Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Hartfalen is de belangrijkste doodsoorzaak voor zowel mannen als vrouwen in de wereld. Nieuw bewijs suggereert dat verandering in het hart- en systemische metabolisme bijdraagt aan de pathologie van hartfalen. Snel vaststellen welke metabolieten excitatie-samentrekkingskoppeling beïnvloeden, is nog steeds een uitdaging.

De traditionele aanpak van het isoleren van cardiale myocyte van volwassen muis is een tijdrovend en uitdagend proces. De innovatieve methode in dit artikel maakt een streng proces efficiënter en gemakkelijker uit te voeren. Verder, met behulp van fluorescerende sonde, kunnen we veel fenotypische beoordelingen uitvoeren van hoe chemische stoffen cardiale toxiciteit of disfunctie op cellulair niveau kunnen veroorzaken.

Door te bepalen welke moleculen de myocytenfunctie veranderen, kunnen nieuwe therapieën worden geïdentificeerd voor de behandeling van hartfalen. Met behulp van transgene muizen kunnen we verschillende genen onderzoeken om te bepalen welke kunnen voorkomen en bijdragen aan het hartfalen. Deze informatie zal essentieel zijn in de toekomstige genezing van hartfalen.

Het aantonen van de procedure zal Matthew Klos en een student Shreyas Suresh. Ontdooi om te beginnen de werkende laminineoplossing op ijs te ontdooien. Met behulp van een P1000 pipet, aspirate 200 microliter laminine en voorzichtig sleep de pipet tip langs een rand van de gesteriliseerde coverslip om capillaire actie te trekken uit een minuscule hoeveelheid laminine voor het vergemakkelijken van coverslip gehechtheid aan de zes-put plaat.

Dan verdrijven de resterende laminine in het midden van de coverslip in een cirkelvormige beweging. Spreid de lamininedruppel over de coverslip. Plaats de coverslips in een couveuse van 37 graden Celsius gedurende ten minste een uur en tot 24 uur voor de isolatie.

Om myocyten te isoleren van een voorbereid hart in koude KHB-HB, plaats het monster onder een stereomicroscoop. Om embolie te voorkomen, prime de aorta canule door het onder te dompelen in de KHB-HB oplossing en met behulp van een 20 milliliter spuit om de oplossing te dwingen door. Zorg ervoor dat het hart is ondergedompeld en de canule is geprimed voor het hart excisie.

Met een 5 tangen, cannulate het hart. Bevestig de juiste positionering van de canule door de punt van de canule ongeveer een millimeter boven het inbrengen van de aorta in de hartkamer te visualiseren. Start dan de stroom van KHB-HB door de stopcock op het Langendorf te draaien.

Sluit de canule aan op het Langendorf om het hart vijf minuten door te nemen. Draai vervolgens de stopcock om de perfusie van het KHB-HB reservoir naar het digestiebufferreservoir te schakelen. Zodra de spijsvertering buffer het hart bereikt, stel een timer.

Verzamel het perfusaat in een steriele bekerbeker van 100 milliliter. Vul de spijsvertering buffer reservoir indien nodig met de perfusate totdat de spijsvertering tijd is verstreken. Na de spijsvertering, in een steriele 100 milliliter bekerglas, scheiden de kamers van het hart met tangen en Iris schaar.

Plaats elke kamer in een aparte put van een zes-put plaat. Giet vijf milliliter collagenase oplossing in elke put. Gebruik onmiddellijk een schaar om het hartweefsel in stukjes van ongeveer een kubieke meter te hakken.

Met behulp van een steriele overdracht pipet, voorzichtig triturate het gehakte hartweefsel met spijsvertering buffer. Zodra de weefselbrokken wit en vederlicht worden, plaatst u de plaat onder een omgekeerde microscoop om de cellen te onderzoeken. Als het aantal levensvatbare cellen groter is dan 80%, ga dan over tot het stam van de cellen in een 50 milliliter conische buis met behulp van een 100 micron cel zeef.

Als het aantal levensvatbare cellen minder dan 80% is, controleer dan de tijd die nodig was om te cannulaten. Als de cannulation tijd is meer dan vijf minuten, probeer dan een ander hart. Zo niet, test nieuwe collagenase slots door middel van de collagenase bemonstering programma.

Vervolgens pellet de cellen door centrifugeren op 215 keer g gedurende twee minuten. De pellet moet compact zijn en niet los. Als de pellet los zit, bevat het preparaat veel dode cellen.

In een weefselkweekkap, resuspend de compacte pellet in 10 milliliter van het stoppen buffer. Pellet de cellen weer door centrifugeren op 215 keer g gedurende twee minuten. Resuspend de cellen in vijf milliliter van beplating buffer.

Voer een celtelling uit op een cytoteller en pas het volume van de beplatingsbuffer aan om een laatste myocyteconcentratie van twee keer 10 tot de vier cellen per milliliter te bereiken. Verwijder nu de met laminine gecoate covers uit de couveuse. Aspirate de laminine druppel indien aanwezig.

Plaat 200 microliters van myocyte suspensie op elke coverslip. Plaats de coverslips in een 37 graden Celsius incubator met 21% zuurstof en 5% kooldioxide gedurende twee uur om bevestiging mogelijk te maken. Na twee uur, neem de coverslips en aspirate de niet-gekoppelde cellen.

Voeg twee milliliter cultuur media en cultuur in de couveuse op 37 graden Celsius voor maximaal vier dagen. Verwijder eerst component A en component B uit de membraanpotentieelkit. Combineer in een conische buis van 15 milliliter 50 microliters van component B en vijf microliter van component A tot een mengsel van spanningsverfstof.

Vortex om te mengen. Voeg 10 milliliter beplatingsmedia toe aan de 15 milliliter conische buis met het mengsel van spanningsverfstof om het membraanpotentieelstofmengsel te vormen. Nogmaals, vortex te mengen.

Verwijder dan een zes-put plaat van myocyten uit de couveuse. De media aanzuigen. Voeg 800 microliters van het membraan potentiële kleurstof mengsel aan elke put.

Dek de plaat af met folie en laat de plaat 15 minuten op kamertemperatuur. Daarna, aspirate de kleurstof media mengsel van elke put en voeg een milliliter van gemodificeerde Tyrode's oplossing aan elke put. Dek af met folie.

Schakel de apparatuur in de volgorde van de microscoop, booglamp, HyperSwitch, fluorescentie interface systeem, MyoCam voeding, veld stimulator, en computer. Zorg ervoor dat de excitatie-emissiefiltersets geschikt zijn voor de beeldstofkleurstof. Bijvoorbeeld, fura-2 is opgewonden op 340 nanometer en 380 nanometer licht.

Het zendt uit op 510 nanometer licht. Fluo-4 en de spanning membraan kleurstof zijn opgewonden op 485 nanometer licht en uitstoten op 520 nanometer licht. Prime het opnamesysteem door het vacuüm aan te zetten, de slangklem volledig te openen en elke spuit van 60 milliliter voorzichtig met de oplossing van Tyrode in het spruitstuk te storten.

Gebruik voor calciumopnames de standaard oplossing van Tyrode. Voor spanningsopnames gebruikt u de oplossing van gewijzigde Tyrode. Zet de in lijn kachel.

Houd de temperatuur zo de perfusate in de kamer is op 36 plus of min een graad Celsius voor ten minste 15 minuten. Open vervolgens de acquisitiesoftware. Zorg ervoor dat de parameters zijn ingesteld voor de juiste beeldvormingskleurstof.

Zet de stimulator uit. In het donker, verwijder de folie van de zes-put plaat en plaats een coverslip in de pacing kamer. Plaats de plaat onder een microscoop en focus op de myocyten met behulp van de 10X doelstelling.

Eenmaal in focus, beginnen met ijsberen door het veld stimuleren op een hertz en 0,2 volt. Geleidelijk verhogen van de spanning tot een een-op-een pacing wordt verkregen. Verhoog vervolgens de spanning tot 1,5 keer de drempel is bereikt.

Schakel over van de 10X doelstelling naar de 40X doelstelling. Focus op een cel die een één-op-één-pacing volgt. Pas de plastic tinten aan, zodat er slechts één cel in het gezichtsveld is.

Met behulp van de software, plaats het gebied van de rente doos op goed gedefinieerde sarcomeres. Start de acquisitiesoftware om het excitatielicht te starten. Pas met behulp van de neutrale dichtheidsfilters de intensiteitsinstelling dienovereenkomstig aan om een adequate signaal-ruisverhouding te verkrijgen.

Hier worden de representatieve calcium- en sarcomere verkortende sporen weergegeven die zijn geregistreerd van C57BL/6 muis myocyten met behulp van fura-2. Een kwantificering van ensemblegemiddelde gegevens verkregen van C57BL/6 muizen en hun transgene nestgenoten toont geen verschil tussen de groepen, behalve voor de ontspanningstijd op 10 hertz pacing. De spanning tracering opgenomen van een C57BL/6 muis myocyte tempo op 10 hertz werd na verwerkt om een bruikbaar signaal te verkrijgen.

Het ensemble gemiddelde actie potentieel na een low pass Butterworth of een Savitzky-Golay digitale filter werd toegepast tonen subtiele verschillen in de vorm van de actie mogelijkheden. De sporen die van rat myocyten worden geregistreerd die bij één hertz worden gepaced tonen naast het voltagesignaal dat lager is dan het calciumsignaal, zijn de samentrekkingskinetiek ook verschillend. Dit komt omdat calcium kleurstoffen buffer calcium, terwijl spanning kleurstoffen niet.

Net als bij de calcium voorbijgaande, myocyten aangetoond pacing afhankelijke veranderingen in hun optische actie potentiële duur. Drug-geïnduceerde verlenging van het actiepotentieel werd ook aangetoond. De laatste 11 seconden van een opname van 20 seconden gaven aan dat langdurige blootstelling van myocyten aan blauw licht leidt tot geactiveerde activiteit.

Bij het proberen van deze procedure, het belangrijkste om te onthouden is het gebruik van de laagste intensiteit licht mogelijk, zodat u niet beschadigen de myocyten. Myocyte geïsoleerd met behulp van onze aanpak kan ook worden gebruikt voor immunohistochemie of uitgevoerd voor westerse vlek analyse. De schoonheid van deze techniek, het stelt onderzoekers in staat om snel te beoordelen hoe de verscheidenheid van moleculen en genen helpen excitatie-contractie koppeling met behulp van een enkel systeem.