

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis (Video) | JoVE

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Analysis of Transforming Growth Factor ÃƒÅ¸ Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Exploring Retinal Regeneration Mechanisms in the Xenopus Frog (Video) | JoVE

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...