Optisk billeddannelse af isolerede murine ventrikulære Myocytter

Hjertesvigt er den hyppigste dødsårsag for både mænd og kvinder i verden. Nye beviser tyder på ændring i hjerte-og systemisk stofskifte bidrage til patologi af hjertesvigt. Hurtigt identificere, hvilke metabolitter påvirker excitation-sammentrækning kobling er stadig en udfordring.

Den traditionelle tilgang til isolering af hjerteneocyt fra voksen mus er en tidskrævende og udfordrende proces. Den innovative metode i denne artikel gør en streng proces mere effektiv og lettere at udføre. Yderligere, ved hjælp af fluorescerende sonde, vi kan udføre mange fænotopypiske vurderinger af, hvordan kemikalier kan fremkalde hjertetoksicitet eller dysfunktion på celleniveau.

Ved at identificere, hvilke molekyler der ændrer myocytfunktionen, kan nye behandlingsforløb identificeres til behandling af hjertesvigt. Ved hjælp af transgene mus kan vi sonde forskellige gener for at afgøre, hvilke der kan forebygge og bidrage til hjertesvigt. Disse oplysninger vil være afgørende i den fremtidige helbredelse af hjertesvigt.

Demonstration af proceduren vil være Matthew Klos og en studerende Shreyas Suresh. Til at begynde med, tø den arbejdende laminin løsning på is. Ved hjælp af en P1000 pipette, aspirere 200 mikroliter af laminin og forsigtigt trække pipette spidsen langs den ene kant af den steriliserede coverslip at tillade kapillær handling at trække en minimal mængde laminin for at lette coverslip vedhæftet fil til seks-brønd plade.

Derefter udvise den resterende laminin i midten af coverslip i en cirkulær bevægelse. Spred laminin dråben over coverslip. Placer dækslæberne i en 37 grader Celsius-inkubator i mindst en time og op til 24 timer før isolationen.

For at isolere myocytter fra et forberedt hjerte i kold KHB-HB, skal prøven anbringes under et stereomikroskop. For at undgå emboli skal aortakanylen primes ved at nedsænke den i KHB-HB-opløsningen og bruge en 20 millilitersprøjt til at tvinge opløsningen igennem. Sørg for, at hjertet er nedsænket og kanylen er primet før hjerte excision.

Med en 5 scer, kanyler hjertet. Bekræft korrekt placering af kanylen ved at visualisere spidsen af kanylen ca. en millimeter over aortaindføring i hjertekammer. Start derefter strømmen af KHB-HB ved at dreje stophanen på Langendorf.

Tilslut kanylen til Langendorf for at gennemgå hjertet i fem minutter. Drej derefter stophanen for at skifte perfusionen fra KHB-HB-reservoiret til fordøjelsesbufferbeholderen. Når fordøjelsen buffer når hjertet, indstille en timer.

Perfusatet opsamls i et sterilt 100 milliliter bægerglas. Genopfyld fordøjelsesbufferbeholderen efter behov med perfusaten, indtil fordøjelsestiden er udløbet. Efter fordøjelsen, i en steril 100 milliliter bægerglas, adskille kamre i hjertet med stæcener og Iris saks.

Placer hvert kammer i en separat brønd af en seks-brønd plade. Hæld fem milliliter kollagenopløsning i hver brønd. Brug straks en saks til at hakke hjertevævet i stykker på ca. en kubikmeter.

Ved hjælp af en steril overførsel pipette, forsigtigt triturere hakket hjertevæv med fordøjelsen buffer. Når vævsstykkerne bliver hvide og fjerklædte, skal pladen være under et omvendt mikroskop for at undersøge cellerne. Hvis antallet af levedygtige celler er større end 80% fortsætte med at belaste cellerne i en 50 milliliter konisk rør ved hjælp af en 100 mikron celle si.

Hvis antallet af levedygtige celler er mindre end 80%check den tid, det tog at kanyler. Hvis cannulation tid er over fem minutter, så prøv et andet hjerte. Hvis ikke, assay nye kollagenase slots gennem kollagenase prøvetagning program.

Dernæst pellet cellerne ved centrifugering ved 215 gange g i to minutter. Pellet skal være kompakt og ikke løs. Hvis pellet er løs, præparatet indeholder mange døde celler.

I en vævskulturhætte opsuspenrede den kompakte pellet i 10 milliliter stopbuffer. Pellet cellerne igen ved centrifugering ved 215 gange g i to minutter. Resuspend cellerne i fem milliliter plating buffer.

Udfør et celletal på en cyto tæller og juster mængden af plating buffer for at nå en endelig myocyt koncentration på to gange 10 til de fire celler pr. milliliter. Fjern nu de lamininbelagte dækslip fra inkubatoren. Aspirate laminin dråbe, hvis til stede.

Plade 200 mikroliter af myocyt suspension på hver coverslip. Placer coverslips i en 37 grader Celsius inkubator med 21% ilt og 5% kuldioxid i to timer for at tillade fastgørelse. Efter to timer, tage ud coverslips og aspirere de ikke-tilknyttede celler.

Tilføj to milliliter kultur medier og kultur i kuvøsen ved 37 grader Celsius i op til fire dage. Først skal du fjerne komponent A og komponent B fra membranpotentialesættet. I et konisk rør med 15 milliliter kombineres 50 mikroliter af komponent B og fem mikroliter af komponent A for at danne en spændingsfarveblanding.

Vortex at blande. Der tilsættes 10 milliliter platinmedier til det koniske 15 milliliterrør, der indeholder spændingsfareblandingen, så den danner membranpotentialeblandingen. Igen, vortex at blande.

Fjern derefter en seks-brønd plade af myocytter fra inkubatoren. Aspirere medierne. Tilsæt 800 mikroliter af membranen potentielle farvestof blandingen til hver brønd.

Dæk pladen med folie og lad pladen ved stuetemperatur i 15 minutter. Derefter aspirere farvestofmedieblandingen fra hver brønd og tilsæt en milliliter modificeret Tyrods opløsning til hver brønd. Dæk med folie.

Tænd for udstyret i den rækkefølge, mikroskop, bue lampe, HyperSwitch, fluorescens interface system, MyoCam strømforsyning, felt stimulator, og computer. Sørg for, at excitationsemissionsfiltersættene passer til billedfarvestoffet. For eksempel er fura-2 begejstret på 340 nanometer og 380 nanometer af lys.

Det udsender ved 510 nanometer af lys. Fluo-4 og spændingsmembranfarvestoffet er ophidset ved 485 nanometer af lys og udsender ved 520 nanometer af lys. Prime optagesystemet ved at tænde for vakuum, fuldt åbne slangeklemmen, og forsigtigt kaste hver 60 milliliter sprøjte med Tyrode opløsning i manifolden.

Til calciumoptagelser skal du bruge standardtyroldes opløsning. Til spændingsoptagelser skal du bruge modificeret Tyrodes løsning. Tænd for i linje varmelegem.00.

Opretholde temperaturen, så perfusat i kammeret er på 36 plus eller minus en grad Celsius i mindst 15 minutter. Åbn derefter anskaffelsessoftwaren. Sørg for, at parametrene er indstillet til det korrekte billedfarvestof.

Sluk for stimulatoren. I mørke skal du fjerne folien fra den seks-brønds plade og placere en coverslip i pacing kammer. Placer pladen under et mikroskop og fokuser på myocytterne ved hjælp af 10X-målet.

Når du er i fokus, start pacing ved feltet stimulerende på en hertz og 0,2 volt. Gradvist øge spændingen, indtil en en-til-en pacing er opnået. Forøg derefter spændingen indtil 1,5 gange tærsklen er nået.

Skift fra 10X-målet til 40X-målet. Fokuser på en celle, der følger en-til-en-pacing. Juster plastnuancer, så der kun er én celle i synsfeltet.

Brug softwaren, placere området af interesse boks på veldefinerede sarcomeres. Start anskaffelsessoftwaren for at starte excitationslyset. Ved hjælp af filtrene for neutral tæthed skal intensitetsindstillingen justeres i overensstemmelse hermed for at opnå et passende signal-støj-forhold.

Her vises de repræsentative kalk- og sarkomereforkortende spor, der er registreret fra C57BL/6 museneumokocytter ved hjælp af fura-2. En kvantificering af ensemblegennemsnitsdata fra C57BL/6 mus og deres transgene kuldst mates viser ingen forskel mellem grupperne bortset fra afslapningstiden ved 10 hertz pacing. Spændingen sporing registreres fra en C57BL/6 mus myocyte tempo på 10 hertz blev post behandlet for at opnå et brugbart signal.

Ensemblet gennemsnitlige action potentiale efter en lav pass Butterworth eller en Savitzky-Golay digitalt filter blev anvendt viser subtile forskelle i formen af handlingen potentialer. Sporene registreres fra rotte myocytter tempo på en hertz viser ud over spændingen signal er lavere end calcium signal, sammentrækning kinetik er forskellige så godt. Dette skyldes, calcium farvestoffer buffer calcium, mens spænding farvestoffer ikke.

Som med calcium forbigående, myocytter demonstreret pacing afhængige ændringer i deres optiske handling potentielle varighed. Narkotika-induceret forlængelse af aktionspotentialet blev demonstreret så godt. De sidste 11 sekunder af en 20-sekunders optagelse viste, at langvarig eksponering af myocytter til blåt lys fører til udløst aktivitet.

Når du forsøger denne procedure, det vigtigste at huske er at bruge den laveste intensitet lys muligt, så du ikke skader myocytter. Myocyte isoleret ved hjælp af vores tilgang kan også bruges til immunhisistokkemi eller udføres for western blot analyse. Skønheden i denne teknik, det giver forskerne mulighed for hurtigt at vurdere, hvordan de mange forskellige molekyler og gener hjælpe excitation-sammentrækning kobling ved hjælp af et enkelt system.