अलग-थलग पड़े मुमूत्र वेंट्रिकुलर माइओसाइट्स की ऑप्टिकल इमेजिंग

दिल की विफलता दुनिया में पुरुषों और महिलाओं दोनों के लिए मौत का प्रमुख कारण है । नए सबूत हृदय और प्रणालीगत चयापचय में परिवर्तन का सुझाव दिल की विफलता की विकृति में योगदान करते हैं । तेजी से पहचान जो मेटाबोलाइट्स उत्तेजना को प्रभावित-संकुचन युग्मन अभी भी एक चुनौती है ।

वयस्क माउस से कार्डियक मायोसाइट को अलग करने का पारंपरिक दृष्टिकोण एक समय लेने वाली और चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है। इस लेख में अभिनव विधि एक कठोर प्रक्रिया को अधिक कुशल और प्रदर्शन करने में आसान बनाती है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके, हम कई फेनोटाइपिक आकलन कर सकते हैं कि रसायन सेलुलर स्तर पर हृदय विषाक्तता या शिथिलता को कैसे प्रेरित कर सकते हैं।

यह पहचान करके कि कौन से अणु मायोसाइट फ़ंक्शन को बदलते हैं, दिल की विफलता के उपचार के लिए नए चिकित्सीय की पहचान की जा सकती है। ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके, हम यह निर्धारित करने के लिए विभिन्न जीनों की जांच कर सकते हैं कि दिल की विफलता को कौन रोक सकता है और योगदान दे सकता है। यह जानकारी हार्ट फेलियर के भविष्य के इलाज में जरूरी होगी।

प्रक्रिया का प्रदर्शन मैथ्यू क्लोस और एक छात्र श्रेयस सुरेश करेंगे । शुरू करने के लिए, बर्फ पर काम कर रहे टुकड़ेिन समाधान गल। एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, लेमिनिन के 200 माइक्रोलीटर को एस्पिरेट करें और धीरे-धीरे निष्फल कवरस्लिप के एक किनारे के साथ पिपेट टिप खींचें ताकि छह-अच्छी प्लेट में कवरलिप अटैचमेंट को सुविधाजनक बनाने के लिए लेमिनिन की मामूली मात्रा को खींचने के लिए केशिका कार्रवाई की अनुमति दी जा सके।

फिर एक परिपत्र गति में कवरलिप के केंद्र में शेष लेमिनिन को निष्कासित करें। कवरलिप में लेमिनिन बूंद फैलाएं। कवरस्लिप को कम से कम एक घंटे के लिए और अलगाव से 24 घंटे पहले 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।

ठंडे केएचबी-एचबी में तैयार दिल से मायोसाइट्स को अलग करने के लिए, नमूने को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। एम्बोली को रोकने के लिए, केएचबी-एचबी समाधान में जलमग्न करके और समाधान को मजबूर करने के लिए 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके महाधमनी कैनुला को प्राइम करें। सुनिश्चित करें कि दिल जलमग्न है और कैनुला दिल उत्तेजना से पहले प्रिंड है।

5 संदंश के साथ, दिल को cannulate। वेंट्रिकल में महाधमनी प्रविष्टि के ऊपर लगभग एक मिलीमीटर कैनुला की नोक की कल्पना करके कैनुला की उचित स्थिति की पुष्टि करें। इसके बाद लैंगेंडोर्फ पर स्टॉपकॉक घुमाकर केएचबी-एचबी के प्रवाह की शुरुआत करें।

पांच मिनट के लिए दिल को छिद्रित करने के लिए कैनुला को लैंगेंडोर्फ से कनेक्ट करें। इसके बाद, केएचबी-एचबी जलाशय से पाचन बफर जलाशय में परफ्यूजन स्विच करने के लिए स्टॉपकॉक को घुमाएं। एक बार पाचन बफर दिल तक पहुंच जाए तो टाइमर सेट करें।

एक बाँझ 100 मिलीलीटर बीकर में परफ्यूसेट ले लीजिए। पाचन समय समाप्त होने तक परफ्यूज़ेट के साथ आवश्यकतानुसार पाचन बफर जलाशय को फिर से भरें। पाचन के बाद, एक बाँझ 100 मिलीलीटर बीकर में, दिल के कक्षों को संदंश और आइरिस कैंची से अलग करें।

प्रत्येक कक्ष को छह-अच्छी प्लेट के एक अलग कुएं में रखें। प्रत्येक कुएं में कोलेजनस समाधान के पांच मिलीलीटर डालो। तुरंत लगभग एक घन मीटर के हिस्से में दिल के ऊतकों कीमा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें।

बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे पाचन बफर के साथ कीमा बनाया हुआ दिल के ऊतकों को ट्रिट करें। एक बार जब ऊतक का हिस्सा सफेद और ढंका हो जाता है, तो कोशिकाओं की जांच करने के लिए प्लेट को एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। यदि व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या 80% से अधिक है तो कोशिकाओं को 100 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके 50 मिलीलीटर शंकु नली में तनाव देने के लिए आगे बढ़ें।

यदि व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या 80% से कम है तो कैनुलेट करने में लगने वाले समय की जांच करें। यदि कैनुलेशन समय पांच मिनट से अधिक है, तो एक और दिल की कोशिश करें। यदि नहीं, तो कोलेजनेज़ नमूनाकरण कार्यक्रम के माध्यम से नए कोलेजनेज़ स्लॉट परखें।

इसके बाद, दो मिनट के लिए 215 बार जी पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। गोली कॉम्पैक्ट होनी चाहिए और ढीली नहीं होनी चाहिए। यदि गोली ढीली है, तो तैयारी में कई मृत कोशिकाएं होती हैं।

एक ऊतक संस्कृति हुड में, बफर को रोकने के 10 मिलीलीटर में कॉम्पैक्ट गोली को फिर से खर्च करें। दो मिनट के लिए 215 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को फिर से गोली मारें। प्लेटिंग बफर के पांच मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।

एक साइटो काउंटर पर एक सेल गिनती प्रदर्शन और चढ़ाना बफर की मात्रा को समायोजित करने के लिए दो बार 10 के एक अंतिम मायोसाइट एकाग्रता तक पहुंचने के लिए मिलीलीटर प्रति चार कोशिकाओं के लिए । अब इनक्यूबेटर से लेमिनिन-कोटेड कवर्लिप्स निकालें। उपस्थित होने पर लैमिनिन बूंद को नीचे गिराएं।

प्रत्येक कवरस्लिप पर मायोसाइट सस्पेंशन के प्लेट 200 माइक्रोलीटर। अटैचमेंट की अनुमति देने के लिए दो घंटे के लिए 21% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कवरस्लिप रखें। दो घंटे के बाद, कवरस्लिप को बाहर निकालें और असंबद्ध कोशिकाओं को एस्पिरेट करें।

चार दिनों तक ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में संस्कृति मीडिया और संस्कृति के दो मिलीलीटर जोड़ें । सबसे पहले, झिल्ली संभावित किट से घटक ए और घटक बी को हटा दें। एक 15 मिलीलीटर शंकुदाता में, एक वोल्टेज डाई मिश्रण बनाने के लिए घटक बी के 50 माइक्रोलीटर और घटक ए के पांच माइक्रोलीटर को मिलाएं।

भंवर मिश्रण करने के लिए। झिल्ली संभावित डाई मिश्रण बनाने के लिए वोल्टेज डाई मिश्रण युक्त 15 मिलीलीटर शंकु नली में 10 मिलीलीटर प्लेटिंग मीडिया जोड़ें। फिर, भंवर मिश्रण करने के लिए।

इसके बाद इनक्यूबेटर से मायोसाइट्स की एक छह-वेल प्लेट निकालें। मीडिया को आकांक्षी । प्रत्येक अच्छी तरह से झिल्ली संभावित डाई मिश्रण के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें।

पन्नी के साथ थाली को कवर करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट छोड़ दें। उसके बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से डाई मीडिया मिश्रण को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से संशोधित टायरोड के समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें। पन्नी के साथ कवर करें।

माइक्रोस्कोप, आर्क लैंप, हाइपरस्विच, फ्लोरेसेंस इंटरफेस सिस्टम, मायोकैम पावर सप्लाई, फील्ड स्टिमुलेटर और कंप्यूटर के क्रम में उपकरण चालू करें। सुनिश्चित करें कि उत्तेजन उत्सर्जन फिल्टर सेट इमेजिंग डाई के लिए उपयुक्त हैं। उदाहरण के लिए, फ्यूरा-2 340 नैनोमीटर और 380 नैनोमीटर प्रकाश पर उत्साहित है।

यह प्रकाश के 510 नैनोमीटर पर उत्सर्जित करता है। फ्लूो-4 और वोल्टेज झिल्ली डाई प्रकाश के 485 नैनोमीटर पर उत्साहित हैं और प्रकाश के 520 नैनोमीटर पर उत्सर्जित करते हैं। वैक्यूम को चालू करके रिकॉर्डिंग सिस्टम को प्राइम करें, पूरी तरह से नली क्लैंप खोलें, और धीरे-धीरे 60 मिलीलीटर सिरिंज को कई गुना में टायरोड के समाधान के साथ जल्दी से आगे बढ़नेवाला।

कैल्शियम रिकॉर्डिंग के लिए, मानक टायरोड के समाधान का उपयोग करें। वोल्टेज रिकॉर्डिंग के लिए, संशोधित टायरोड के समाधान का उपयोग करें। इन लाइन हीटर चालू करें।

तापमान बनाए रखें तो कक्ष में परफ्यूसेट कम से कम 15 मिनट के लिए 36 प्लस या शून्य से एक डिग्री सेल्सियस पर है। इसके बाद, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। सुनिश्चित करें कि पैरामीटर सही इमेजिंग डाई के लिए निर्धारित किए गए हैं।

उत्तेजक बंद कर दें। अंधेरे में, पन्नी को छह अच्छी प्लेट से हटा दें और पेसिंग कक्ष में एक कवरलिप रखें। प्लेट को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और 10X उद्देश्य का उपयोग करके मायोसाइट्स पर ध्यान केंद्रित करें।

एक बार ध्यान में रहने के बाद, एक हर्ट्ज और 0.2 वोल्ट पर क्षेत्र उत्तेजक द्वारा पेसिंग शुरू करें। धीरे-धीरे वोल्टेज बढ़ाएं जब तक कि वन-टू-वन पेसिंग प्राप्त न हो जाए। फिर 1.5 गुना सीमा तक पहुंचने तक वोल्टेज बढ़ाएं।

10X उद्देश्य से 40X उद्देश्य पर स्विच करें। एक सेल पर ध्यान केंद्रित करें जो एक-से-एक पेसिंग का पालन कर रहा है। प्लास्टिक रंगों को समायोजित करें इसलिए केवल एक सेल देखने के क्षेत्र में है।

सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, ब्याज बॉक्स के क्षेत्र को अच्छी तरह से परिभाषित सारकोमर पर रखें। एक्सटिटेशन लाइट शुरू करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें। तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करना, पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए तीव्रता सेटिंग को तदनुसार समायोजित करें।

यहां, प्रतिनिधि कैल्शियम और सारकोमेरे छोटा C57BL/6 माउस मायोसाइट्स से फ्यूरा-2 का उपयोग कर दर्ज निशान दिखाया जाता है । C57BL/6 चूहों और उनके ट्रांसजेनिक कूड़े के साथियों से प्राप्त कलाकारों की टुकड़ी औसत डेटा का एक परिमाण 10 हर्ट्ज पेसिंग में विश्राम समय के अलावा समूहों के बीच कोई अंतर नहीं दिखाता है । 10 हर्ट्ज पर पुस्तक C57BL/6 माउस मायोसाइट से दर्ज वोल्टेज ट्रेसिंग को एक प्रसेक सिग्नल प्राप्त करने के लिए संसाधित किया गया था।

एक कम पास बटरवर्थ या एक Savitzky-Golay डिजिटल फिल्टर के बाद कलाकारों की टुकड़ी औसत कार्रवाई क्षमता के आकार में सूक्ष्म अंतर दिखाता है । एक हर्ट्ज शो में पुस्तक चूहे मायोसाइट्स से दर्ज किए गए निशान कैल्शियम सिग्नल से कम होने के अलावा, संकुचन काइनेटिक्स भी अलग हैं। इसका कारण यह है कि कैल्शियम रंगों बफर कैल्शियम जबकि वोल्टेज रंग नहीं है।

कैल्शियम क्षणिक के साथ के रूप में, myocytes उनके ऑप्टिकल कार्रवाई संभावित अवधि में निर्भर परिवर्तन पेसिंग का प्रदर्शन किया । कार्रवाई क्षमता के दवा प्रेरित दीर्घीकरण के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन किया गया था । एक 20 सेकंड की रिकॉर्डिंग के अंतिम 11 सेकंड संकेत दिया है कि नीली रोशनी के लिए मायोसाइट्स के लंबे समय तक जोखिम गतिविधि ट्रिगर करने के लिए होता है ।

इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि सबसे कम तीव्रता वाले प्रकाश का उपयोग करें ताकि आप मायोसाइट्स को नुकसान न पहुंचाएं। हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करके अलग किए गए मायोसाइट का उपयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए भी किया जा सकता है या पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए आयोजित किया जा सकता है। इस तकनीक की सुंदरता, यह शोधकर्ताओं को तेजी से आकलन करने की अनुमति देता है कि अणुओं और जीन की विविधता एक ही प्रणाली का उपयोग करके उत्तेजना-संकुचन युग्मन की मदद कैसे करती है।